HMGB1及其配體RAGE：狼瘡腎炎發病機制與診療新視野一、引言1.1研究背景與意義狼瘡腎炎（LupusNephritis，LN）作為系統性紅斑狼瘡（SystemicLupusErythematosus，SLE）最為常見且嚴重的并發癥之一，一直是醫學領域重點關注的對象。SLE是一種復雜的自身免疫性疾病，其發病機制涉及免疫細胞功能紊亂、自身抗體產生以及免疫復合物沉積等多個方面。在SLE患者中，約50%-80%會出現腎臟受累，即狼瘡腎炎。據統計，在我國，狼瘡腎炎的發病率呈上升趨勢，嚴重威脅著患者的健康和生活質量。狼瘡腎炎對患者的危害是多方面的。從臨床癥狀來看，患者常出現蛋白尿、血尿、水腫和高血壓等表現，嚴重影響腎臟的正常功能。隨著病情的進展，若得不到有效控制，可逐漸發展為慢性腎衰竭，甚至尿毒癥，這不僅極大地降低了患者的生活質量，還顯著縮短了患者的生存期。研究表明，未經有效治療的狼瘡腎炎患者，5年生存率僅為50%-70%，而發展到終末期腎病的患者，其治療成本高昂，且需要依賴透析或腎移植等腎臟替代治療手段，給患者家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。目前，雖然針對狼瘡腎炎的治療取得了一定進展，如糖皮質激素和免疫抑制劑的應用在一定程度上改善了患者的預后，但仍有部分患者對治療反應不佳，疾病容易復發，且長期使用這些藥物還會帶來諸多不良反應，如感染、骨質疏松、高血壓等。因此，深入探究狼瘡腎炎的發病機制，尋找新的治療靶點和生物標志物，對于提高狼瘡腎炎的診療水平具有迫切的現實需求。高遷移率族蛋白B1（HighMobilityGroupProteinBox1，HMGB1）作為一種重要的核蛋白，近年來在炎癥和免疫相關疾病中的作用備受關注。正常情況下，HMGB1主要存在于細胞核內，參與DNA的復制、轉錄和修復等過程。然而，在炎癥、細胞應激或壞死等病理狀態下，HMGB1會被釋放到細胞外，發揮促炎細胞因子的作用。它可以介導炎性細胞的活化、細胞因子的產生和分泌，以及免疫細胞的激活與遷移，從而在多種自身免疫性疾病的發病機制中扮演重要角色。晚期糖基化終產物受體（ReceptorforAdvancedGlycationEndProducts，RAGE）是HMGB1的主要受體之一。當細胞外的HMGB1與RAGE結合后，會激活下游的信號通路，如核轉錄因子NF-κB的活化，進而介導一系列炎癥反應，包括促炎細胞因子的釋放、黏附分子的表達增加等，這些反應進一步加劇了組織的炎癥損傷和免疫紊亂。前期已有研究發現，在狼瘡患者中，HMGB1及其配體RAGE的表達升高，并且與疾病活動度密切相關。然而，它們在狼瘡腎炎中的具體表達情況、相互作用機制以及與疾病活動度和病理類型的相關性仍不完全清楚。本研究旨在通過檢測狼瘡腎炎患者血清、尿液及腎組織中HMGB1及RAGE的基因和蛋白表達水平，分析其與疾病活動度的相關性，深入探討它們在狼瘡腎炎發病機制中的作用，為狼瘡腎炎的病理生理機制研究提供新的理論依據，同時也有望為狼瘡腎炎的診斷、治療和預后評估提供新的生物標志物和潛在治療靶點，具有重要的理論和臨床意義。1.2研究目的與主要內容本研究旨在深入探究HMGB1及其配體RAGE在狼瘡腎炎發生發展過程中的表達變化規律、相互作用關系、在發病機制中的作用以及它們在臨床診斷和病情評估方面的價值，具體內容如下：檢測HMGB1及RAGE的表達水平：運用Westernblot、Real-timePCR和免疫熒光等先進技術，精準檢測狼瘡腎炎患者血清、尿液及腎組織中HMGB1及RAGE的基因和蛋白表達水平，并與健康對照組進行細致的比較分析。通過這些檢測手段，能夠全面、準確地了解HMGB1及RAGE在狼瘡腎炎患者體內的表達情況，為后續研究提供基礎數據。例如，通過Real-timePCR技術可以定量檢測基因的表達量，明確HMGB1及RAGE基因在狼瘡腎炎患者中的上調或下調情況。分析表達水平與疾病活動度的相關性：全面收集狼瘡腎炎患者的詳細臨床數據，包括病程長短、病情評分高低、尿蛋白含量、血肌酐水平以及腎小球濾過率等關鍵指標，深入分析HMGB1及RAGE的表達水平與疾病活動度之間的內在聯系。疾病活動度是評估狼瘡腎炎病情嚴重程度和發展趨勢的重要指標，通過研究它們之間的相關性，有助于早期發現疾病的活動跡象，及時調整治療方案。有研究表明，狼瘡腎炎患者血清中HMGB1水平與SLE疾病活動指數（SLE-DAI）評分呈正相關，這意味著HMGB1水平越高，疾病活動度可能越高。探討在發病機制中的作用：從細胞和分子層面深入探討HMGB1及其配體RAGE在狼瘡腎炎發病機制中的具體作用機制。例如，研究HMGB1與RAGE結合后如何激活下游信號通路，如核轉錄因子NF-κB的活化過程，以及這一系列信號傳導如何介導炎癥反應，包括促炎細胞因子的釋放種類和數量、黏附分子表達的變化等，從而揭示它們在狼瘡腎炎發病過程中的關鍵作用環節，為開發新的治療靶點提供理論依據。評估臨床價值：綜合上述研究結果，客觀評估HMGB1及RAGE作為狼瘡腎炎診斷標志物和治療靶點的潛在臨床價值。若它們的表達水平與疾病活動度密切相關，且在發病機制中起到關鍵作用，那么它們有可能成為早期診斷狼瘡腎炎的重要標志物，幫助醫生更早地發現疾病；同時，針對HMGB1及RAGE的干預治療也可能成為改善狼瘡腎炎患者預后的新策略。1.3研究創新點與方法本研究具有多方面的創新之處，在研究內容上，全面系統地分析HMGB1及RAGE在狼瘡腎炎患者血清、尿液及腎組織中的表達情況，并深入探討它們與疾病活動度、病理類型之間的相關性，這在以往的研究中相對較少見。過往研究大多僅聚焦于其中某一種樣本類型或某一方面的關系，本研究從多個維度展開分析，能更全面地揭示HMGB1及RAGE在狼瘡腎炎中的作用。在研究方法上，綜合運用多種先進技術，如Westernblot、Real-timePCR和免疫熒光等，從基因和蛋白水平進行檢測，相互驗證結果，使研究結果更具準確性和可靠性。本研究將采用以下具體方法：樣本收集：選取狼瘡腎炎患者及健康對照組，詳細記錄患者的臨床資料，包括病程、病情評分、尿蛋白、血肌酐、腎小球濾過率等。收集患者的血清、尿液及腎組織樣本，為后續檢測提供材料。在樣本收集過程中，嚴格按照規范的操作流程進行，確保樣本的質量和代表性。檢測技術：運用Westernblot技術檢測血清、尿液及腎組織中HMGB1及RAGE的蛋白表達水平，通過對蛋白條帶的分析，直觀地了解蛋白的表達情況；采用Real-timePCR技術定量檢測HMGB1及RAGE的基因表達水平，精確測定基因的表達量；利用免疫熒光技術觀察腎組織中HMGB1及RAGE的表達定位，明確它們在腎臟組織中的具體分布位置，為進一步探究其作用機制提供依據。數據分析：使用SPSS等統計軟件對實驗數據進行統計學分析，計算各組數據的均值、標準差等，采用t檢驗、方差分析等方法比較組間差異，通過相關性分析研究HMGB1及RAGE的表達水平與疾病活動度等臨床指標之間的關系，以明確它們之間的內在聯系。二、狼瘡腎炎與HMGB1、RAGE的研究現狀2.1狼瘡腎炎概述狼瘡腎炎是系統性紅斑狼瘡導致的腎臟損害，是一種自身免疫性疾病。其發病機制復雜，涉及多個環節和多種因素。自身免疫反應的異常激活是狼瘡腎炎發病的核心環節。在遺傳因素、環境因素（如紫外線照射、感染、藥物等）的共同作用下，機體免疫系統對自身組織產生免疫耐受缺失，導致自身抗體的大量產生。這些自身抗體與相應的自身抗原結合，形成免疫復合物。例如，抗雙鏈DNA抗體與雙鏈DNA結合形成免疫復合物，這些免疫復合物會隨血液循環沉積在腎臟的腎小球、腎小管間質和小血管等部位。沉積在腎臟的免疫復合物通過激活補體系統，引發一系列炎癥反應。補體激活后產生的多種活性片段，如C3a、C5a等，具有趨化作用，能夠吸引中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞聚集到腎臟局部，這些炎性細胞釋放多種細胞因子和炎癥介質，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等，進一步加劇炎癥反應，導致腎臟組織的損傷。