HLA-E在肝細胞性肝癌中的表達特征、作用機制及預后價值研究一、引言1.1研究背景與意義肝細胞性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）作為一種常見且惡性程度高的原發性肝癌類型，嚴重威脅著人類的健康。據統計，全球每年肝癌新發病例超過80萬，死亡病例約78萬，而HCC在其中占據了相當大的比例。在中國，由于乙肝病毒（HBV）感染的高流行率等因素，肝癌的發病率和死亡率一直居高不下。HCC起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術切除等根治性治療的機會，5年生存率僅為12%-18%。而且，HCC具有易復發和轉移的特點，即使接受了手術切除、肝移植等治療，術后復發率仍較高，這進一步降低了患者的生存質量和生存期，給患者家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔和精神壓力。腫瘤免疫逃逸是腫瘤發生、發展過程中的關鍵環節，它使得腫瘤細胞能夠逃避機體免疫系統的監視和攻擊，從而得以持續生長和擴散。在腫瘤免疫逃逸機制的研究中，人類白細胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）系統起著至關重要的作用。HLA分子參與抗原提呈過程，將腫瘤抗原呈遞給T淋巴細胞，激活機體的抗腫瘤免疫反應。其中，HLA-E作為非經典的HLAⅠ類分子，其獨特的結構和功能使其在腫瘤免疫逃逸中扮演著特殊的角色。HLA-E主要表達于胎盤、內皮細胞、淋巴細胞等，其表達水平受到多種因素的調控。在腫瘤微環境中，HLA-E的表達變化與腫瘤細胞的免疫逃逸密切相關。一方面，HLA-E可以與自然殺傷細胞（naturalkillercell，NK細胞）表面的抑制性受體CD94/NKG2A結合，傳遞抑制信號，抑制NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性；另一方面，HLA-E還可能影響T淋巴細胞的活化和功能，進一步削弱機體的抗腫瘤免疫反應。深入研究HLA-E在HCC中的表達情況，有助于揭示HCC免疫逃逸的分子機制，為開發新的免疫治療策略提供理論依據。通過對HLA-E表達調控機制的研究，可以尋找潛在的治療靶點，設計針對HLA-E的靶向治療藥物，打破腫瘤免疫逃逸，增強機體對HCC的免疫監視和殺傷能力。此外，HLA-E的表達水平還可能作為HCC預后判斷的生物標志物。通過檢測HCC患者腫瘤組織或血液中HLA-E的表達，能夠更準確地評估患者的預后情況，為臨床治療方案的選擇提供參考。例如，對于HLA-E高表達的患者，提示其腫瘤免疫逃逸能力較強，預后可能較差，臨床醫生可以據此制定更積極的治療方案，如聯合免疫治療等；而對于HLA-E低表達的患者，則可以根據其他因素選擇更合適的治療方法，避免過度治療。因此，研究HLA-E在HCC中的表達及預后意義具有重要的臨床價值和現實意義。1.2研究目的與內容本研究旨在深入探究HLA-E在肝細胞性肝癌（HCC）中的表達水平、分布特征，分析其與HCC患者臨床病理參數及預后之間的關系，并初步探討HLA-E在HCC發生、發展過程中的作用機制，為HCC的免疫治療提供新的靶點和理論依據。具體研究內容如下：檢測HLA-E在HCC組織及癌旁組織中的表達：收集HCC患者手術切除的腫瘤組織及相應癌旁組織標本，運用免疫組織化學染色（IHC）、蛋白質免疫印跡法（Westernblotting）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）等技術，從蛋白和mRNA水平檢測HLA-E的表達情況，比較HLA-E在HCC組織與癌旁組織中的表達差異，分析其表達差異與HCC臨床病理特征（如腫瘤大小、分化程度、TNM分期、血管侵犯等）之間的相關性。