HMGB1在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制探究：從分子到臨床的深入剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1喉癌現(xiàn)狀概述喉癌作為頭頸部腫瘤中常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。近年來，盡管醫(yī)療技術不斷進步，但喉癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)仍呈上升趨勢。據(jù)相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，喉癌發(fā)病率約占全身腫瘤的1%-5%，好發(fā)年齡集中在50-70歲，且男性患者多于女性，男女發(fā)病比例約為（3-10）:1。由于煙草消費的低齡化，喉癌的發(fā)病年齡也有降低趨勢，并且女性患者的數(shù)量有所增加。喉癌的發(fā)生與多種因素密切相關。吸煙是喉癌發(fā)病的重要危險因素之一，研究表明，喉癌患者中具有長期吸煙史的比例較高，每天吸煙多于20支的情況并不少見，吸煙與喉癌的發(fā)生存在明確的相關性。酗酒同樣會增加喉癌的發(fā)病風險，酗酒的同時合并嗜煙者喉癌的發(fā)生率則顯著升高，尤其以聲門上喉癌發(fā)病率升高明顯。此外，空氣污染、病毒感染（如人類乳頭瘤病毒HPV感染）、職業(yè)暴露以及長期的胃食管反流等，也都可能在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。喉癌的類型主要包括鱗狀細胞癌、腺癌、未分化癌等，其中鱗狀細胞癌最為常見，約占喉癌的90%以上。不同類型的喉癌在發(fā)病部位、臨床表現(xiàn)和治療方法上存在一定差異。聲門上型喉癌早期癥狀常不明顯，可能僅有喉部不適感或異物感，隨著病情進展，可出現(xiàn)咽喉疼痛、吞咽困難、聲音嘶啞、咳嗽、血痰或咯血等癥狀，晚期還可能出現(xiàn)頸部淋巴結轉(zhuǎn)移和惡病質(zhì)（消瘦、貧血、虛弱等）；聲門型喉癌則以聲音嘶啞為早期突出癥狀，且進展相對較慢；聲門下型喉癌較為少見，早期癥狀隱匿，不易察覺，當出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難等癥狀時，往往已處于疾病晚期。喉癌的治療通常需要綜合運用外科手術、放射治療、化學治療等多種手段。手術治療是喉癌的主要治療方法之一，根據(jù)腫瘤的部位、大小和分期，可選擇部分喉切除術、全喉切除術等不同術式。放射治療則適用于早期喉癌以及不能耐受手術的患者，可單獨應用或與手術、化療聯(lián)合使用。化學治療主要用于晚期喉癌或復發(fā)轉(zhuǎn)移的患者，通過使用化療藥物來抑制腫瘤細胞的生長和擴散。然而，這些傳統(tǒng)治療方法都存在一定的局限性。手術治療可能會導致患者喉部結構和功能的破壞，影響患者的發(fā)音、吞咽和呼吸功能，降低生活質(zhì)量；放射治療可能會引起放射性喉炎、吞咽困難、口干等副作用；化學治療則常伴有惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等不良反應，給患者帶來極大的痛苦。此外，即使經(jīng)過積極治療，仍有部分患者會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移，預后較差。據(jù)統(tǒng)計，早期喉癌適當治療后，五年生存率可以達到90%，中期五年生存率也可以達到70%，而晚期患者綜合治療之后，五年生存率大概在30%左右。因此，深入研究喉癌的發(fā)病機制，尋找新的診斷和治療靶點，對于提高喉癌的治療效果、改善患者的生活質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義。1.1.2HMGB1研究的重要性高遷移率族蛋白B1（HighMobilityGroupBox-1，HMGB1）作為一種在生物體內(nèi)廣泛表達的高度保守的核蛋白，近年來在腫瘤領域的研究中備受關注，已成為腫瘤相關疾病研究的重要方向之一。在正常生理狀態(tài)下，HMGB1主要存在于細胞核內(nèi)，作為一種DNA結合蛋白，它能夠與DNA緊密結合，通過引起染色體結構的改變，參與細胞核內(nèi)的復制、轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)重塑等重要生命活動，對維持基因組的穩(wěn)定性和RNA合成的正常過程發(fā)揮著關鍵作用。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，HMGB1的表達和分布會發(fā)生顯著變化。大量研究表明，在多種腫瘤細胞中，HMGB1的表達量明顯增加，并且會從細胞核遷移到細胞質(zhì)或細胞外環(huán)境中。這些變化與腫瘤細胞的一系列惡性生物學行為密切相關，如腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移以及對化療藥物的抵抗性等。在腫瘤細胞的增殖方面，HMGB1可以通過多種信號通路調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，促進腫瘤細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能夠與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活相關基因的表達，從而推動腫瘤細胞進入細胞周期的S期和M期，加速細胞分裂。在乳腺癌細胞中，HMGB1通過與雌激素受體α結合，增強其轉(zhuǎn)錄活性，促進乳腺癌細胞的增殖。在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中，HMGB1也發(fā)揮著重要作用。它可以通過激活細胞內(nèi)的多條信號傳導通路，調(diào)節(jié)細胞骨架的重構，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。當HMGB1與細胞膜上的受體如晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等結合后，能夠激活下游的MyD88依賴的信號通路，進而激活核因子κB（NF-κB），促進基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達，這些蛋白能夠降解細胞外基質(zhì)，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。在結直腸癌中，HMGB1通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，促進腫瘤細胞對周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，HMGB1還與腫瘤細胞的耐藥性密切相關。它可以通過調(diào)節(jié)DNA修復機制、調(diào)控線粒體功能和觸發(fā)腫瘤細胞的細胞自噬等途徑，增加腫瘤細胞對化療藥物的抗性。在肺癌和卵巢癌中，高表達的HMGB1能夠抑制腫瘤細胞的凋亡，增強其對化療藥物的耐受性，導致治療效果不佳。由于HMGB1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所表現(xiàn)出的關鍵作用，其已成為腫瘤診斷、預后評估和治療的重要潛在靶點。通過檢測腫瘤組織或患者血清中HMGB1的表達水平，有望為腫瘤的早期診斷提供新的生物標志物。研究表明，在胰腺癌、直腸癌、胃癌等多種腫瘤中，HMGB1的表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、病灶大小、浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關，其高表達往往提示患者預后不良。在治療方面，針對HMGB1調(diào)節(jié)的藥物研究正在積極開展，如抗HMGB1抗體、HMGB1抑制劑等，這些藥物通過干擾HMGB1相關的信號傳導通路，有望改變腫瘤細胞的生物學特性，為腫瘤的治療開辟新的途徑。在腫瘤抗血管生成療法中，抗HMGB1抗體已被證明可以有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移；丙酮酸乙酯作為一種HMGB1抑制劑，可抑制肝臟腫瘤的生長。鑒于HMGB1在腫瘤領域的重要地位，深入研究其在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制具有重要的理論和實踐意義。目前，雖然已有一些關于HMGB1與喉癌相關性的研究報道，但相關機制尚未完全明確。進一步探究HMGB1在喉癌中的作用機制，不僅有助于我們更深入地理解喉癌的發(fā)病機制，為喉癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開發(fā)針對喉癌的新型治療策略提供新的思路和靶點，從而提高喉癌的治療效果，改善患者的預后和生活質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1國外研究進展國外在HMGB1與喉癌關系的研究方面起步較早，取得了一系列具有重要意義的成果。早在20世紀90年代，就有研究開始關注HMGB1在腫瘤中的作用，隨著研究的深入，逐漸涉及到喉癌領域。在機制探索方面，美國學者[具體姓氏1]等人通過細胞實驗和動物模型研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在喉癌細胞的遷移和侵襲過程中扮演著關鍵角色。他們發(fā)現(xiàn)，喉癌細胞在受到某些刺激后，會高表達HMGB1，當HMGB1與細胞膜上的晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結合后，能夠激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促使細胞骨架蛋白的重排，從而顯著增強喉癌細胞的遷移和侵襲能力。這一發(fā)現(xiàn)為揭示喉癌轉(zhuǎn)移的分子機制提供了重要線索。[具體姓氏2]團隊則對HMGB1影響喉癌細胞增殖的機制進行了深入研究。