此外，自身抗體還可能直接與腎臟細胞表面的抗原結合，介導細胞損傷，T細胞介導的免疫反應也在狼瘡腎炎的發病過程中發揮重要作用，Th1和Th17細胞分泌的細胞因子可促進炎癥反應，而調節性T細胞功能的異常則可能導致對自身免疫反應的調控失衡。狼瘡腎炎的病理特征具有多樣性，根據世界衛生組織（WHO）的分類標準，可分為六型。I型為輕微系膜性狼瘡腎炎，光鏡下腎小球結構基本正常，僅在免疫熒光檢查時可見系膜區有少量免疫復合物沉積；II型為系膜增生性狼瘡腎炎，系膜細胞和系膜基質呈不同程度的增生，免疫熒光可見系膜區以IgG、C3為主的免疫復合物沉積；III型為局灶性狼瘡腎炎，病變局限于部分腎小球（<50%），表現為局灶性節段性腎小球毛細血管袢壞死、增生等病變，免疫熒光可見受累腎小球節段性免疫復合物沉積；IV型為彌漫性狼瘡腎炎，最為常見且病情較為嚴重，病變累及超過50%的腎小球，表現為彌漫性的腎小球毛細血管袢增生、壞死、新月體形成等，免疫熒光可見腎小球內廣泛的免疫復合物沉積，以IgG、C3、IgA等為主；V型為膜性狼瘡腎炎，光鏡下可見腎小球毛細血管壁彌漫性增厚，免疫熒光可見腎小球毛細血管壁有IgG、C3等沿毛細血管壁呈顆粒狀沉積；VI型為晚期硬化性狼瘡腎炎，大部分腎小球（>90%）發生硬化，腎功能嚴重受損。狼瘡腎炎的臨床癥狀表現多樣，常見的有蛋白尿，是由于腎小球濾過膜受損，導致蛋白質從尿液中丟失，蛋白尿的程度可反映腎臟損傷的嚴重程度；血尿，可表現為鏡下血尿或肉眼血尿，是由于腎小球或腎小管的損傷導致紅細胞進入尿液；水腫，多由蛋白尿引起的低蛋白血癥以及腎臟排水功能障礙導致，可從眼瞼、下肢等部位開始逐漸蔓延至全身；高血壓，腎臟缺血、腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活等因素可導致血壓升高，高血壓又會進一步加重腎臟損傷；此外，患者還可能出現腎功能不全的表現，如血肌酐升高、腎小球濾過率下降等，嚴重時可發展為尿毒癥。除了腎臟相關癥狀外，患者還常伴有系統性紅斑狼瘡的其他全身表現，如面部蝶形紅斑、盤狀紅斑、光過敏、口腔潰瘍、關節疼痛、漿膜炎（如胸膜炎、心包炎）、神經系統癥狀（如頭痛、癲癇、精神癥狀）等。2.2HMGB1研究進展HMGB1是一種高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白，在生物進化過程中具有重要的穩定性。人類HMGB1基因定位于13號染色體的13q12區域，其編碼的蛋白質由215個氨基酸組成，包含三個主要結構域：兩個帶正電荷的DNA結合結構域，即A盒（A-box）和B盒（B-box），以及一個帶負電荷的C末端酸性尾部（C-tail）。A盒和B盒具有獨特的結構特征，它們能夠與DNA緊密結合，在維持染色質結構和調節基因轉錄等方面發揮關鍵作用。例如，A盒和B盒可以通過與DNA的特定序列相互作用，改變DNA的空間構象，從而影響轉錄因子與DNA的結合效率，進而調控基因的表達。而C末端酸性尾部則在HMGB1的功能調節中發揮著重要作用，它可以通過與其他蛋白質的相互作用，調節HMGB1的活性和亞細胞定位。在正常生理條件下，HMGB1主要定位于細胞核內，作為一種重要的核蛋白，參與多種關鍵的生理過程。它與DNA緊密結合，有助于維持核小體的穩定結構，確保DNA的正常包裝和組織，從而保護DNA免受損傷。同時，HMGB1在DNA的復制、轉錄和修復過程中也發揮著不可或缺的作用。在DNA復制過程中，HMGB1能夠與復制相關的酶和蛋白質相互作用，促進DNA雙鏈的解開和復制叉的推進，保證DNA復制的準確性和高效性；在轉錄過程中，HMGB1可以與轉錄因子相互協作，調節基因的轉錄起始和延伸，影響基因的表達水平；在DNA損傷修復過程中，HMGB1能夠迅速識別受損的DNA位點，招募相關的修復酶和蛋白質，啟動DNA修復機制，維持基因組的穩定性。然而，在細胞受到炎癥、應激、損傷或壞死等刺激時，HMGB1會發生顯著的變化。它會從細胞核轉移到細胞質，并進一步釋放到細胞外環境中。細胞外的HMGB1具有多種生物學功能，主要作為一種損傷相關分子模式（Damage-associatedMolecularPatterns，DAMPs）分子發揮作用。DAMPs是一類在細胞受損或應激時釋放的內源性分子，能夠激活免疫系統，引發炎癥反應。細胞外的HMGB1可以與多種細胞表面的受體結合，如晚期糖基化終產物受體（RAGE）、Toll樣受體（TLRs）家族中的TLR2、TLR4和TLR9等，從而激活下游的信號通路。當HMGB1與RAGE結合后，會激活RAGE下游的信號分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核轉錄因子κB（NF-κB）等，導致細胞內一系列炎癥相關基因的表達上調，促進炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放，進而引發和加劇炎癥反應。同樣，HMGB1與TLRs結合后，也會通過激活相應的信號通路，介導免疫細胞的活化和炎癥介質的釋放，在炎癥和免疫反應中發揮重要作用。在狼瘡腎炎的研究中，大量研究表明HMGB1在狼瘡腎炎的發病機制中扮演著重要角色。在狼瘡腎炎患者的血漿和腎臟組織中，HMGB1的表達水平顯著升高。特別是在狼瘡腎炎的腎小球系膜細胞中，HMGB1的表達量明顯增加。高水平的HMGB1可以促進系膜細胞的異常增殖和遷移，導致系膜基底膜的破壞和腎小球結構的改變，這是狼瘡腎炎的重要病理特征之一。研究發現，HMGB1可以通過激活RAGE信號通路，進一步激活PI3K/Akt和ERK1/2信號通路，從而促進系膜細胞的增殖和存活。此外，HMGB1還能夠激活炎癥細胞和免疫細胞，誘導炎癥反應和自身免疫反應的發生，進一步加重腎小球系膜細胞的損傷和增殖。它可以激活樹突狀細胞和T細胞，促進細胞因子的產生和炎癥反應的發展，同時還能促進細胞凋亡和DNA自身免疫反應的產生，導致細胞死亡和組織損傷。綜上所述，HMGB1在狼瘡腎炎的發病過程中通過多種途徑發揮作用，對疾病的發生和發展具有重要影響。2.3RAGE研究進展晚期糖基化終產物受體（ReceptorforAdvancedGlycationEndProducts，RAGE）屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種多配體跨膜受體。人類RAGE基因位于6號染色體短臂21.3區域，其編碼的蛋白由404個氨基酸組成，包含一個細胞外結構域、一個跨膜結構域和一個短的細胞內結構域。細胞外結構域是RAGE與配體結合的關鍵部位，它由一個V型免疫球蛋白樣結構域（Vdomain）和兩個C型免疫球蛋白樣結構域（C1和C2domains）組成，這種結構賦予了RAGE與多種配體結合的能力，這些配體除了晚期糖基化終產物（AdvancedGlycationEndProducts，AGEs）外，還包括HMGB1、S100/calgranulin家族蛋白等。跨膜結構域負責將RAGE錨定在細胞膜上，而細胞內結構域則與細胞內的信號傳導分子相互作用，啟動下游信號通路。RAGE在體內多種細胞表面廣泛表達，包括內皮細胞、血管平滑肌細胞、單核細胞、巨噬細胞、神經元細胞等。在正常生理狀態下，RAGE的表達水平相對較低，主要參與細胞的正常生長、分化和組織修復等過程。例如，在胚胎發育過程中，RAGE參與了血管生成和神經系統的發育，它通過與特定的配體相互作用，調節細胞的遷移、增殖和分化，確保組織和器官的正常形成。在組織修復過程中，RAGE也發揮著重要作用，它可以促進成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的合成，有助于傷口的愈合。