分析HLA-E表達與HCC患者預后的關系：通過對HCC患者進行長期隨訪，收集患者的生存數據，運用統計學方法分析HLA-E表達水平與患者總生存期（OS）、無病生存期（DFS）等預后指標之間的關系，構建生存曲線，評估HLA-E作為HCC預后生物標志物的價值。同時，結合其他臨床病理因素，采用多因素分析方法，確定影響HCC患者預后的獨立危險因素。探討HLA-E在HCC免疫逃逸中的作用機制：利用體外細胞實驗，選取HCC細胞系，通過基因轉染技術上調或下調HCC細胞中HLA-E的表達，研究其對NK細胞、T淋巴細胞等免疫細胞功能的影響，包括免疫細胞的增殖、活化、細胞毒性等方面。采用流式細胞術、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、細胞共培養等實驗方法，檢測免疫細胞表面相關受體的表達變化以及細胞因子的分泌水平，探討HLA-E與免疫細胞表面受體之間的相互作用機制，揭示HLA-E在HCC免疫逃逸過程中的具體作用途徑。本研究的創新點在于綜合運用多種技術手段，從臨床標本、細胞水平全面研究HLA-E在HCC中的表達及預后意義，并深入探討其作用機制。以往的研究大多僅關注HLA-E在腫瘤組織中的表達情況，缺乏對其與臨床病理參數及預后關系的系統分析，且在作用機制研究方面不夠深入。本研究不僅能夠為HCC的預后評估提供新的生物標志物，還可能為HCC的免疫治療開辟新的方向，具有重要的理論和實踐意義。二、肝細胞性肝癌概述2.1肝細胞性肝癌的流行病學特征肝細胞性肝癌（HCC）是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。在全球癌癥負擔中，肝癌占據著重要地位。據國際癌癥研究機構（IARC）發布的全球癌癥統計數據顯示，2020年全球肝癌新發病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例，分別位居惡性腫瘤發病和死亡的第6位和第3位。而HCC在原發性肝癌中占比高達80%-90%，是肝癌的主要病理類型。在全球范圍內，HCC的發病率存在明顯的地區差異。東亞和非洲撒哈拉以南地區是HCC的高發區。例如，中國作為人口大國，同時也是HCC的高發國家。據國家癌癥中心數據顯示，2020年中國肝癌新發病例約41萬例，死亡病例約39.1萬例，新發病例和死亡病例均占全球肝癌病例的一半左右。在我國，肝癌發病率男性高于女性，男女發病比例約為2-3:1。從年齡分布來看，HCC可發生于各個年齡段，但以中老年人為主，發病高峰年齡在40-60歲。近年來，全球HCC的發病率總體呈現出一定的變化趨勢。在過去的幾十年里，部分國家和地區由于乙肝疫苗的廣泛接種、抗病毒治療的普及以及公共衛生條件的改善，HCC的發病率有所下降。然而，在一些地區，HCC的發病率仍在上升，或者下降趨勢不明顯。例如，在美國，盡管整體癌癥死亡率呈下降趨勢，但HCC的發病率卻在過去幾十年中持續上升。在我國，雖然通過乙肝疫苗接種等預防措施，乙肝病毒感染率有所下降，但由于人口老齡化、肥胖、糖尿病等因素的影響，HCC的發病率并未出現明顯的下降趨勢，甚至在部分地區有上升的跡象。肝癌發病率上升的原因是多方面的。首先，乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染仍然是HCC的主要病因。雖然乙肝疫苗的接種在一定程度上控制了HBV的傳播，但全球仍有大量的HBV和HCV感染者，這些慢性感染者是HCC的高危人群。隨著時間的推移，部分感染者會逐漸發展為肝硬化，進而演變為HCC。其次，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的發病率近年來急劇上升，已成為全球范圍內HCC的重要危險因素。NAFLD與肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病等密切相關，其發病機制涉及胰島素抵抗、氧化應激、炎癥反應等多個方面。NAFLD患者的肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化程度逐漸加重，增加了HCC的發病風險。