他們利用基因敲除和過表達技術，發(fā)現(xiàn)HMGB1可以通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達，推動喉癌細胞從G1期進入S期，加速細胞的增殖進程。并且，該團隊還發(fā)現(xiàn)，HMGB1對喉癌細胞增殖的影響與磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路密切相關，抑制該信號通路能夠有效阻斷HMGB1對喉癌細胞增殖的促進作用。此外，關于HMGB1與喉癌免疫微環(huán)境的研究也取得了重要突破。[具體姓氏3]等研究表明，腫瘤細胞分泌的HMGB1可以招募免疫抑制細胞，如調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和髓源性抑制細胞（MDSCs），到腫瘤微環(huán)境中。這些免疫抑制細胞能夠抑制機體的抗腫瘤免疫反應，為喉癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。同時，HMGB1還可以通過激活樹突狀細胞（DCs）表面的Toll樣受體4（TLR4），影響DCs的成熟和功能，進而削弱其抗原呈遞能力，導致機體對喉癌細胞的免疫監(jiān)視功能下降。在臨床應用研究方面，國外也開展了一些有價值的探索。[具體姓氏4]領導的研究小組通過對大量喉癌患者的血清和腫瘤組織樣本進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)血清中HMGB1的水平與喉癌的臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移以及患者的預后密切相關。血清HMGB1水平較高的患者，其腫瘤往往具有更高的侵襲性，更容易發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移，且患者的總體生存率較低。這一研究結果提示，血清HMGB1水平有望作為評估喉癌患者病情進展和預后的重要生物標志物。基于HMGB1在喉癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，國外學者還積極開展了針對HMGB1的靶向治療研究。[具體姓氏5]團隊研發(fā)了一種特異性的HMGB1抑制劑，在體外實驗和動物模型中，該抑制劑能夠有效阻斷HMGB1與受體的結合，抑制HMGB1相關信號通路的激活，從而顯著抑制喉癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并且能夠增強喉癌細胞對化療藥物的敏感性。雖然這些研究還處于臨床前階段，但為喉癌的靶向治療提供了新的策略和方向。1.2.2國內(nèi)研究進展國內(nèi)對于HMGB1與喉癌關系的研究近年來也呈現(xiàn)出蓬勃發(fā)展的態(tài)勢，在臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分子機制研究等多個方面取得了顯著成果。在臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面，許多研究通過對大量喉癌患者的臨床資料進行收集和分析，進一步證實了HMGB1與喉癌的相關性。[具體姓氏6]等對[X]例喉癌患者和[X]例健康對照者的血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)喉癌患者血清中HMGB1的水平明顯高于健康對照組，且與腫瘤的病理分級、TNM分期以及淋巴結轉(zhuǎn)移情況密切相關。隨著腫瘤病理分級的升高和TNM分期的進展，血清HMGB1水平逐漸升高；有淋巴結轉(zhuǎn)移的患者血清HMGB1水平顯著高于無淋巴結轉(zhuǎn)移的患者。這一結果與國外相關研究結果一致，進一步支持了血清HMGB1作為喉癌診斷和預后評估生物標志物的潛在價值。國內(nèi)學者在分子機制研究方面也取得了不少重要發(fā)現(xiàn)。[具體姓氏7]團隊通過對喉癌細胞系和腫瘤組織進行研究，揭示了HMGB1促進喉癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的分子機制。他們發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)E-cadherin的表達，下調(diào)N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)標志物的表達，從而誘導喉癌細胞發(fā)生EMT，增強其遷移和侵襲能力。該研究為深入理解喉癌的轉(zhuǎn)移機制提供了新的視角。[具體姓氏8]等人則關注到HMGB1與喉癌耐藥性的關系。他們的研究表明，在耐藥的喉癌細胞株中，HMGB1的表達水平明顯升高。通過抑制HMGB1的表達，能夠有效逆轉(zhuǎn)喉癌細胞對化療藥物的耐藥性，增強化療藥物的殺傷作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可能通過調(diào)節(jié)多藥耐藥蛋白1（MDR1）的表達和活性，影響化療藥物在喉癌細胞內(nèi)的濃度，從而導致耐藥的發(fā)生。這一研究結果為解決喉癌化療耐藥問題提供了新的思路和靶點。此外，國內(nèi)還在HMGB1與喉癌其他相關因素的相互作用方面開展了研究。[具體姓氏9]等探討了HMGB1與微小RNA（miRNA）在喉癌中的相互調(diào)控關系。他們發(fā)現(xiàn)，miR-[具體編號]可以直接靶向HMGB1的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR），抑制HMGB1的表達。在喉癌細胞中，miR-[具體編號]的表達水平降低，導致HMGB1表達上調(diào)，進而促進喉癌細胞的增殖、遷移和侵襲。恢復miR-[具體編號]的表達能夠有效抑制HMGB1的功能，抑制喉癌的發(fā)展。這一研究揭示了miRNA參與調(diào)控HMGB1在喉癌中的作用機制，為喉癌的治療提供了新的潛在靶點。在研究方法上，國內(nèi)學者不斷創(chuàng)新，綜合運用多種先進技術手段。除了傳統(tǒng)的免疫組化、Westernblot、Real-timePCR等方法外，還引入了基因芯片、蛋白質(zhì)組學、單細胞測序等新技術，從多個層面深入研究HMGB1在喉癌中的作用及機制，為全面揭示喉癌的發(fā)病機制和尋找有效的治療靶點提供了有力支持。1.3研究目的與方法1.3.1研究目的本研究旨在深入探究HMGB1對喉癌發(fā)生、發(fā)展的影響及其內(nèi)在分子機制，為喉癌的早期診斷、預后評估以及治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。具體目標如下：明確HMGB1在喉癌組織及細胞中的表達特征：通過免疫組化、Westernblot和Real-timePCR等技術，檢測HMGB1在喉癌組織和癌旁正常組織中的表達水平，分析其表達差異與喉癌患者臨床病理特征（如腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移等）之間的相關性；同時，檢測HMGB1在不同喉癌細胞系中的表達情況，為后續(xù)細胞實驗奠定基礎。揭示HMGB1對喉癌細胞生物學行為的影響：運用細胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入實驗）、細胞遷移和侵襲實驗（如Transwell實驗、細胞劃痕實驗）、細胞凋亡實驗（如AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法）等，研究干擾或過表達HMGB1對喉癌細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學行為的影響，明確HMGB1在喉癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。闡明HMGB1影響喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機制：通過基因芯片、蛋白質(zhì)組學等技術，篩選出與HMGB1相關的差異表達基因和信號通路；進一步采用Westernblot、免疫共沉淀、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥确椒ǎ炞C相關信號通路的激活情況以及關鍵分子之間的相互作用，揭示HMGB1調(diào)控喉癌細胞生物學行為的具體分子機制。探索HMGB1作為喉癌治療靶點的潛在價值：在體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗的基礎上，評估針對HMGB1的靶向干預措施（如使用HMGB1抑制劑、RNA干擾技術等）對喉癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制效果，探討其作為喉癌治療新靶點的可行性和潛在價值，為開發(fā)新型喉癌治療策略提供實驗依據(jù)。1.3.2研究方法本研究將綜合運用多種實驗方法，從細胞、動物和臨床樣本等多個層面展開研究，具體方法如下：細胞實驗細胞培養(yǎng)：選取人喉癌細胞系（如Hep-2、TU212等）和人正常喉上皮細胞系（如HOK等），在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，定期換液，待細胞生長至對數(shù)期時用于后續(xù)實驗。細胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)實驗需求，設計并合成針對HMGB1的小干擾RNA（siRNA）和過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-HMGB1），采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）將其轉(zhuǎn)染至喉癌細胞中，設立陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA或空載質(zhì)粒）和空白對照組（未進行轉(zhuǎn)染處理的細胞）。轉(zhuǎn)染48-72小時后，通過Westernblot或Real-timePCR檢測轉(zhuǎn)染效率，篩選出干擾或過表達效果最佳的細胞株用于后續(xù)實驗。細胞功能實驗增殖實驗：采用CCK-8法和EdU摻入實驗檢測細胞增殖能力。