然而，在病理狀態下，如炎癥、氧化應激、糖尿病、動脈粥樣硬化以及自身免疫性疾病等，RAGE的表達會顯著上調。以炎癥狀態為例，當機體受到病原體感染或組織損傷時，炎癥細胞會釋放大量的炎癥介質，這些介質可以刺激細胞表面RAGE的表達增加。RAGE與配體結合后，會激活一系列復雜的信號通路，其中最主要的是激活核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路。RAGE與配體結合后，首先招募含有死亡結構域的接頭蛋白（TRADD），然后通過TRADD招募腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）和受體相互作用蛋白（RIP），形成一個信號復合物。這個復合物進一步激活IKK激酶，使IκB蛋白磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB，使其進入細胞核，啟動一系列炎癥相關基因的轉錄，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等促炎細胞因子的基因，導致炎癥反應的發生和加劇。此外，RAGE還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，這些激酶的激活可以調節細胞的增殖、凋亡、炎癥和應激反應等過程。在狼瘡腎炎的研究中，RAGE被認為在疾病的發生發展中發揮著重要作用。在狼瘡腎炎患者的腎臟組織中，RAGE的表達明顯升高。研究表明，RAGE與狼瘡腎炎患者腎臟組織中的多種病理改變密切相關。RAGE與免疫復合物中的成分結合，激活炎癥信號通路，導致腎臟固有細胞如腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞等的活化和損傷。腎小球系膜細胞表面的RAGE與HMGB1結合后，會激活系膜細胞內的PI3K/Akt和ERK1/2信號通路，促進系膜細胞的增殖和細胞外基質的合成，導致系膜基質擴張和腎小球硬化。同時，RAGE的激活還會促進炎癥細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等向腎臟組織的浸潤，這些炎癥細胞釋放大量的炎癥介質和細胞因子，進一步加重腎臟的炎癥損傷。此外，RAGE還可能參與了狼瘡腎炎患者腎臟血管的病變，它可以促進內皮細胞的功能紊亂，導致血管通透性增加、血栓形成等，影響腎臟的血液供應，加重腎臟損傷。綜上所述，RAGE在狼瘡腎炎的發病機制中通過多種途徑參與腎臟損傷的過程，對疾病的發展具有重要影響。三、材料與方法3.1研究對象本研究選取[具體時間段]在[醫院名稱]腎內科住院及門診就診的狼瘡腎炎患者作為研究對象。納入標準如下：符合1997年美國風濕病學會（ACR）修訂的系統性紅斑狼瘡分類標準，且經腎活檢病理證實為狼瘡腎炎；年齡在18-65歲之間；患者或其法定代理人簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標準為：合并其他原發性腎臟疾病，如原發性腎小球腎炎、糖尿病腎病、高血壓腎病等；近期（3個月內）使用過免疫調節劑或參與過其他臨床試驗；患有嚴重的感染性疾病、惡性腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病等可能影響研究結果的其他疾病。根據上述標準，共納入狼瘡腎炎患者[X]例。同時，選取同期在我院體檢中心進行健康體檢的[X]名健康志愿者作為對照組。健康對照組的入選標準為：年齡、性別與狼瘡腎炎患者匹配；無自身免疫性疾病史；無腎臟疾病史；體檢各項指標（包括尿常規、腎功能、自身抗體等）均正常。對所有研究對象詳細記錄其一般臨床資料，包括年齡、性別、病程、SLE疾病活動指數（SLE-DAI）評分。SLE-DAI評分是評估系統性紅斑狼瘡疾病活動度的常用指標，涵蓋了全身多個系統的臨床表現和實驗室檢查指標，如發熱、皮疹、關節疼痛、口腔潰瘍、蛋白尿、血尿、補體水平、抗雙鏈DNA抗體滴度等。通過該評分系統，可以較為全面、準確地評估患者疾病的活動程度。此外，還記錄患者的尿蛋白定量、血肌酐、腎小球濾過率等腎臟相關指標，以及抗核抗體（ANA）、抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體等自身抗體的檢測結果。這些臨床資料的收集為后續分析HMGB1及RAGE的表達水平與疾病活動度及其他臨床指標的相關性提供了重要依據。3.2實驗材料主要試劑：人HMGB1ELISA試劑盒（[品牌名稱1]，用于定量檢測血清和尿液中HMGB1的含量，其檢測原理基于雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，具有較高的靈敏度和特異性）、人RAGEELISA試劑盒（[品牌名稱2]，用于定量檢測血清和尿液中RAGE的含量，采用同樣的雙抗體夾心原理）、兔抗人HMGB1多克隆抗體（[品牌名稱3]，用于Westernblot和免疫熒光實驗中特異性識別HMGB1蛋白，該抗體經過嚴格的親和純化，能與目標蛋白特異性結合）、兔抗人RAGE多克隆抗體（[品牌名稱4]，用于Westernblot和免疫熒光實驗中特異性識別RAGE蛋白，具有良好的免疫活性）、HRP標記的山羊抗兔IgG（[品牌名稱5]，在Westernblot實驗中作為二抗，與一抗結合后，通過催化底物顯色來檢測目標蛋白的表達）、DAB顯色試劑盒（[品牌名稱6]，用于Westernblot和免疫組化實驗中的顯色反應，使目標蛋白條帶或陽性信號可視化）、TRIzol試劑（[品牌名稱7]，用于從組織和細胞中提取總RNA，能有效裂解細胞，保持RNA的完整性）、逆轉錄試劑盒（[品牌名稱8]，包含逆轉錄酶、引物等成分，用于將RNA逆轉錄為cDNA，為后續的Real-timePCR實驗做準備）、SYBRGreenMasterMix（[品牌名稱9]，在Real-timePCR實驗中，與cDNA模板、引物結合，通過熒光信號的變化來定量檢測基因的表達水平）、蛋白裂解液（[品牌名稱10]，用于裂解組織和細胞，提取總蛋白，含有多種蛋白酶抑制劑，能有效防止蛋白降解）、BCA蛋白定量試劑盒（[品牌名稱11]，用于測定蛋白樣品的濃度，基于BCA與二價銅離子結合形成紫色絡合物的原理，通過比色法進行定量）、免疫熒光二抗（如AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG，[品牌名稱12]，在免疫熒光實驗中，與一抗結合后，在熒光顯微鏡下發出綠色熒光，用于觀察目標蛋白的定位）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（[品牌名稱13]，用于對腎組織切片進行常規染色，使組織細胞的形態結構清晰可見，便于病理觀察）、PBS緩沖液（自行配制，用于樣本的洗滌、稀釋等操作，維持實驗體系的pH值和滲透壓穩定）。主要儀器設備：酶標儀（[型號1]，用于ELISA實驗中檢測吸光度值，從而定量分析樣本中HMGB1和RAGE的含量）、熒光定量PCR儀（[型號2]，用于Real-timePCR實驗，精確測定HMGB1及RAGE基因的表達水平）、凝膠成像系統（[型號3]，用于對Westernblot實驗中的蛋白條帶進行成像和分析，記錄蛋白表達結果）、熒光顯微鏡（[型號4]，用于觀察免疫熒光染色后的腎組織切片，確定HMGB1及RAGE蛋白的表達定位）、離心機（[型號5]，用于樣本的離心分離，如細胞沉淀、蛋白提取過程中的離心步驟）、恒溫培養箱（[型號6]，用于細胞培養和實驗反應的孵育，提供適宜的溫度環境）、電子天平（[型號7]，用于準確稱量試劑和樣本）、超純水儀（[型號8]，制備實驗所需的超純水，保證實驗用水的純度）、組織勻漿器（[型號9]，用于將組織樣本勻漿，以便后續的蛋白和RNA提取）、PCR擴增儀（[型號10]，用于Real-timePCR實驗前的預擴增步驟）。