此外，長期酗酒、黃曲霉毒素污染、遺傳因素等也在HCC的發病中起到重要作用。長期酗酒可導致酒精性肝病，進而發展為肝硬化和HCC。黃曲霉毒素是一種強致癌物質，常見于霉變的糧食和堅果中，長期攝入可增加HCC的發病風險。遺傳因素使得某些個體對HCC具有更高的易感性，家族中有肝癌病史的人群，其發病風險明顯高于普通人群。2.2肝細胞性肝癌的發病機制肝細胞性肝癌（HCC）的發病是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及多種致癌因素和分子機制的相互作用。目前認為，HBV、HCV感染，肝硬化，黃曲霉毒素暴露，長期酗酒，遺傳因素等在HCC的發生發展中起著關鍵作用。HBV和HCV感染是HCC最主要的病因。全球約50%-80%的HCC患者與HBV感染相關，在我國這一比例更高。HBV是一種雙鏈DNA病毒，其基因組可整合到宿主肝細胞基因組中，導致基因表達紊亂。HBx蛋白是HBV編碼的一種多功能蛋白，它可以通過多種途徑促進肝癌的發生發展。HBx蛋白能夠干擾細胞周期調控，使肝細胞異常增殖。它還可以激活多種信號通路，如NF-κB、MAPK等，這些信號通路的激活與細胞增殖、抗凋亡、血管生成等過程密切相關。此外，HBx蛋白還能抑制p53等抑癌基因的功能，導致細胞對DNA損傷的修復能力下降，增加基因突變的風險。HCV是一種單鏈RNA病毒，其感染導致肝癌的機制主要與持續的肝臟炎癥和氧化應激有關。HCV核心蛋白可以激活NF-κB信號通路，誘導炎癥因子的表達，引發肝臟慢性炎癥。炎癥微環境中的細胞因子和活性氧（ROS）等物質會損傷肝細胞DNA，導致基因突變和細胞轉化。HCV還可以通過干擾胰島素信號通路，引起代謝紊亂，進一步促進肝癌的發生。肝硬化是HCC發生的重要危險因素，約70%-90%的HCC患者合并有肝硬化。肝硬化是肝臟長期受損后，纖維組織增生和肝細胞結節狀再生導致肝臟正常結構和功能破壞的病理狀態。在肝硬化過程中，肝臟微環境發生改變，如細胞外基質重塑、血管生成增加等，為肝癌細胞的生長提供了有利條件。同時，肝硬化患者肝細胞的增殖和凋亡失衡，肝細胞在不斷修復損傷的過程中容易發生基因突變，進而發展為肝癌。例如，在肝硬化肝臟中，轉化生長因子β（TGF-β）信號通路異常激活，TGF-β可以促進肝星狀細胞活化，導致細胞外基質過度沉積，同時抑制肝細胞的增殖和分化，使肝細胞更容易發生惡性轉化。此外，肝硬化時肝臟的免疫監視功能下降，無法有效清除發生突變的肝細胞，也為肝癌的發生創造了機會。黃曲霉毒素是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產生的一類強致癌物質，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性和致癌性最強。長期攝入被AFB1污染的食物是HCC的重要危險因素之一，尤其在非洲和亞洲部分地區，食物黃曲霉毒素污染較為嚴重，HCC的發病率也相對較高。AFB1進入人體后，在肝臟細胞色素P450酶的作用下代謝為具有活性的環氧化物，該環氧化物可與DNA分子中的鳥嘌呤殘基結合，形成AFB1-DNA加合物。這種加合物會導致DNA復制錯誤，引起基因突變，特別是p53基因的突變。p53基因是一種重要的抑癌基因，其突變會使細胞失去對增殖和凋亡的正常調控，從而促進肝癌的發生。研究表明，在一些HCC高發地區，HCC患者腫瘤組織中p53基因第249密碼子的突變頻率明顯升高，且與AFB1暴露密切相關。長期酗酒也是HCC的重要危險因素之一。酒精在肝臟代謝過程中，主要通過乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的作用轉化為乙醛，再進一步代謝為乙酸。乙醛是一種有毒物質，它可以與蛋白質、DNA等生物大分子結合，形成加合物，導致細胞損傷和基因突變。