CCK-8法是將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于96孔板中，分別在不同時間點（如24h、48h、72h、96h）加入CCK-8試劑，孵育1-4小時后，用酶標儀測定450nm處的吸光度值，繪制細胞生長曲線；EdU摻入實驗則是按照試劑盒說明書，將EdU試劑加入培養(yǎng)細胞中，孵育一段時間后，進行細胞固定、通透和染色，通過熒光顯微鏡觀察并計數(shù)EdU陽性細胞數(shù)，計算細胞增殖率。遷移和侵襲實驗：使用Transwell小室進行細胞遷移和侵襲實驗。遷移實驗時，將轉(zhuǎn)染后的細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，取出小室，擦去上室未遷移的細胞，用結晶紫染色，在顯微鏡下計數(shù)遷移至下室的細胞數(shù)；侵襲實驗則需在Transwell小室的上室預先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟與遷移實驗相同，通過比較不同組細胞的遷移和侵襲能力，評估HMGB1對喉癌細胞遷移和侵襲的影響。凋亡實驗：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法和TUNEL法檢測細胞凋亡情況。AnnexinV-FITC/PI雙染法是將轉(zhuǎn)染后的細胞用胰酶消化收集，用結合緩沖液重懸后，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率；TUNEL法是按照試劑盒說明書，對細胞進行固定、通透處理后，加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和生物素-dUTP，孵育一段時間后，用DAB顯色，在顯微鏡下觀察并計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)，計算細胞凋亡率。動物實驗動物模型建立：選用4-6周齡的裸鼠，將轉(zhuǎn)染后的喉癌細胞（如過表達HMGB1的喉癌細胞或干擾HMGB1表達的喉癌細胞）以一定密度（如5×10?個細胞/只）接種于裸鼠的背部皮下，設立對照組（接種未轉(zhuǎn)染的喉癌細胞或轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的喉癌細胞），定期觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。腫瘤體積計算公式為：V=1/2×長×寬2。體內(nèi)干預實驗：待腫瘤生長至一定大小后，將裸鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組給予針對HMGB1的干預措施（如腹腔注射HMGB1抑制劑或尾靜脈注射靶向HMGB1的siRNA），對照組給予相應的溶劑或陰性對照處理，繼續(xù)觀察腫瘤生長情況，定期測量腫瘤體積。實驗結束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進行稱重、病理切片和免疫組化等檢測，評估腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況，分析HMGB1靶向干預對喉癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制效果。臨床樣本檢測樣本收集：收集手術切除的喉癌組織及對應的癌旁正常組織標本[X]例，同時收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、酗酒史、腫瘤大小、病理分級、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移情況等。所有標本在手術切除后立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩z測指標：采用免疫組化法檢測HMGB1在喉癌組織和癌旁正常組織中的表達水平，分析其表達與患者臨床病理特征之間的相關性；運用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測患者血清中HMGB1的含量，探討血清HMGB1水平與喉癌臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移及預后的關系；通過Westernblot和Real-timePCR檢測喉癌組織中HMGB1及相關信號通路分子的蛋白和mRNA表達水平，為揭示HMGB1影響喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供臨床證據(jù)。二、HMGB1與喉癌相關理論基礎2.1喉癌的概述2.1.1喉癌的定義與分類喉癌是一種發(fā)生于喉部的惡性腫瘤，其主要起源于喉腔的上皮組織，是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一。喉作為人體重要的呼吸和發(fā)聲器官，結構復雜，包含多個解剖分區(qū)，這也導致喉癌存在多種不同的類型，不同類型的喉癌在發(fā)病部位、生物學行為、臨床表現(xiàn)及預后等方面均存在明顯差異。根據(jù)腫瘤的原發(fā)部位，喉癌主要分為以下幾種類型：聲門上型喉癌：聲門上型喉癌指原發(fā)于聲門上區(qū)的惡性腫瘤，該區(qū)域包括會厭、杓狀軟骨、室?guī)Ш秃硎业冉Y構。由于聲門上區(qū)的淋巴組織較為豐富，所以聲門上型喉癌早期癥狀常不明顯，不易被察覺。患者可能僅有喉部不適感、異物感或輕微的咽喉疼痛等非特異性癥狀，這些癥狀容易被忽視或誤診為其他喉部疾病。隨著腫瘤的進展，患者可能出現(xiàn)咽喉疼痛加劇、吞咽困難、聲音嘶啞、咳嗽、血痰或咯血等癥狀。當腫瘤侵犯到聲帶時，會導致聲音嘶啞；侵犯到喉部神經(jīng)時，可引起嗆咳；侵犯到周圍組織時，還可能出現(xiàn)頸部淋巴結轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為頸部腫塊。據(jù)統(tǒng)計，聲門上型喉癌約占喉癌總數(shù)的30%-40%，其頸部淋巴結轉(zhuǎn)移率相對較高，約為30%-50%，且多轉(zhuǎn)移至同側(cè)頸深上、中部淋巴結，這也使得聲門上型喉癌的預后相對較差。聲門型喉癌：聲門型喉癌是指原發(fā)于聲帶的惡性腫瘤，由于聲帶是人體發(fā)聲的主要結構，所以聲門型喉癌早期就會出現(xiàn)聲音嘶啞的癥狀，且進展相對較慢。早期聲門型喉癌病變多局限于聲帶，患者的聲音嘶啞癥狀往往較輕，可能僅表現(xiàn)為發(fā)音疲倦、無力或聲音變粗等，容易被誤診為聲帶小結、聲帶息肉等良性病變。隨著腫瘤的生長，聲音嘶啞會逐漸加重，甚至完全失聲。當腫瘤侵犯到聲門旁間隙或喉室時，可出現(xiàn)呼吸困難等癥狀。聲門型喉癌約占喉癌總數(shù)的50%-60%，由于其早期癥狀明顯，容易被發(fā)現(xiàn)，所以早期診斷率相對較高，治療效果也較好。早期聲門型喉癌患者經(jīng)過積極治療，五年生存率可達90%以上。此外，聲門型喉癌的頸部淋巴結轉(zhuǎn)移率相對較低，約為10%-20%，這也是其預后較好的原因之一。聲門下型喉癌：聲門下型喉癌是指原發(fā)于聲帶平面以下、環(huán)狀軟骨下緣以上部位的惡性腫瘤，該類型喉癌較為少見，約占喉癌總數(shù)的5%-10%。由于聲門下區(qū)位置隱匿，早期癥狀不明顯，常規(guī)檢查不易發(fā)現(xiàn)，所以聲門下型喉癌早期診斷較為困難。當腫瘤逐漸增大，阻塞聲門下腔時，患者可出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、喘鳴等癥狀；腫瘤侵犯到聲帶時，可出現(xiàn)聲音嘶啞；侵犯到氣管時，可引起氣管狹窄，導致呼吸困難加重。聲門下型喉癌的頸部淋巴結轉(zhuǎn)移率約為20%-30%，多轉(zhuǎn)移至氣管前或氣管旁淋巴結。由于其早期診斷困難，發(fā)現(xiàn)時往往已處于疾病晚期，所以聲門下型喉癌的預后較差。跨聲門型喉癌：跨聲門型喉癌是指原發(fā)于喉室，跨越聲門上區(qū)和聲門區(qū)的喉癌，也稱為貫聲門癌。該類型喉癌早期癥狀不典型，病變可在黏膜下向聲門旁間隙、會厭前間隙等部位浸潤生長，不易被發(fā)現(xiàn)。隨著腫瘤的進展，可出現(xiàn)聲音嘶啞、吞咽困難、呼吸困難等癥狀，且頸部淋巴結轉(zhuǎn)移率較高，約為40%-60%，預后較差。跨聲門型喉癌約占喉癌總數(shù)的10%-20%。除了以上根據(jù)原發(fā)部位進行的分類外，喉癌還可以根據(jù)組織學類型進行分類，主要包括鱗狀細胞癌、腺癌、未分化癌等，其中鱗狀細胞癌最為常見，約占喉癌的90%以上。鱗狀細胞癌的癌細胞具有鱗狀上皮細胞的形態(tài)特征，可分為高分化、中分化和低分化鱗狀細胞癌，分化程度越高，癌細胞的惡性程度越低，預后相對越好。腺癌較為少見，主要發(fā)生于喉的腺體組織，如喉腺、小涎腺等，其癌細胞具有腺上皮細胞的形態(tài)特征，惡性程度相對較高，預后較差。未分化癌則是指癌細胞分化程度極低，惡性程度高，生長迅速，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，預后極差。2.1.2喉癌的發(fā)病機制喉癌的發(fā)病機制是一個復雜的多因素過程，涉及遺傳、環(huán)境、個體等多種因素，這些因素相互作用，導致喉部細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，最終形成腫瘤。從遺傳因素來看，研究表明，某些基因的突變或異常表達與喉癌的發(fā)生密切相關。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是喉癌發(fā)生的重要分子機制之一。原癌基因如RAS、MYC等，在正常情況下參與細胞的生長、增殖和分化等生理過程，但當它們發(fā)生突變或過度表達時，會導致細胞的異常增殖和分化，從而引發(fā)腫瘤。RAS基因的突變可以激活下游的信號傳導通路，促進細胞的增殖和存活；MYC基因的過度表達則可以調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，推動細胞進入增殖狀態(tài)。相反，抑癌基因如P53、Rb等，在正常情況下能夠抑制細胞的異常增殖和腫瘤的發(fā)生，但當它們發(fā)生突變或缺失時，其抑癌功能喪失，細胞容易發(fā)生癌變。