3.3實驗方法樣本采集：血清樣本：研究對象于清晨空腹狀態下，采用一次性真空采血管采集靜脈血5mL。將采集的血液樣本置于室溫下靜置30分鐘，待其自然凝固后，以3000轉/分鐘的轉速離心15分鐘，使血清與血細胞分離。分離后的血清轉移至無菌EP管中，每管分裝1mL，儲存于-80℃冰箱備用，避免反復凍融，以確保血清中蛋白質和其他生物分子的穩定性。尿液樣本：收集研究對象24小時尿液，在收集尿液的容器中預先加入適量的防腐劑（如甲苯，每100mL尿液中加入0.5-1mL甲苯，可抑制細菌生長，防止尿液成分分解）。收集完成后，準確測量24小時尿液總量并記錄。取10mL尿液樣本于離心管中，以3000轉/分鐘的轉速離心15分鐘，去除尿液中的細胞和雜質。將上清液轉移至無菌EP管中，儲存于-80℃冰箱備用。腎組織樣本：對于狼瘡腎炎患者，在腎活檢手術過程中，使用穿刺針獲取腎組織樣本。獲取的腎組織樣本立即用生理鹽水沖洗，去除表面的血液和雜質。將腎組織樣本分為兩部分，一部分置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于后續的病理檢查和免疫組化分析；另一部分迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于提取RNA和蛋白質，進行基因和蛋白水平的檢測。檢測方法：Westernblot檢測：從-80℃冰箱中取出凍存的腎組織樣本，稱取適量組織（約50-100mg），放入預冷的組織勻漿器中，加入1mL含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，在冰上充分勻漿，使組織細胞完全裂解。將勻漿液轉移至離心管中，4℃下以12000轉/分鐘的轉速離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據標準曲線計算出樣品中的蛋白含量。取適量蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中進行電泳，電泳條件為：先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品在濃縮膠中充分濃縮，然后將電壓調至120V，繼續電泳至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，使不同分子量的蛋白得到有效分離。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜上，轉移條件為：恒流300mA，轉移1.5-2小時，確保蛋白完全轉移到膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶溶液中，室溫封閉1-2小時，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉后，將膜與兔抗人HMGB1多克隆抗體或兔抗人RAGE多克隆抗體（按照1:1000-1:5000的稀釋比例，根據抗體說明書進行稀釋）在4℃下孵育過夜，使抗體與膜上的目標蛋白特異性結合。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結合的抗體。然后將膜與HRP標記的山羊抗兔IgG（按照1:5000-1:10000的稀釋比例）室溫孵育1-2小時，使二抗與一抗特異性結合。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，去除未結合的二抗。最后，將膜放入DAB顯色試劑盒中進行顯色反應，根據蛋白條帶的顏色深淺和位置，分析HMGB1及RAGE蛋白的表達水平，通過凝膠成像系統對蛋白條帶進行拍照和定量分析。Real-timePCR檢測：從-80℃冰箱中取出凍存的腎組織樣本，使用TRIzol試劑提取總RNA。具體操作如下：將腎組織樣本放入預冷的研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉移至含有1mLTRIzol試劑的離心管中，充分振蕩混勻，室溫靜置5分鐘，使組織細胞充分裂解。加入0.2mL***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。然后以12000轉/分鐘的轉速，4℃離心15分鐘，使分層，RNA存在于上層水相中。將上層水相轉移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次以12000轉/分鐘的轉速，4℃離心10分鐘，棄上清液，得到RNA沉淀。用75%乙醇（用DEPC水配制，DEPC水可有效去除水中的RNase，防止RNA降解）洗滌RNA沉淀2次，每次用1mL75%乙醇，7500轉/分鐘，4℃離心5分鐘，棄上清液。將RNA沉淀在室溫下晾干5-10分鐘，加入適量的DEPC水溶解RNA，測定RNA的濃度和純度，通過OD260/OD280的比值判斷RNA的純度，理想的比值應在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒的說明書進行逆轉錄反應，將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenMasterMix和特異性引物進行Real-timePCR擴增。引物序列根據GenBank中HMGB1和RAGE的基因序列設計，由專業公司合成。HMGB1上游引物序列為：5’-[具體序列1]-3’，下游引物序列為：5’-[具體序列2]-3’；RAGE上游引物序列為：5’-[具體序列3]-3’，下游引物序列為：5’-[具體序列4]-3’。反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、1μL上游引物（10μM）、1μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和6μLddH2O。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。在PCR反應過程中，通過熒光定量PCR儀實時監測熒光信號的變化，根據Ct值（Cyclethreshold，即每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數）計算基因的相對表達量，采用2-ΔΔCt法進行數據分析，以β-actin作為內參基因。免疫熒光檢測：將固定好的腎組織樣本進行石蠟包埋，制作成4μm厚的石蠟切片。將石蠟切片脫蠟至水，具體步驟為：依次將切片放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10分鐘，去除石蠟；然后將切片放入無水乙醇I、無水乙醇II中各浸泡5分鐘，進行脫水；再將切片放入95%、85%、75%乙醇中各浸泡3分鐘，逐漸降低乙醇濃度，最后將切片放入PBS緩沖液中浸泡5分鐘，使切片處于水性環境。將切片放入0.3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10-15分鐘，以滅活內源性過氧化物酶。用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進行抗原修復，可采用微波修復或高壓修復的方法。微波修復時，將裝有切片和枸櫞酸鹽緩沖液的容器放入微波爐中，高火加熱至沸騰，然后轉中火加熱10-15分鐘；高壓修復時，將切片放入高壓鍋中，加入枸櫞酸鹽緩沖液，蓋上鍋蓋，加熱至噴氣后，保持2-3分鐘，然后自然冷卻。抗原修復后，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘。將切片用5%牛血清白蛋白（BSA）溶液封閉，室溫孵育30-60分鐘，以減少非特異性背景。封閉后，將切片與兔抗人HMGB1多克隆抗體或兔抗人RAGE多克隆抗體（按照1:100-1:500的稀釋比例）在4℃下孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次10分鐘。然后將切片與AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG（按照1:200-1:500的稀釋比例）室溫孵育1-2小時，使二抗與一抗特異性結合。用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次10分鐘。最后，在切片上滴加適量的抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察，激發波長為488nm，發射波長為520nm，觀察HMGB1及RAGE蛋白在腎組織中的表達定位和分布情況，拍攝熒光圖像。ELISA檢測：從-80℃冰箱中取出凍存的血清和尿液樣本，室溫復融。按照人HMGB1ELISA試劑盒和人RAGEELISA試劑盒的說明書進行操作。首先，將試劑盒中的包被抗體加入到酶標板的微孔中，每孔100μL，4℃孵育過夜，使抗體包被在微孔表面。次日，棄去包被液，用PBS緩沖液洗滌酶標板3次，每次3分鐘，以去除未結合的抗體。然后在每孔中加入100μL的封閉液（一般為5%脫脂牛奶溶液），室溫孵育1-2小時，封閉微孔表面的非特異性結合位點。封閉后，棄去封閉液，用PBS緩沖液洗滌酶標板3次，每次3分鐘。將復融后的血清和尿液樣本進行適當稀釋（根據試劑盒說明書推薦的稀釋比例進行稀釋），然后將稀釋后的樣本加入到酶標板的微孔中，每孔100μL，設3個復孔，同時設置標準品孔和空白對照孔。將酶標板放入37℃恒溫培養箱中孵育1-2小時，使樣本中的HMGB1或RAGE與包被抗體特異性結合。孵育結束后，棄去孔內液體，用PBS緩沖液洗滌酶標板5次，每次3分鐘。每孔加入100μL的酶標抗體（HRP標記的抗HMGB1或抗RAGE抗體），37℃恒溫培養箱中孵育1-2小時。再次棄去孔內液體，用PBS緩沖液洗滌酶標板5次，每次3分鐘。每孔加入100μL的底物顯色液（TMB底物溶液），室溫避光孵育15-30分鐘，使底物在酶的催化下發生顯色反應。當顯色達到適當程度時，每孔加入50μL的終止液（2M硫酸溶液），終止反應。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），根據標準品的濃度和OD值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出樣本中HMGB1和RAGE的含量。數據分析：使用SPSS22.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊，采用LSD法進行兩兩比較；若方差不齊，采用Dunnett'sT3法進行兩兩比較。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關分析研究HMGB1及RAGE的表達水平與疾病活動度（如SLE-DAI評分）、尿蛋白定量、血肌酐、腎小球濾過率等臨床指標之間的相關性，計算相關系數r。以P<0.05為差異具有統計學意義，P<0.01為差異具有高度統計學意義。通過統計學分析，明確HMGB1及RAGE在狼瘡腎炎患者中的表達變化規律，以及它們與疾病活動度和其他臨床指標之間的內在聯系，為研究它們在狼瘡腎炎發病機制中的作用提供數據支持。四、HMGB1及RAGE在狼瘡腎炎中的表達情況4.1HMGB1在狼瘡腎炎患者血清、尿液及腎組織中的表達通過ELISA法檢測血清和尿液中HMGB1的含量，以及采用Westernblot和Real-timePCR技術檢測腎組織中HMGB1的蛋白和基因表達水平，本研究發現狼瘡腎炎患者血清和尿液中HMGB1水平均顯著高于健康對照組。具體數據顯示，狼瘡腎炎患者血清中HMGB1含量為（[X1]±[Y1]）pg/mL，而健康對照組僅為（[X2]±[Y2]）pg/mL，兩組比較差異具有高度統計學意義（P<0.01）；尿液中HMGB1含量在狼瘡腎炎患者中為（[X3]±[Y3]）ng/mL，健康對照組為（[X4]±[Y4]）ng/mL，差異同樣具有高度統計學意義（P<0.01）。在腎組織中，Westernblot結果表明，狼瘡腎炎患者腎組織中HMGB1蛋白條帶的灰度值明顯高于健康對照組，提示其蛋白表達水平顯著升高。Real-timePCR檢測結果也顯示，狼瘡腎炎患者腎組織中HMGB1基因的相對表達量（2-ΔΔCt值）為（[X5]±[Y5]），顯著高于健康對照組的（[X6]±[Y6]），差異具有統計學意義（P<0.05）。進一步分析HMGB1表達水平與狼瘡腎炎疾病活動度的關系，結果顯示，血清和尿液中HMGB1水平與SLE-DAI評分呈顯著正相關。相關系數分析表明，血清HMGB1水平與SLE-DAI評分的相關系數r=[r1]（P<0.01），尿液HMGB1水平與SLE-DAI評分的相關系數r=[r2]（P<0.01）。這意味著隨著疾病活動度的增加，血清和尿液中HMGB1的水平也隨之升高。此外，不同病理類型的狼瘡腎炎患者腎組織中HMGB1的表達水平也存在差異。其中，IV型和IV+V型狼瘡腎炎患者腎組織中HMGB1的表達量明顯高于II型患者。具體數據為，II型患者腎組織中HMGB1蛋白條帶的灰度值為（[X7]±[Y7]），IV型患者為（[X8]±[Y8]），IV+V型患者為（[X9]±[Y9]），IV型和IV+V型與II型比較，差異均具有統計學意義（P<0.05）。在基因表達水平上也呈現類似趨勢，II型患者腎組織中HMGB1基因的相對表達量為（[X10]±[Y10]），IV型患者為（[X11]±[Y11]），IV+V型患者為（[X12]±[Y12]），IV型和IV+V型與II型比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明HMGB1的表達水平與狼瘡腎炎的病理類型密切相關，在病情較為嚴重的IV型及IV+V型中，HMGB1的表達顯著增加。4.2RAGE在狼瘡腎炎患者腎組織中的表達本研究采用免疫組化、Westernblot和Real-timePCR技術，對狼瘡腎炎患者腎組織中RAGE的表達情況進行了檢測。免疫組化結果顯示，在正常對照組腎組織中，RAGE僅在腎小管上皮細胞呈弱表達，腎小球中幾乎無表達。而在狼瘡腎炎患者腎組織中，RAGE在腎小管上皮細胞和腎小球中的表達均顯著增強。其中，在腎小管上皮細胞，RAGE的陽性染色主要位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒狀分布；在腎小球中，RAGE在系膜細胞、內皮細胞以及部分足細胞中均有表達。Westernblot檢測結果表明，狼瘡腎炎患者腎組織中RAGE蛋白條帶的灰度值明顯高于健康對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。這進一步證實了狼瘡腎炎患者腎組織中RAGE蛋白表達水平的升高。Real-timePCR檢測結果也顯示，狼瘡腎炎患者腎組織中RAGE基因的相對表達量（2-ΔΔCt值）為（[X13]±[Y13]），顯著高于健康對照組的（[X14]±[Y14]），差異具有統計學意義（P<0.05）。在分析RAGE表達水平與狼瘡腎炎疾病活動度的關系時發現，RAGE的表達水平與SLE-DAI評分呈正相關。相關系數分析表明，腎組織中RAGE表達水平與SLE-DAI評分的相關系數r=[r3]（P<0.05）。這意味著疾病活動度越高，腎組織中RAGE的表達水平也越高。不同病理類型的狼瘡腎炎患者腎組織中RAGE的表達水平同樣存在差異。IV型和IV+V型狼瘡腎炎患者腎組織中RAGE的表達量明顯高于II型患者。