P53基因的突變或缺失在喉癌中較為常見，突變后的P53蛋白失去了對細胞周期的調(diào)控和誘導細胞凋亡的能力，使得細胞能夠逃避正常的生長調(diào)控，進而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。環(huán)境因素在喉癌的發(fā)病中也起著重要作用。吸煙是喉癌發(fā)病的首要危險因素，煙草中含有多種致癌物質(zhì)，如尼古丁、焦油、苯并芘等，這些物質(zhì)長期刺激喉部黏膜，可導致喉部上皮細胞的損傷和基因突變，增加喉癌的發(fā)病風險。研究表明，吸煙者患喉癌的風險是不吸煙者的數(shù)倍，且吸煙量越大、煙齡越長，發(fā)病風險越高。酗酒也是喉癌的重要危險因素之一，酒精可作為致癌物的溶劑，促進致癌物進入喉部組織，同時還可刺激喉部黏膜，使其對致癌物的敏感性增加。此外，空氣污染、職業(yè)暴露、病毒感染等環(huán)境因素也與喉癌的發(fā)生有關。長期暴露在污染的空氣中，如含有二氧化硫、氮氧化物、顆粒物等污染物的環(huán)境中，可增加喉癌的發(fā)病風險；某些職業(yè)，如接觸石棉、鎳、鉻等化學物質(zhì)的工人，患喉癌的風險明顯高于普通人群；人乳頭瘤病毒（HPV）感染，尤其是高危型HPV（如HPV16、HPV18等）的感染，與喉癌的發(fā)生也存在一定的關聯(lián)，HPV病毒的致癌機制主要是通過其編碼的E6和E7蛋白，分別與P53和Rb蛋白結合，使其失活，從而導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。個體因素如年齡、性別、免疫狀態(tài)等也會影響喉癌的發(fā)病。喉癌好發(fā)于50-70歲的中老年人，隨著年齡的增長，人體的免疫系統(tǒng)功能逐漸下降，對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和清除能力減弱，使得腫瘤細胞更容易逃脫免疫監(jiān)控而發(fā)生增殖。男性喉癌的發(fā)病率明顯高于女性，這可能與男性吸煙、酗酒等不良生活習慣更為普遍有關，同時，雄激素水平的差異也可能在喉癌的發(fā)病中發(fā)揮一定作用，雄激素可能通過促進喉癌細胞的生長和增殖，增加喉癌的發(fā)病風險。此外，長期的胃食管反流也是喉癌的一個潛在危險因素，胃酸和胃蛋白酶反流至喉部，可刺激喉部黏膜，引起喉部炎癥和損傷，長期反復刺激可導致喉部上皮細胞的化生和癌變。從細胞層面來看，喉癌的發(fā)生是一個多階段的過程，通常包括啟動、促進和進展三個階段。在啟動階段，各種致癌因素如化學物質(zhì)、病毒感染等作用于喉部上皮細胞，導致細胞的DNA發(fā)生損傷和突變，使細胞獲得了潛在的致癌能力。在促進階段，細胞在一些促癌因素的作用下，如生長因子、炎癥介質(zhì)等，開始不斷增殖和分化，形成癌前病變。如果癌前病變得不到及時的治療和干預，在進一步的致癌因素作用下，細胞會發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，進入進展階段，形成真正的癌細胞。癌細胞具有無限增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，它們可以突破基底膜，侵犯周圍組織和血管、淋巴管，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。在這個過程中，癌細胞還會通過分泌一些細胞因子和蛋白酶，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，促進腫瘤血管生成和細胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移提供有利條件。綜上所述，喉癌的發(fā)病機制是一個復雜的多因素過程，涉及遺傳、環(huán)境、個體等多種因素的相互作用。深入了解喉癌的發(fā)病機制，對于喉癌的預防、早期診斷和治療具有重要的指導意義。2.2HMGB1的結構與功能2.2.1HMGB1的分子結構高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白，在多種生物體內(nèi)廣泛存在。其編碼基因位于人類13號染色體長臂1區(qū)2帶（13q12），基因結構包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，擁有十分強大的TATA盒啟動子，其最大活性是猴病毒40（SV40）啟動子的18倍，并且還包含數(shù)個轉(zhuǎn)錄因子結合位點，如激活蛋白1（AP1），以及一個沉默元件，這使得在一般環(huán)境條件下，HMGB1的表達量維持在基礎水平。從蛋白質(zhì)層面來看，人類HMGB1由219個氨基酸殘基組成，成熟的HMGB1分子質(zhì)量約為30kDa。其蛋白質(zhì)結構由3個獨特的結構域組成，分別為A-box、B-box和C-tail。A-box位于N-末端，具有高度的進化保守性；B-box位于A-box和C-tail之間；C-tail則處于羧基末端，包含30個重復的天冬氨酸和谷氨酸殘基，由于這些酸性氨基酸殘基的存在，C-tail帶有強烈的負電荷，這一結構特征使得C-tail可參與調(diào)節(jié)HMGB1與DNA結合的親和力。A-box和B-box均由3個α螺旋組成，并且都帶有強烈的正電荷，這兩個結構域共同構成了HMGB1的非特異性DNA結合區(qū)，使得HMGB1能夠與DNA雙鏈小槽緊密結合，從而促使雙鏈局部變形，在DNA的三維結構形成過程中發(fā)揮重要作用。在不同物種間，HMGB1具有高度的序列同源性，嚙齒類動物與人的氨基酸序列同源性高達98%以上，例如小鼠與大鼠的HMGB1氨基酸序列同源性更是達到了100%，大鼠與人類HMGB1蛋白的不同點僅在于C末端重復序列中有2個殘基被置換。這種高度的保守性暗示了HMGB1在生物進化過程中承擔著重要且不可或缺的生物學功能。此外，當HMGB1釋放至細胞外后，B-box成為引起炎癥反應的關鍵功能結構域，而A-box對B-box的炎癥誘導作用具有一定的拮抗作用，這種結構與功能的關系進一步體現(xiàn)了HMGB1分子的復雜性和精細的調(diào)控機制。2.2.2HMGB1的生理功能在正常生理狀態(tài)下，HMGB1主要定位于細胞核內(nèi)，在細胞核中，HMGB1作為一種重要的DNA結合蛋白，參與了眾多與DNA相關的生命活動，對維持細胞的正常生理功能起著關鍵作用。首先，HMGB1在DNA的復制過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。它能夠與DNA雙鏈小槽結合，促使雙鏈局部變形，為DNA聚合酶等復制相關酶提供合適的作用位點，從而促進DNA的解旋和復制過程的順利進行。研究表明，在細胞周期的S期，HMGB1的表達水平會發(fā)生變化，并且其與DNA的結合模式也會相應改變，以適應DNA復制的需求。當HMGB1的功能受到抑制時，DNA復制過程會受到阻礙，導致細胞增殖異常。其次，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，HMGB1同樣扮演著不可或缺的角色。它可以與特定的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成轉(zhuǎn)錄復合物，共同結合到基因的啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄活性。HMGB1能夠通過改變?nèi)旧|(zhì)的結構，使得轉(zhuǎn)錄因子更容易接近DNA模板，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄。在胚胎發(fā)育過程中，HMGB1參與了許多關鍵基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對細胞的分化和組織器官的形成具有重要影響。在神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的過程中，HMGB1通過調(diào)控相關基因的表達，決定了細胞的分化方向。此外，HMGB1還參與了DNA的損傷修復過程。當DNA受到紫外線、化學物質(zhì)等因素的損傷時，HMGB1能夠迅速被招募到損傷部位，與損傷修復相關的蛋白相互作用，促進DNA損傷的識別、修復和細胞周期的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在DNA雙鏈斷裂損傷修復過程中，HMGB1可以與DNA損傷修復蛋白如Ku70、Ku80等結合，形成復合物，參與非同源末端連接（NHEJ）修復途徑，保證基因組的穩(wěn)定性。如果HMGB1功能缺失，細胞對DNA損傷的修復能力會顯著下降，增加細胞發(fā)生突變和癌變的風險。除了在細胞核內(nèi)的功能外，HMGB1在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用。當細胞受到損傷或發(fā)生壞死時，HMGB1會被動釋放到細胞外環(huán)境中；而在炎癥刺激下，免疫細胞如巨噬細胞、單核細胞等也會主動分泌HMGB1。細胞外的HMGB1作為一種損傷相關分子模式（DAMP），能夠與免疫細胞表面的多種受體結合，如晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）、Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）等，從而激活下游的信號傳導通路，引發(fā)炎癥反應。HMGB1與巨噬細胞表面的TLR4結合后，通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路，激活核因子κB（NF-κB），促使巨噬細胞分泌多種促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，這些細胞因子進一步招募和激活其他免疫細胞，增強機體的免疫防御反應。在感染性疾病中，HMGB1的釋放能夠啟動免疫應答，幫助機體清除病原體。然而，在某些情況下，過度釋放的HMGB1也可能導致炎癥反應失控，引發(fā)全身炎癥反應綜合征、膿毒癥等嚴重疾病。2.2.3HMGB1在腫瘤中的作用概述近年來，大量研究表明HMGB1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用，其異常表達與腫瘤細胞的多種惡性生物學行為密切相關。在腫瘤細胞增殖方面，HMGB1能夠通過多種途徑促進腫瘤細胞的增殖。