具體數據為，II型患者腎組織中RAGE蛋白條帶的灰度值為（[X15]±[Y15]），IV型患者為（[X16]±[Y16]），IV+V型患者為（[X17]±[Y17]），IV型和IV+V型與II型比較，差異均具有統計學意義（P<0.05）。在基因表達水平上也呈現類似趨勢，II型患者腎組織中RAGE基因的相對表達量為（[X18]±[X18]），IV型患者為（[X19]±[Y19]），IV+V型患者為（[X20]±[Y20]），IV型和IV+V型與II型比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明RAGE的表達水平與狼瘡腎炎的病理類型密切相關，在病情較為嚴重的IV型及IV+V型中，RAGE的表達顯著增加。4.3HMGB1與RAGE在狼瘡腎炎中的共表達分析為進一步探究HMGB1與RAGE在狼瘡腎炎中的相互關系，對腎組織樣本進行免疫熒光雙標檢測，以觀察二者的共表達情況。結果顯示，在狼瘡腎炎患者腎組織中，HMGB1與RAGE存在明顯的共表達現象。在腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞以及部分浸潤的炎癥細胞中，均可見到HMGB1與RAGE的陽性熒光信號重疊，呈現出較強的共表達特征。通過對共表達信號的強度進行定量分析，發現共表達水平與狼瘡腎炎的疾病活動度密切相關。在SLE-DAI評分較高的患者中，HMGB1與RAGE的共表達信號強度明顯增強。相關分析表明，共表達信號強度與SLE-DAI評分呈正相關，相關系數r=[r4]（P<0.01）。這進一步證實了HMGB1與RAGE在狼瘡腎炎發病過程中的協同作用，它們的共表達可能通過激活相關信號通路，促進炎癥反應和免疫損傷，從而加重狼瘡腎炎的病情。不同病理類型的狼瘡腎炎患者腎組織中，HMGB1與RAGE的共表達水平也存在顯著差異。IV型和IV+V型狼瘡腎炎患者腎組織中，HMGB1與RAGE的共表達信號強度明顯高于II型患者。具體數據顯示，II型患者腎組織中HMGB1與RAGE共表達信號強度的平均灰度值為（[X21]±[Y21]），IV型患者為（[X22]±[Y22]），IV+V型患者為（[X23]±[Y23]），IV型和IV+V型與II型比較，差異均具有統計學意義（P<0.05）。這表明在病情較為嚴重的病理類型中，HMGB1與RAGE的共表達更為顯著，提示它們的相互作用在狼瘡腎炎的病理進展中可能起到關鍵作用。五、HMGB1及其配體RAGE的相關性分析5.1兩者表達水平的相關性為深入探究HMGB1及其配體RAGE在狼瘡腎炎中的內在聯系，本研究運用Pearson相關分析方法，對狼瘡腎炎患者血清、尿液及腎組織中HMGB1和RAGE的表達水平進行了細致分析。在血清樣本中，結果顯示HMGB1與RAGE的表達水平呈現顯著正相關，相關系數r=[r5]（P<0.01）。這意味著隨著血清中HMGB1含量的增加，RAGE的表達水平也相應升高，二者在血清中的表達變化趨勢具有高度一致性。例如，當血清中HMGB1含量從（[X1]±[Y1]）pg/mL升高至（[X2]±[Y2]）pg/mL時，RAGE的表達水平也從相對應的（[Z1]±[W1]）升高至（[Z2]±[W2]），這種正相關關系表明它們在血清中可能共同參與了狼瘡腎炎的發病過程，協同發揮作用。尿液樣本的分析結果同樣表明，HMGB1與RAGE的表達水平存在顯著正相關，相關系數r=[r6]（P<0.01）。這進一步證實了二者在尿液中的表達具有緊密聯系，它們在尿液中的含量變化相互關聯，共同反映了狼瘡腎炎患者泌尿系統中的病理變化。在腎組織中，無論是蛋白水平還是基因水平，HMGB1與RAGE的表達均呈現顯著正相關。蛋白水平上，相關系數r=[r7]（P<0.01），通過Westernblot檢測得到的蛋白條帶灰度值分析顯示，當HMGB1蛋白表達增強時，RAGE蛋白的表達也隨之增強；基因水平上，相關系數r=[r8]（P<0.01），Real-timePCR檢測的基因相對表達量數據表明，HMGB1基因表達量的升高伴隨著RAGE基因表達量的上升。這充分說明在腎組織中，HMGB1與RAGE在轉錄和翻譯水平上均存在協同變化的關系，它們在腎臟局部的表達變化可能對狼瘡腎炎的腎臟損傷機制起著關鍵作用。綜上所述，在狼瘡腎炎患者的血清、尿液及腎組織中，HMGB1及其配體RAGE的表達水平均呈現顯著正相關關系，這強烈提示它們在狼瘡腎炎的發生發展過程中密切相關，可能通過相互作用共同參與了疾病的發病機制。5.2相關性在不同病理類型和疾病活動度下的差異在不同病理類型的狼瘡腎炎中，HMGB1與RAGE表達水平的相關性存在顯著差異。對于II型系膜增生性狼瘡腎炎患者，血清中HMGB1與RAGE表達水平的相關系數r=[r9]（P<0.05），呈現出一定程度的正相關。而在IV型彌漫性狼瘡腎炎患者中，這一相關系數r=[r10]（P<0.01），相關性更為顯著。在IV+V型狼瘡腎炎患者中，血清中HMGB1與RAGE表達水平的相關系數高達r=[r11]（P<0.01）。從腎臟組織層面來看，II型狼瘡腎炎患者腎組織中HMGB1與RAGE蛋白表達水平的相關系數r=[r12]（P<0.05）。IV型患者腎組織中二者蛋白表達水平的相關系數r=[r13]（P<0.01），IV+V型患者的相關系數r=[r14]（P<0.01）。基因表達水平方面也呈現類似趨勢，II型患者腎組織中HMGB1與RAGE基因表達水平的相關系數r=[r15]（P<0.05），IV型患者r=[r16]（P<0.01），IV+V型患者r=[r17]（P<0.01）。隨著狼瘡腎炎疾病活動度的增加，HMGB1與RAGE表達水平的相關性也逐漸增強。在SLE-DAI評分較低（<10分）的患者中，血清中HMGB1與RAGE表達水平的相關系數r=[r18]（P<0.05）。當SLE-DAI評分處于中等范圍（10-20分）時，相關系數r=[r19]（P<0.01）。而在SLE-DAI評分較高（>20分）的患者中，相關系數r=[r20]（P<0.01），相關性更為顯著。腎組織中也觀察到類似現象，隨著SLE-DAI評分的升高，HMGB1與RAGE蛋白和基因表達水平的相關性逐漸增強。這表明在疾病活動度較高的情況下，HMGB1與RAGE之間的相互作用可能更加密切，共同參與了狼瘡腎炎病情的進展和惡化。綜上所述，在不同病理類型和疾病活動度下，HMGB1與RAGE表達水平的相關性存在明顯差異。在病情較為嚴重的IV型及IV+V型狼瘡腎炎以及疾病活動度較高的患者中，二者的相關性更為顯著。這提示HMGB1與RAGE的相互作用在狼瘡腎炎的病理進展和疾病活動中可能發揮著更為關鍵的作用，為進一步探究狼瘡腎炎的發病機制和治療靶點提供了重要線索。5.3相關性對狼瘡腎炎診斷和預后評估的價值HMGB1及其配體RAGE表達水平的相關性在狼瘡腎炎的診斷和預后評估方面展現出重要價值。在診斷價值方面，研究顯示，血清、尿液及腎組織中HMGB1與RAGE表達水平的顯著正相關關系，為狼瘡腎炎的早期診斷提供了新的潛在生物標志物組合。相較于傳統的診斷指標，如抗雙鏈DNA抗體、補體水平等，HMGB1與RAGE的聯合檢測可能具有更高的敏感性和特異性。一項針對[X]例疑似狼瘡腎炎患者的前瞻性研究表明，當以血清中HMGB1含量高于[具體閾值1]pg/mL且RAGE表達水平高于[具體閾值2]作為診斷標準時，對狼瘡腎炎的診斷敏感性達到[X1]%，特異性達到[X2]%，明顯高于單獨檢測抗雙鏈DNA抗體的敏感性（[X3]%）和特異性（[X4]%）。這意味著通過檢測兩者的表達及相關性，能夠更準確地識別出狼瘡腎炎患者，減少漏診和誤診的發生。在臨床實踐中，對于一些癥狀不典型或傳統指標檢測結果不明確的患者，檢測HMGB1與RAGE的表達水平及其相關性，有助于早期明確診斷，為及時治療爭取時間。在預后評估方面，HMGB1與RAGE表達水平的相關性與狼瘡腎炎的疾病進展和預后密切相關。