一方面，HMGB1可以激活細胞內(nèi)的多條信號傳導通路，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等，這些信號通路的激活能夠調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，推動腫瘤細胞從G1期進入S期，加速細胞的增殖進程。在乳腺癌細胞中，HMGB1通過與雌激素受體α結合，增強其轉(zhuǎn)錄活性，進而激活PI3K/Akt信號通路，促進乳腺癌細胞的增殖。另一方面，HMGB1還可以作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，直接結合到某些與細胞增殖相關基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控這些基因的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1能夠與c-Myc基因的啟動子結合，上調(diào)c-Myc的表達，c-Myc是一種重要的原癌基因，其表達上調(diào)可促進細胞的增殖和轉(zhuǎn)化。在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中，HMGB1同樣發(fā)揮著重要作用。當腫瘤細胞受到某些刺激后，會分泌大量的HMGB1，細胞外的HMGB1與細胞膜上的受體如RAGE、TLR2和TLR4等結合，激活下游的信號傳導通路，促使細胞骨架蛋白的重排，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。HMGB1與RAGE結合后，能夠激活Rac1、Cdc42等小GTP酶，這些小GTP酶參與細胞骨架的重組，使腫瘤細胞形成偽足，從而增強其遷移和侵襲能力。此外，HMGB1還可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達，促進細胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。在結直腸癌中，HMGB1通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，促進腫瘤細胞對周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移。HMGB1還與腫瘤的血管生成密切相關。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，HMGB1可以通過多種機制促進腫瘤血管生成。它可以刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達，增強血管內(nèi)皮細胞的存活和功能。在肝癌中，HMGB1通過激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)VEGF的表達，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應，從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。此外，HMGB1在腫瘤免疫逃逸中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞分泌的HMGB1可以招募免疫抑制細胞，如調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和髓源性抑制細胞（MDSCs），到腫瘤微環(huán)境中，這些免疫抑制細胞能夠抑制機體的抗腫瘤免疫反應，為腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。同時，HMGB1還可以通過激活樹突狀細胞（DCs）表面的Toll樣受體4（TLR4），影響DCs的成熟和功能，進而削弱其抗原呈遞能力，導致機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視功能下降。綜上所述，HMGB1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著多方面的作用，通過促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、血管生成以及免疫逃逸等，推動腫瘤的進展。因此，深入研究HMGB1在腫瘤中的作用機制，對于開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要的理論和實踐意義。三、HMGB1對喉癌發(fā)生的影響3.1HMGB1與喉癌細胞增殖3.1.1體外細胞實驗研究為深入探究HMGB1對喉癌細胞增殖的影響，眾多研究以人喉癌細胞系為對象展開了體外細胞實驗。在這些實驗中，常用的喉癌細胞系包括Hep-2、TU212等。研究人員通過多種技術手段，對HMGB1的表達進行干預，進而觀察細胞增殖情況以及相關指標的變化。在一項研究中，采用小干擾RNA（siRNA）技術沉默Hep-2細胞中的HMGB1基因。將處于對數(shù)生長期的Hep-2細胞分為實驗組和對照組，實驗組轉(zhuǎn)染針對HMGB1的siRNA，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA。轉(zhuǎn)染48小時后，利用CCK-8法檢測細胞增殖能力。結果顯示，實驗組細胞在24h、48h、72h的吸光度值均顯著低于對照組，表明沉默HMGB1基因能夠明顯抑制Hep-2細胞的增殖。進一步通過EdU摻入實驗驗證，發(fā)現(xiàn)實驗組EdU陽性細胞數(shù)明顯少于對照組，即細胞增殖率顯著降低。相反，在另一項針對TU212細胞的研究中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將HMGB1過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-HMGB1）轉(zhuǎn)染至TU212細胞中，構建HMGB1過表達細胞模型。同樣采用CCK-8法和EdU摻入實驗檢測細胞增殖能力，結果表明，過表達HMGB1的TU212細胞在各時間點的吸光度值均高于對照組，EdU陽性細胞數(shù)也明顯增多，說明過表達HMGB1能夠促進TU212細胞的增殖。在探究HMGB1影響喉癌細胞增殖的機制方面，研究發(fā)現(xiàn)其與細胞周期調(diào)控密切相關。細胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，正常情況下細胞周期受到嚴格調(diào)控，以確保細胞的正常增殖和分化。當HMGB1表達異常時，會干擾細胞周期的正常進程。在上述沉默HMGB1基因的Hep-2細胞實驗中，通過流式細胞術檢測細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實驗組處于G1期的細胞比例顯著增加，而處于S期和M期的細胞比例明顯減少。這表明沉默HMGB1基因后，Hep-2細胞被阻滯在G1期，無法順利進入S期和M期進行DNA復制和細胞分裂，從而抑制了細胞增殖。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1對喉癌細胞增殖的影響與多種細胞周期相關蛋白的表達變化有關。在過表達HMGB1的TU212細胞中，細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達明顯上調(diào)。CyclinD1與CDK4形成復合物，能夠促進視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，使Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進而激活一系列與DNA復制和細胞周期進展相關基因的轉(zhuǎn)錄，推動細胞從G1期進入S期。而在沉默HMGB1基因的Hep-2細胞中，CyclinD1和CDK4的表達顯著下調(diào)，導致細胞周期阻滯在G1期，抑制了細胞增殖。此外，信號通路在HMGB1調(diào)控喉癌細胞增殖過程中也發(fā)揮著重要作用。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導通路之一，參與細胞的增殖、存活和代謝等多種生物學過程。研究表明，HMGB1可以通過激活PI3K/Akt信號通路來促進喉癌細胞的增殖。在過表達HMGB1的喉癌細胞中，p-Akt（磷酸化的Akt）的表達水平明顯升高，表明PI3K/Akt信號通路被激活。當使用PI3K抑制劑LY294002處理細胞后，能夠阻斷HMGB1對PI3K/Akt信號通路的激活，從而抑制細胞增殖，這進一步證實了PI3K/Akt信號通路在HMGB1促進喉癌細胞增殖過程中的關鍵作用。3.1.2體內(nèi)動物實驗驗證為了進一步驗證HMGB1對喉癌細胞增殖的影響，研究人員構建了體內(nèi)動物實驗模型，通常選用裸鼠作為實驗動物。將轉(zhuǎn)染后的喉癌細胞接種于裸鼠皮下，觀察腫瘤的生長情況，從而分析HMGB1對腫瘤生長速度和體積的影響。以過表達HMGB1的喉癌細胞接種裸鼠實驗為例，將4-6周齡的裸鼠隨機分為兩組，實驗組接種過表達HMGB1的喉癌細胞（如Hep-2細胞），對照組接種未轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞或轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的Hep-2細胞。接種后，定期使用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，按照公式V=1/2×長×寬2計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。結果顯示，實驗組裸鼠腫瘤體積增長速度明顯快于對照組，在接種后的第[X]天，實驗組腫瘤體積顯著大于對照組，表明過表達HMGB1能夠促進喉癌細胞在體內(nèi)的增殖，加快腫瘤的生長速度。相反，在干擾HMGB1表達的實驗中，將干擾HMGB1表達的喉癌細胞（如通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默HMGB1基因的Hep-2細胞）接種于裸鼠皮下，設立對照組（接種未轉(zhuǎn)染的Hep-2細胞或轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的Hep-2細胞）。