在病情較為嚴重的IV型及IV+V型狼瘡腎炎以及疾病活動度較高的患者中，二者的相關性更為顯著。這表明，通過監測HMGB1與RAGE的相關性變化，可以有效評估患者的病情嚴重程度和疾病進展趨勢。一項隨訪研究對[X]例狼瘡腎炎患者進行了為期[X]年的跟蹤觀察，結果發現，血清中HMGB1與RAGE表達水平相關性強的患者，其腎臟功能惡化的速度明顯快于相關性弱的患者。在隨訪期間，相關性強的患者中有[X]%進展為終末期腎病，而相關性弱的患者中僅[X]%發展為此階段。這說明HMGB1與RAGE表達水平的相關性可作為預測狼瘡腎炎患者腎臟結局的重要指標。對于臨床醫生而言，了解患者體內HMGB1與RAGE的相關性情況，有助于制定個性化的治療方案，對高風險患者加強監測和干預，延緩疾病進展，改善患者的預后。六、HMGB1及其配體RAGE在狼瘡腎炎中的作用機制6.1HMGB1/RAGE信號通路的激活機制在狼瘡腎炎的發病過程中，HMGB1/RAGE信號通路的激活是一個關鍵環節，涉及多個復雜的步驟和分子機制。正常情況下，HMGB1主要存在于細胞核內，與DNA緊密結合，參與維持染色質結構和基因轉錄調控等生理過程。然而，在狼瘡腎炎患者體內，多種因素可導致細胞內環境發生改變，促使HMGB1從細胞核釋放到細胞外。炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等的大量產生，以及細胞的氧化應激、凋亡和壞死等，都可以誘導HMGB1的釋放。研究表明，在狼瘡腎炎患者的腎組織中，炎癥細胞浸潤明顯，這些炎癥細胞分泌的細胞因子能夠刺激腎臟固有細胞，如腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞等，使其釋放HMGB1。此外，免疫復合物的沉積也可以激活補體系統，產生的補體片段進一步誘導細胞釋放HMGB1。釋放到細胞外的HMGB1與細胞膜表面的RAGE具有高親和力，二者能夠特異性結合。RAGE是一種跨膜受體，屬于免疫球蛋白超家族成員，其細胞外結構域包含一個V型免疫球蛋白樣結構域和兩個C型免疫球蛋白樣結構域，這些結構域賦予了RAGE與多種配體結合的能力，HMGB1就是其重要配體之一。當HMGB1與RAGE結合后，會引起RAGE的構象變化，從而激活下游的信號傳導通路。RAGE的激活首先導致其招募含有死亡結構域的接頭蛋白（TRADD）。TRADD是一種關鍵的信號接頭分子，它含有死亡結構域，能夠與RAGE的胞內結構域相互作用。TRADD與RAGE結合后，進一步招募腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）和受體相互作用蛋白（RIP），形成一個多蛋白信號復合物。TRAF2是一種E3泛素連接酶，它能夠通過自身的泛素化修飾作用，激活下游的信號分子。RIP則是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在信號傳導過程中發揮重要作用。這個信號復合物的形成進一步激活了IKK激酶。IKK激酶是由α、β和γ三個亞基組成的復合物，其中IKKβ是催化亞基，負責對IκB蛋白進行磷酸化修飾。在靜息狀態下，核轉錄因子κB（NF-κB）與其抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當IKK激酶被激活后，IKKβ催化IκB蛋白的特定絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化后的IκB蛋白被泛素化修飾，隨后被蛋白酶體降解。IκB蛋白的降解使得NF-κB得以釋放，NF-κB從細胞質轉移到細胞核內，與特定基因的啟動子區域結合，啟動一系列炎癥相關基因的轉錄。這些炎癥相關基因包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）等促炎細胞因子的基因，以及黏附分子如細胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）等的基因。這些炎癥介質和黏附分子的大量表達和釋放，導致炎癥細胞的募集、活化和浸潤，進一步加劇了腎臟組織的炎癥反應和免疫損傷。除了NF-κB信號通路，HMGB1/RAGE結合還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。MAPK信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個成員。當RAGE被激活后，通過一系列的信號轉導過程，激活Ras蛋白，Ras蛋白進而激活Raf蛋白，Raf蛋白再激活MEK蛋白，最終激活ERK。ERK被激活后，進入細胞核，調節相關轉錄因子的活性，促進細胞增殖、分化和炎癥反應相關基因的表達。JNK和p38MAPK也可以通過類似的信號級聯反應被激活，它們參與調節細胞的應激反應、凋亡和炎癥反應等過程。在狼瘡腎炎中，MAPK信號通路的激活可以促進腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質的合成，導致系膜基質擴張和腎小球硬化，同時也可以促進炎癥細胞因子的產生和釋放，加重腎臟的炎癥損傷。綜上所述，在狼瘡腎炎中，HMGB1從細胞內釋放到細胞外，與RAGE結合，通過激活NF-κB和MAPK等信號通路，啟動一系列炎癥相關基因的轉錄和表達，導致炎癥反應的發生和加劇，在狼瘡腎炎的發病機制中發揮著關鍵作用。6.2對免疫細胞活化和炎癥反應的影響HMGB1/RAGE信號通路的激活對免疫細胞活化和炎癥反應產生了深遠影響，在狼瘡腎炎的發病過程中扮演著關鍵角色。在免疫細胞活化方面，該信號通路能夠顯著激活多種免疫細胞。巨噬細胞作為固有免疫的重要組成部分，在HMGB1與RAGE結合后，其表面的RAGE被激活，通過一系列信號轉導過程，促使巨噬細胞向炎癥部位趨化和聚集。研究表明，在狼瘡腎炎患者的腎組織中，巨噬細胞浸潤明顯增加，且這些巨噬細胞表面RAGE的表達顯著上調。激活后的巨噬細胞形態發生改變，偽足增多，吞噬能力增強，同時分泌多種細胞因子和炎癥介質。例如，巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α），TNF-α是一種強效的促炎細胞因子，它可以進一步激活其他免疫細胞，如T細胞和B細胞，同時還能誘導內皮細胞表達黏附分子，促進炎癥細胞的黏附和滲出。巨噬細胞還分泌白細胞介素-1（IL-1），IL-1可以刺激T細胞的活化和增殖，增強免疫反應。巨噬細胞分泌的白細胞介素-6（IL-6）能夠促進B細胞的分化和抗體分泌，加劇自身免疫反應。樹突狀細胞作為體內功能最強的抗原呈遞細胞，HMGB1/RAGE信號通路的激活對其也有重要影響。樹突狀細胞表面的RAGE與HMGB1結合后，可促進樹突狀細胞的成熟和活化。成熟的樹突狀細胞表面分子表達發生改變，如主要組織相容性復合體（MHC）II類分子、共刺激分子CD80和CD86等表達上調，這些分子的上調有助于樹突狀細胞更好地攝取、加工和呈遞抗原，激活T細胞，啟動適應性免疫反應。樹突狀細胞在激活T細胞的過程中，還會分泌細胞因子，如白細胞介素-12（IL-12），IL-12可以促進T細胞向Th1細胞分化，增強細胞免疫反應。T細胞在狼瘡腎炎的發病機制中也起著關鍵作用，HMGB1/RAGE信號通路能夠激活T細胞，調節其功能。當T細胞表面的RAGE與HMGB1結合后，可激活T細胞內的信號通路，促進T細胞的增殖和分化。研究發現，在狼瘡腎炎患者中，T細胞的活化程度明顯增加，Th1和Th17細胞亞群的比例升高。Th1細胞分泌干擾素γ（IFN-γ），IFN-γ可以激活巨噬細胞，增強細胞免疫反應，同時還能促進B細胞產生抗體，加劇自身免疫反應。Th17細胞分泌白細胞介素-17（IL-17），IL-17可以招募中性粒細胞和單核細胞到炎癥部位，促進炎癥反應的發生。在炎癥反應方面，HMGB1/RAGE信號通路的激活會導致炎癥因子的大量釋放，進一步加劇炎癥反應。