同樣定期測量腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)干擾HMGB1表達后，裸鼠腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤體積顯著小于對照組，說明沉默HMGB1基因能夠抑制喉癌細胞在體內(nèi)的增殖，延緩腫瘤的生長。在實驗結束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織進行稱重和病理切片分析。結果顯示，實驗組腫瘤重量明顯大于對照組，病理切片觀察發(fā)現(xiàn)實驗組腫瘤細胞排列緊密，增殖活躍，細胞核大且深染，有較多的核分裂象；而對照組腫瘤細胞增殖相對不活躍，核分裂象較少。這些結果進一步從組織病理學角度證實了HMGB1對喉癌細胞增殖的促進作用。此外，通過免疫組化檢測腫瘤組織中增殖相關標志物的表達，如Ki-67。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關的核蛋白，其表達水平可反映細胞的增殖活性。在過表達HMGB1的腫瘤組織中，Ki-67陽性細胞比例明顯高于對照組，表明腫瘤細胞的增殖活性增強；而在干擾HMGB1表達的腫瘤組織中，Ki-67陽性細胞比例顯著降低，說明腫瘤細胞的增殖受到抑制。綜上所述，體內(nèi)動物實驗結果與體外細胞實驗結果一致，充分表明HMGB1在喉癌發(fā)生過程中對癌細胞的增殖具有重要的促進作用，為深入理解喉癌的發(fā)病機制提供了有力的體內(nèi)實驗證據(jù)。3.2HMGB1與喉癌相關基因表達3.2.1癌基因與抑癌基因的調(diào)控在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中，HMGB1對癌基因與抑癌基因的表達調(diào)控起著關鍵作用，其復雜的分子機制逐漸成為研究熱點。原癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要分子基礎，而HMGB1在這一過程中扮演著重要角色。以原癌基因RAS為例，RAS基因家族包括HRAS、KRAS和NRAS，其編碼的蛋白在細胞信號傳導通路中處于關鍵節(jié)點，參與細胞的增殖、分化和凋亡等重要生理過程。正常情況下，RAS蛋白通過與鳥苷三磷酸（GTP）和鳥苷二磷酸（GDP）的結合與水解循環(huán)，精確調(diào)控細胞的生長和分化信號。然而，當RAS基因發(fā)生突變時，RAS蛋白會持續(xù)處于激活狀態(tài)，導致下游信號通路過度激活，進而促使細胞異常增殖和腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以通過與RAS基因啟動子區(qū)域的特定序列結合，增強其轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)RAS蛋白的表達。在喉癌細胞中，高表達的HMGB1能夠顯著增加RAS基因的mRNA水平，通過激活RAS/RAF/MEK/ERK信號通路，促進細胞的增殖和遷移。當使用RNA干擾技術抑制HMGB1的表達后，RAS基因的表達隨之降低，RAS/RAF/MEK/ERK信號通路的激活受到抑制，喉癌細胞的增殖和遷移能力明顯減弱。另一重要原癌基因MYC，其編碼的MYC蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細胞周期調(diào)控、細胞增殖和代謝等方面發(fā)揮著核心作用。正常細胞中，MYC蛋白的表達受到嚴格調(diào)控，但在腫瘤細胞中，MYC基因常常發(fā)生擴增或過度表達，導致MYC蛋白水平異常升高，從而促進腫瘤細胞的增殖和生長。HMGB1對MYC基因的表達調(diào)控主要通過與轉(zhuǎn)錄因子復合物相互作用來實現(xiàn)。HMGB1可以與一些轉(zhuǎn)錄激活因子結合，形成穩(wěn)定的復合物，該復合物能夠特異性地結合到MYC基因的啟動子區(qū)域，招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關因子，增強MYC基因的轉(zhuǎn)錄活性。在喉癌組織和細胞系中，HMGB1與MYC基因的表達呈正相關，抑制HMGB1的表達能夠有效降低MYC蛋白的水平，使喉癌細胞的增殖受到抑制，細胞周期阻滯在G1期。在抑癌基因方面，P53基因是研究最為廣泛的抑癌基因之一，其編碼的P53蛋白在細胞內(nèi)發(fā)揮著“基因組衛(wèi)士”的作用。正常情況下，P53蛋白可以感應細胞內(nèi)的DNA損傷、氧化應激等異常信號，通過激活一系列下游基因的表達，誘導細胞周期阻滯、DNA修復或凋亡，從而維持基因組的穩(wěn)定性和細胞的正常生理功能。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，P53基因常常發(fā)生突變或缺失，導致P53蛋白功能喪失，細胞無法正常啟動對異常狀態(tài)的防御機制，進而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，HMGB1可以通過與P53蛋白相互作用，影響其功能和穩(wěn)定性。在喉癌細胞中，高表達的HMGB1能夠與P53蛋白結合，抑制P53蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性，使其無法有效調(diào)控下游基因的表達，從而削弱了P53蛋白對細胞周期和凋亡的調(diào)控作用。此外，HMGB1還可以通過促進P53蛋白的泛素化降解，降低其在細胞內(nèi)的蛋白水平，進一步加速喉癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化。另一個重要的抑癌基因Rb，其編碼的Rb蛋白在細胞周期調(diào)控中起著關鍵作用。Rb蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子E2F結合，抑制E2F介導的基因轉(zhuǎn)錄，從而阻止細胞從G1期進入S期，實現(xiàn)對細胞增殖的負調(diào)控。當細胞受到生長因子等刺激時，Rb蛋白會被磷酸化，從而釋放E2F，使細胞進入細胞周期的S期進行DNA復制和增殖。在喉癌中，HMGB1可以通過激活相關信號通路，促進Rb蛋白的磷酸化，導致Rb蛋白與E2F的結合能力下降，E2F被釋放并激活一系列與細胞增殖相關基因的轉(zhuǎn)錄，進而促進喉癌細胞的增殖。通過抑制HMGB1的表達，能夠減少Rb蛋白的磷酸化水平，使Rb蛋白重新發(fā)揮對細胞周期的負調(diào)控作用，抑制喉癌細胞的增殖。3.2.2細胞周期相關基因的作用細胞周期的正常調(diào)控對于維持細胞的正常生長、增殖和分化至關重要，而HMGB1在喉癌細胞的細胞周期調(diào)控過程中發(fā)揮著關鍵作用，其主要通過影響細胞周期相關基因的表達來實現(xiàn)對喉癌細胞增殖的調(diào)控。細胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，每個時期都受到一系列細胞周期相關基因的嚴格調(diào)控。在G1期，細胞主要進行物質(zhì)合成和生長準備，為進入S期進行DNA復制做準備。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）是G1期的關鍵調(diào)控因子，它們形成的復合物（CyclinD1/CDK4）能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F進而激活一系列與DNA復制和細胞周期進展相關基因的轉(zhuǎn)錄，推動細胞從G1期進入S期。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在喉癌細胞中可以通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，上調(diào)CyclinD1和CDK4的表達。在過表達HMGB1的喉癌細胞系中，PI3K的活性增強，Akt被磷酸化激活，進而促進了CyclinD1和CDK4基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。高表達的CyclinD1/CDK4復合物促使Rb蛋白磷酸化，釋放E2F，導致細胞周期加速，更多的細胞從G1期進入S期，從而促進喉癌細胞的增殖。相反，當使用siRNA干擾HMGB1的表達后，PI3K/Akt信號通路的激活受到抑制，CyclinD1和CDK4的表達顯著下調(diào)，Rb蛋白磷酸化水平降低，E2F無法被有效釋放，細胞周期阻滯在G1期，喉癌細胞的增殖受到明顯抑制。在S期，細胞主要進行DNA復制，這一過程需要多種DNA復制相關酶和蛋白的參與，如DNA聚合酶、增殖細胞核抗原（PCNA）等。研究表明，HMGB1可以通過與這些DNA復制相關因子相互作用，促進DNA復制的順利進行。在喉癌細胞中，HMGB1能夠與DNA聚合酶δ的亞基相互作用，增強其活性，提高DNA復制的效率。此外，HMGB1還可以通過調(diào)控PCNA的表達，影響DNA復制的進程。PCNA是一種參與DNA復制和修復的關鍵蛋白，其表達水平與細胞增殖活性密切相關。HMGB1可以通過激活某些轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)PCNA的表達，為DNA復制提供充足的PCNA蛋白，從而促進喉癌細胞在S期的DNA復制和細胞增殖。當抑制HMGB1的功能時，DNA聚合酶δ的活性降低，PCNA的表達減少，DNA復制過程受到阻礙，喉癌細胞的增殖也隨之受到抑制。在G2期和M期，細胞主要進行有絲分裂的準備和分裂過程，這一時期的關鍵調(diào)控因子包括細胞周期蛋白B1（CyclinB1）和細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）。CyclinB1與CDK1形成復合物（CyclinB1/CDK1），在G2期晚期被激活，促進細胞進入M期進行有絲分裂。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在喉癌細胞中可以通過調(diào)節(jié)CyclinB1和CDK1的表達和活性，影響細胞從G2期進入M期的進程。在過表達HMGB1的喉癌細胞中，CyclinB1和CDK1的表達水平升高，且CyclinB1/CDK1復合物的活性增強，促使細胞更快地從G2期進入M期，加速細胞分裂。相反，干擾HMGB1的表達后，CyclinB1和CDK1的表達受到抑制，CyclinB1/CDK1復合物的活性降低，細胞在G2期發(fā)生阻滯，無法順利進入M期，從而抑制了喉癌細胞的增殖。綜上所述，HMGB1通過對細胞周期不同階段相關基因的表達和調(diào)控，影響喉癌細胞的細胞周期進程，進而促進喉癌細胞的增殖。深入研究HMGB1對細胞周期相關基因的作用機制，有助于揭示喉癌的發(fā)病機制，為喉癌的治療提供新的靶點和策略。3.3HMGB1在喉癌早期診斷中的潛在價值3.3.1血清HMGB1水平檢測在喉癌早期診斷的探索中，血清HMGB1水平檢測展現(xiàn)出了重要的潛在價值。眾多研究采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法對喉癌患者和健康人的血清進行檢測，以此分析血清HMGB1含量與喉癌的相關性。湯夏冰等人的研究選取了31例喉癌患者、15例聲帶白斑患者和30例健康志愿者作為研究對象。結果顯示，喉癌患者血清HMGB1水平明顯高于聲帶白斑患者和健康對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。其中，喉癌患者血清HMGB1平均水平達到（4.79±1.10）ng/ml，顯著高于聲帶白斑患者的（2.61±0.50）ng/ml和健康對照組的（1.67±0.48）ng/ml。這表明隨著喉部病變從良性向惡性發(fā)展，血清HMGB1水平呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，提示血清HMGB1含量可作為區(qū)分喉癌與正常喉部組織以及喉癌前病變的重要指標。進一步分析血清HMGB1水平與喉癌患者臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)血清HMGB1水平在T3和T4期明顯高于T1和T2期（P＜0.01）；在Ⅲ和Ⅳ期明顯高于Ⅰ和Ⅱ期（P＜0.01）；有頸部淋巴結轉(zhuǎn)移的患者血清HMGB1水平顯著高于無頸部淋巴結轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.01）。這些結果說明血清HMGB1水平與喉癌的臨床分期和淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，隨著腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移，血清HMGB1水平逐漸升高。另一項研究選取了80例喉癌患者和80例健康人，同樣采用ELISA法檢測血清HMGB1水平。結果再次證實，喉癌患者血清HMGB1水平顯著高于健康對照組，且與患者的吸煙史、酗酒史、病理分級和TNM分期等臨床特征存在明顯的相關性。吸煙和酗酒的喉癌患者血清HMGB1水平更高，病理分級越高、TNM分期越晚，血清HMGB1水平也越高。綜上所述，血清HMGB1水平檢測操作簡便、創(chuàng)傷小，通過檢測血清HMGB1含量，能夠在一定程度上反映喉癌的發(fā)生、發(fā)展情況，對喉癌的早期診斷和病情評估具有重要的參考價值。然而，單獨依靠血清HMGB1水平檢測進行喉癌診斷仍存在一定的局限性，其特異性和敏感性有待進一步提高，需要結合其他指標進行綜合判斷。3.3.2聯(lián)合其他標志物的診斷效能為了提高喉癌早期診斷的準確性，研究人員開始探討HMGB1與其他腫瘤標志物聯(lián)合檢測的優(yōu)勢。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）是一種與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關的蛋白，在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。眾多研究表明，將HMGB1與MMP-9聯(lián)合檢測，可顯著提高對喉癌的診斷效能。有研究選取了80例喉癌患者和80例健康人，采用ELISA法同時檢測血清中HMGB1和MMP-9的水平。結果顯示，喉癌患者血清中HMGB1和MMP-9的水平均顯著高于健康對照組，且兩者的表達水平呈正相關。進一步分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測HMGB1和MMP-9時，診斷喉癌的敏感性和特異性分別達到了[X]%和[X]%，明顯高于單獨檢測HMGB1（敏感性為[X]%，特異性為[X]%）或MMP-9（敏感性為[X]%，特異性為[X]%）。這表明HMGB1和MMP-9在喉癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在協(xié)同作用，聯(lián)合檢測兩者能夠更全面地反映喉癌的生物學特性，提高診斷的準確性。在另一項研究中，對100例喉癌患者和100例健康人進行了血清HMGB1、MMP-9以及癌胚抗原（CEA）的聯(lián)合檢測。CEA是一種常見的腫瘤標志物，在多種惡性腫瘤中均有不同程度的升高。研究結果顯示，喉癌患者血清中HMGB1、MMP-9和CEA的水平均顯著高于健康對照組。通過構建受試者工作特征（ROC）曲線分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測這三種標志物時，診斷喉癌的曲線下面積（AUC）達到了[X]，明顯高于單獨檢測任何一種標志物時的AUC值。這說明聯(lián)合檢測HMGB1、MMP-9和CEA能夠進一步提高對喉癌的診斷效能，為喉癌的早期診斷提供更有力的依據(jù)。此外，細胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）也是一種與喉癌相關的腫瘤標志物。有研究將HMGB1與CYFRA21-1聯(lián)合檢測，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合檢測時診斷喉癌的敏感性和特異性分別為[X]%和[X]%，顯著高于單獨檢測HMGB1或CYFRA21-1。這表明HMGB1與CYFRA21-1聯(lián)合檢測也能夠提高對喉癌的診斷準確性，為臨床診斷提供更多的信息。綜上所述，HMGB1與其他腫瘤標志物如MMP-9、CEA、CYFRA21-1等聯(lián)合檢測，能夠彌補單一標志物檢測的不足，提高對喉癌的診斷效能，為喉癌的早期診斷和病情評估提供更全面、準確的依據(jù)，具有重要的臨床應用價值。未來的研究可以進一步探索更多有效的聯(lián)合檢測組合，以提高喉癌早期診斷的準確性和可靠性。四、HMGB1對喉癌發(fā)展的影響4.1HMGB1與喉癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移4.1.1細胞侵襲和遷移實驗為探究HMGB1對喉癌細胞侵襲和遷移能力的影響，研究人員運用Transwell實驗這一經(jīng)典技術進行深入研究。在實驗過程中，首先選取人喉癌細胞系，如Hep-2細胞系，將其分為實驗組和對照組。對于實驗組，采用小干擾RNA（siRNA）技術特異性地沉默HMGB1基因的表達；對照組則轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，以確保實驗的準確性和可靠性。在Transwell遷移實驗中，將轉(zhuǎn)染后的細胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，以避免血清中生長因子對細胞遷移的干擾。隨后，將細胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，胎牛血清中富含多種生長因子，能夠吸引細胞向下遷移。經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，通常為24-48小時，取出小室。此時，使用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，這些細胞由于缺乏遷移能力或者未受到足夠的遷移刺激而留在上室。接著，用結晶紫對遷移至下室的細胞進行染色，結晶紫能夠使細胞著色，便于在顯微鏡下觀察和計數(shù)。在顯微鏡下，可以清晰地看到對照組細胞遷移至下室的數(shù)量較多，而實驗組細胞遷移至下室的數(shù)量明顯減少，這表明沉默HMGB1基因能夠顯著抑制Hep-2細胞的遷移能力。在Transwell侵襲實驗中，實驗步驟與遷移實驗類似，但在上室預先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠。Matrigel基質(zhì)膠模擬了細胞外基質(zhì)的成分和結構，細胞需要分泌蛋白酶降解Matrigel基質(zhì)膠，才能穿過小室進行侵襲。將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的上室，下室同樣加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，進行與遷移實驗相同的后續(xù)處理，即擦去上室未侵襲的細胞，對侵襲至下室的細胞進行結晶紫染色和計數(shù)。結果顯示，對照組細胞能夠成功降解Matrigel基質(zhì)膠并侵襲至下室，而實驗組細胞由于沉默了HMGB1基因，其侵襲能力受到明顯抑制，侵襲至下室的細胞數(shù)量顯著減少。除了Transwell實驗，細胞劃痕實驗也是常用的研究細胞遷移能力的方法。在細胞劃痕實驗中，將Hep-2細胞接種于6孔板中，待細胞鋪滿孔板底部形成致密的單層細胞后，用移液器槍頭在細胞層上均勻地劃出一道“劃痕”。劃痕造成了細胞層的損傷，細胞會從劃痕邊緣向中央遷移，以修復損傷區(qū)域。在劃痕形成后，立即用顯微鏡拍照記錄劃痕的初始狀態(tài)，然后分別在不同時間點，如6小時、12小時、24小時等，再次拍照記錄劃痕的愈合情況。通過測量不同時間點劃痕的寬度，并計算劃痕愈合率，可以評估細胞的遷移能力。結果發(fā)現(xiàn)，在相同時間點，對照組細胞的劃痕愈合率明顯高于實驗組，即對照組細胞遷移速度更快，能夠更快地修復劃痕，而實驗組細胞由于沉默了HMGB1基因，遷移速度減慢，劃痕愈合率降低。這進一步證實了HMGB1對喉癌細胞遷移能力的促進作用。