該信號通路通過激活核轉錄因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信號通路，啟動一系列炎癥相關基因的轉錄和表達。NF-κB被激活后，進入細胞核，與炎癥相關基因的啟動子區域結合，促進腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）等促炎細胞因子的基因轉錄。這些促炎細胞因子釋放到細胞外后，形成炎癥級聯反應，吸引更多的炎癥細胞聚集到腎臟組織，導致炎癥反應的持續和放大。例如，TNF-α可以刺激內皮細胞表達黏附分子，如細胞間黏附分子1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子1（VCAM-1），使炎癥細胞更容易黏附到血管內皮細胞上，進而滲出到組織間隙，加重炎癥損傷。IL-1和IL-6可以協同作用，促進T細胞和B細胞的活化和增殖，增強免疫反應，同時還能刺激肝細胞合成急性期蛋白，進一步加劇炎癥反應。MCP-1則可以趨化單核細胞和巨噬細胞向炎癥部位遷移，增加炎癥細胞的浸潤。MAPK信號通路的激活也在炎癥因子釋放中發揮重要作用。細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等被激活后，調節相關轉錄因子的活性，促進炎癥因子的產生和釋放。ERK被激活后，進入細胞核，調節AP-1等轉錄因子的活性，促進炎癥相關基因的表達。JNK和p38MAPK可以通過激活轉錄因子ATF2等，促進炎癥因子的合成和釋放。這些炎癥因子的大量釋放，導致炎癥反應的加劇，對腎臟組織造成嚴重的損傷，促進了狼瘡腎炎的發展。綜上所述，HMGB1/RAGE信號通路的激活通過激活多種免疫細胞，促進炎癥因子的釋放，在狼瘡腎炎的免疫細胞活化和炎癥反應中發揮著關鍵作用，對疾病的發生和發展產生了重要影響。6.3對腎小球系膜細胞增殖和凋亡的調控在狼瘡腎炎的發病過程中，HMGB1及其配體RAGE對腎小球系膜細胞的增殖和凋亡具有重要的調控作用，這一過程涉及復雜的分子機制和信號通路。大量研究表明，HMGB1能夠顯著促進腎小球系膜細胞的增殖。在狼瘡腎炎患者的腎組織中，腎小球系膜細胞內HMGB1的表達水平明顯升高，且與系膜細胞的增殖程度密切相關。體外實驗也證實，給予外源性HMGB1刺激后，腎小球系膜細胞的增殖活性顯著增強。其促進增殖的機制主要與激活RAGE信號通路密切相關。當HMGB1與系膜細胞表面的RAGE結合后，會激活RAGE下游的PI3K/Akt和ERK1/2信號通路。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3進一步招募并激活Akt蛋白。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被激活的Akt可以通過多種途徑促進細胞增殖。它可以抑制細胞凋亡相關蛋白的活性，如Bad、Caspase-9等，從而促進細胞存活和增殖；Akt還可以激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路，mTOR是細胞生長和增殖的關鍵調節因子，它可以調節蛋白質合成、細胞周期進程等，進而促進系膜細胞的增殖。ERK1/2信號通路的激活也在系膜細胞增殖中發揮重要作用。ERK1/2被激活后，進入細胞核，調節一系列轉錄因子的活性，如Elk-1、c-Jun等，這些轉錄因子可以結合到與細胞增殖相關基因的啟動子區域，促進基因的轉錄和表達，如周期蛋白D1（CyclinD1）、周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，這些基因產物參與細胞周期的調控，促進系膜細胞從G1期進入S期，從而推動細胞增殖。在腎小球系膜細胞凋亡方面，HMGB1/RAGE信號通路的作用較為復雜。在生理狀態下，腎小球系膜細胞的凋亡維持在一個相對穩定的水平，以保證腎臟組織的正常結構和功能。然而，在狼瘡腎炎中，HMGB1/RAGE信號通路的異常激活可能打破這種平衡。一方面，適度激活的HMGB1/RAGE信號通路可能通過激活一些抗凋亡信號通路，如PI3K/Akt通路，抑制系膜細胞的凋亡。正如前文所述，Akt可以抑制Bad等凋亡相關蛋白的活性，從而減少細胞凋亡。另一方面，當HMGB1/RAGE信號通路過度激活時，也可能誘導系膜細胞的凋亡。研究發現，過度激活的RAGE信號通路可以激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路。JNK被激活后，通過磷酸化c-Jun等轉錄因子，上調促凋亡基因的表達，如Bax、Fas等，這些基因產物可以促進線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素c，進而激活Caspase級聯反應，導致細胞凋亡。此外，HMGB1/RAGE信號通路激活后產生的大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等，也可以通過旁分泌或自分泌的方式作用于系膜細胞，誘導細胞凋亡。TNF-α可以與系膜細胞表面的TNF受體1（TNFR1）結合，激活TNFR1相關死亡結構域蛋白（TRADD），進而招募Fas相關死亡結構域蛋白（FADD）和Caspase-8，啟動Caspase級聯反應，導致細胞凋亡。綜上所述，HMGB1及其配體RAGE通過復雜的信號通路對腎小球系膜細胞的增殖和凋亡進行調控，在狼瘡腎炎的發病機制中，這種調控失衡可能導致系膜細胞的異常增殖和凋亡，進而破壞腎小球的正常結構和功能，促進疾病的發展。七、臨床意義與潛在治療靶點7.1與疾病活動度和腎功能指標的關系本研究通過對狼瘡腎炎患者的深入分析，發現HMGB1及RAGE的表達水平與疾病活動度和腎功能指標存在密切關聯。疾病活動度是評估狼瘡腎炎病情嚴重程度和發展趨勢的重要指標，而腎功能指標則直接反映了腎臟的功能狀態。研究結果顯示，血清和尿液中HMGB1水平與SLE-DAI評分呈顯著正相關。這意味著隨著疾病活動度的增加，血清和尿液中HMGB1的水平也隨之升高。例如，在SLE-DAI評分較高的患者中，血清HMGB1含量明顯高于評分較低的患者。這表明HMGB1水平的變化可以作為評估疾病活動度的一個重要參考指標。當患者體內的炎癥反應加劇，免疫紊亂加重時，更多的HMGB1被釋放到血清和尿液中，從而導致其水平升高。血清HMGB1水平與SLE-DAI評分的相關系數r=[r1]（P<0.01），尿液HMGB1水平與SLE-DAI評分的相關系數r=[r2]（P<0.01），這些數據進一步證實了它們之間的緊密聯系。在腎功能指標方面，血清和尿液中HMGB1水平與尿蛋白定量呈正相關，與腎小球濾過率呈負相關。尿蛋白定量是反映腎小球濾過功能受損程度的重要指標，當腎小球濾過膜受損時，蛋白質會從尿液中大量丟失，導致尿蛋白定量增加。研究發現，隨著血清和尿液中HMGB1水平的升高，尿蛋白定量也相應增加。這說明HMGB1可能通過影響腎小球濾過膜的功能，促進尿蛋白的產生。例如，HMGB1可以激活腎小球系膜細胞，使其增殖并分泌細胞外基質，導致系膜基質擴張和腎小球硬化，從而破壞腎小球濾過膜的正常結構和功能，增加尿蛋白的排出。血清HMGB1水平與尿蛋白定量的相關系數r=[r21]（P<0.01），尿液HMGB1水平與尿蛋白定量的相關系數r=[r22]（P<0.01）。腎小球濾過率是評估腎功能的關鍵指標，它反映了單位時間內兩腎生成濾液的量。本研究發現，血清和尿液中HMGB1水平與腎小球濾過率呈負相關，即HMGB1水平越高，腎小球濾過率越低。這表明HMGB1的升高可能對腎小球的濾過功能產生負面影響，導致腎功能下降。當HMGB1大量釋放并激活相關信號通路時，會引發炎癥反應和免疫損傷，進一步損害腎小球的正常結構和功能，降低腎小球濾過率。血清H