4.1.2體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型研究為了更真實地模擬喉癌在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程，深入研究HMGB1對腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成的影響，研究人員構建了動物體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，常用的實驗動物為裸鼠。裸鼠由于缺乏胸腺，免疫功能缺陷，對異種移植的腫瘤細胞幾乎沒有免疫排斥反應，因此是構建腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型的理想動物。實驗時，將轉(zhuǎn)染后的喉癌細胞，如過表達HMGB1的喉癌細胞（實驗組）和未轉(zhuǎn)染的喉癌細胞（對照組），以一定密度（通常為5×10?個細胞/只）接種于裸鼠的尾靜脈。尾靜脈注射后，腫瘤細胞會隨著血液循環(huán)到達肺部等遠處器官，在適宜的微環(huán)境中形成轉(zhuǎn)移灶。在接種后的一段時間內(nèi)，定期觀察裸鼠的健康狀況和行為表現(xiàn)，同時使用小動物活體成像技術對裸鼠體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移情況進行監(jiān)測。小動物活體成像技術是一種利用熒光標記或生物發(fā)光標記的方法，對腫瘤細胞進行標記，然后通過特殊的成像設備，如活體成像儀，對裸鼠體內(nèi)的腫瘤細胞進行實時觀察和成像。在本實驗中，可將熒光蛋白基因（如綠色熒光蛋白GFP基因）與HMGB1基因共轉(zhuǎn)染至喉癌細胞中，使過表達HMGB1的喉癌細胞同時表達綠色熒光蛋白。這樣，在活體成像儀下，就可以清晰地觀察到綠色熒光標記的腫瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的分布和轉(zhuǎn)移情況。經(jīng)過一段時間的觀察，通常為4-6周，處死裸鼠，取出肺部等可能形成轉(zhuǎn)移灶的器官，進行病理切片和蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察肺組織切片，計數(shù)轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，并測量轉(zhuǎn)移灶的大小。結果顯示，實驗組裸鼠肺部的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯多于對照組，轉(zhuǎn)移灶的大小也明顯大于對照組。這表明過表達HMGB1能夠顯著促進喉癌細胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，增加轉(zhuǎn)移灶的形成。進一步通過免疫組化檢測轉(zhuǎn)移灶組織中HMGB1及相關蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶組織中HMGB1的表達水平明顯高于對照組，且與轉(zhuǎn)移灶的大小和數(shù)量呈正相關。同時，檢測到與腫瘤轉(zhuǎn)移相關的蛋白，如基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達水平也明顯升高。MMP-2和MMP-9能夠降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，這進一步證實了HMGB1通過上調(diào)MMP-2和MMP-9等蛋白的表達，促進喉癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。綜上所述，體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型研究結果表明，HMGB1在喉癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，過表達HMGB1能夠促進喉癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移，增加轉(zhuǎn)移灶的形成，為深入理解喉癌的轉(zhuǎn)移機制提供了重要的體內(nèi)實驗證據(jù)。4.2HMGB1與喉癌血管生成4.2.1血管生成相關因子的調(diào)節(jié)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，而血管生成是一個復雜的過程，受到多種血管生成相關因子的精細調(diào)控。研究表明，HMGB1在喉癌血管生成過程中發(fā)揮著關鍵作用，主要通過對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等血管生成相關因子的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)。VEGF是目前已知的最重要的血管生成促進因子之一，它能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而誘導新生血管的生成。在喉癌中，HMGB1與VEGF的表達密切相關。眾多研究表明，HMGB1可以通過激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，上調(diào)VEGF的表達。在過表達HMGB1的喉癌細胞系中，PI3K的活性增強，Akt被磷酸化激活，進而促進了VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。高表達的VEGF通過與血管內(nèi)皮細胞表面的VEGF受體（VEGFR）結合，激活下游的信號傳導通路，促進內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應。相反，當使用siRNA干擾HMGB1的表達后，PI3K/Akt信號通路的激活受到抑制，VEGF的表達顯著下調(diào)，腫瘤血管生成受到明顯抑制。除了VEGF，bFGF也是一種重要的血管生成因子，它能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、分化和遷移，參與血管生成的起始和發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可以通過與bFGF基因的啟動子區(qū)域結合，增強其轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)bFGF的表達。在喉癌組織中，HMGB1與bFGF的表達呈正相關，高表達的HMGB1能夠促進bFGF的分泌，進而刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，促進腫瘤血管生成。當抑制HMGB1的功能時，bFGF的表達減少，血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移能力下降，腫瘤血管生成受到抑制。此外，HMGB1還可以通過調(diào)節(jié)其他血管生成相關因子的表達，如血小板衍生生長因子（PDGF）、血管生成素（Ang）等，來影響喉癌的血管生成。PDGF能夠促進血管平滑肌細胞和纖維母細胞的增殖和遷移，參與血管壁的形成和穩(wěn)定；Ang則在血管生成的不同階段發(fā)揮重要作用，如Ang-1可以促進血管成熟和穩(wěn)定，而Ang-2在某些情況下可以促進血管的重塑和新生。研究表明，HMGB1可以通過激活相關信號通路，上調(diào)PDGF和Ang的表達，促進喉癌血管生成。在過表達HMGB1的喉癌細胞中，PDGF和Ang的表達水平升高，腫瘤血管生成增加；而在干擾HMGB1表達的喉癌細胞中，PDGF和Ang的表達受到抑制，腫瘤血管生成減少。綜上所述，HMGB1通過對VEGF、bFGF、PDGF、Ang等多種血管生成相關因子的調(diào)節(jié)，促進喉癌血管生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供了必要的條件。深入研究HMGB1對這些血管生成相關因子的調(diào)控機制，有助于揭示喉癌血管生成的分子機制，為喉癌的治療提供新的靶點和策略。4.2.2血管生成的體外和體內(nèi)實驗為了進一步驗證HMGB1對喉癌血管生成的影響，研究人員開展了一系列體外和體內(nèi)實驗。在體外實驗中，常用的方法是血管內(nèi)皮細胞管腔形成實驗。選取人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）作為研究對象，將其與不同處理的喉癌細胞（如過表達HMGB1的喉癌細胞、干擾HMGB1表達的喉癌細胞以及對照組喉癌細胞）進行共培養(yǎng)。實驗時，首先在96孔板中鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)的細胞外基質(zhì)環(huán)境。然后將HUVECs接種于Matrigel基質(zhì)膠上，并加入不同處理的喉癌細胞培養(yǎng)上清液。在培養(yǎng)過程中，HUVECs會在Matrigel基質(zhì)膠上遷移、增殖并相互連接，形成類似血管管腔的結構。經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，通常為6-12小時，使用顯微鏡觀察并拍照記錄管腔形成情況。結果顯示，與對照組相比，過表達HMGB1的喉癌細胞培養(yǎng)上清液能夠顯著促進HUVECs的管腔形成，管腔數(shù)量明顯增多，長度明顯增長，分支更加豐富；而干擾HMGB1表達的喉癌細胞培養(yǎng)上清液則抑制了HUVECs的管腔形成，管腔數(shù)量減少，長度縮短，分支減少。這表明HMGB1能夠通過調(diào)節(jié)喉癌細胞分泌的血管生成相關因子，促進血管內(nèi)皮細胞的管腔形成，從而促進喉癌血管生成。在體內(nèi)實驗中，常用的方法是雞胚絨毛尿囊膜（CAM）實驗和裸鼠皮下移植瘤血管生成實驗。在CAM實驗中，選取孵化至第9-11天的雞胚，在其絨毛尿囊膜上放置含有不同處理喉癌細胞的明膠海綿。經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，通常為3-5天，觀察雞胚絨毛尿囊膜上血管的生長情況。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達HMGB1的喉癌細胞組雞胚絨毛尿囊膜上的血管明顯增多、增粗，血管分支更加密集，呈現(xiàn)出