長期酗酒還會引起肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化，逐漸發展為酒精性肝硬化，進而增加HCC的發病風險。酒精性肝病時，肝臟內的氧化應激水平升高，ROS大量產生，這些ROS會損傷肝細胞的細胞膜、線粒體等細胞器，破壞細胞的正常結構和功能。同時，ROS還可以激活NF-κB等炎癥信號通路，促進炎癥因子的表達，加劇肝臟炎癥和纖維化。此外，酒精還可能影響肝臟的免疫功能，抑制機體對腫瘤細胞的免疫監視和殺傷作用。遺傳因素在HCC的發病中也起著一定的作用。家族中有肝癌病史的人群，其患HCC的風險明顯高于普通人群。遺傳因素導致HCC易感性增加的機制主要與遺傳基因的突變或多態性有關。一些基因的突變或多態性會影響肝臟對致癌物質的代謝和解毒能力，或者影響細胞的生長、增殖、凋亡等過程，從而增加肝癌的發病風險。例如，細胞色素P4502E1（CYP2E1）基因的多態性與酒精代謝和肝癌易感性相關。CYP2E1是參與酒精代謝的關鍵酶，其基因多態性會影響酶的活性，導致個體對酒精的代謝能力不同。具有某些CYP2E1基因多態性的個體，酒精代謝產生的乙醛在體內蓄積，增加了肝細胞損傷和癌變的風險。此外，一些抑癌基因和癌基因的遺傳突變也可能導致HCC的發生，如RB1、APC等基因的突變。這些基因的突變會使細胞的生長調控機制失衡，促進肝癌細胞的增殖和轉移。綜上所述，HCC的發病機制是一個復雜的網絡，多種因素相互作用，通過不同的分子機制導致肝細胞的惡性轉化和腫瘤的發生發展。深入研究這些發病機制，對于HCC的早期預防、診斷和治療具有重要的理論和實踐意義。2.3肝細胞性肝癌的臨床診斷與治療現狀肝細胞性肝癌（HCC）的早期診斷對于提高患者的生存率和預后至關重要。目前，臨床常用的診斷方法包括血清學檢測、影像學檢查和病理組織學檢查。血清學檢測中，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是應用最為廣泛的肝癌腫瘤標志物。AFP是一種糖蛋白，主要由胎兒肝細胞及卵黃囊合成。在成人中，AFP水平升高常見于HCC患者，其診斷HCC的靈敏度和特異度分別約為40%-65%和80%-94%。然而，AFP水平升高也可見于其他情況，如妊娠、活動性肝病、生殖腺胚胎源性腫瘤等，因此其診斷價值存在一定局限性。除AFP外，異常凝血酶原（des-γ-carboxyprothrombin，DCP）、高爾基體蛋白73（Golgiprotein73，GP73）等血清標志物也逐漸應用于HCC的診斷。DCP是一種異常的凝血酶原，在HCC患者中其水平常明顯升高，與AFP聯合檢測可提高HCC的診斷準確性。GP73是一種高爾基體跨膜蛋白，在肝癌組織中高表達，其診斷HCC的靈敏度和特異度與AFP相當，且在AFP陰性的HCC患者中具有一定的診斷價值。影像學檢查在HCC的診斷中起著關鍵作用。超聲檢查（ultrasonography，US）是一種無創、便捷、經濟的檢查方法，可作為HCC篩查的首選方法。通過US檢查，可發現肝臟內的占位性病變，并初步判斷其大小、形態、位置等。對于直徑≥1cm的肝癌結節，US的檢出率較高，但對于較小的結節或位于肝臟深部的病變，其靈敏度相對較低。增強超聲（contrast-enhancedultrasonography，CEUS）通過注射超聲造影劑，可提高肝臟病變的檢出率和診斷準確性，能夠更準確地觀察病變的血流灌注情況，有助于鑒別肝臟良惡性腫瘤。計算機斷層掃描（computedtomography，CT）和磁共振成像（magneticresonanceimaging，MRI）是HCC診斷和分期的重要影像學手段。CT檢查具有較高的空間分辨率，能夠清晰顯示肝臟的解剖結構和病變形態，增強CT掃描可觀察病變的動脈期、門靜脈期和延遲期的強化特征，典型的HCC表現為“快進快出”，即動脈期明顯強化，門靜脈期和延遲期強化程度迅速減退，這對于HCC的診斷具有重要意義。MRI檢查對軟組織的分辨力較高，能夠提供更多的肝臟病變信息，如腫瘤的內部結構、有無包膜等。MRI還可通過多種功能成像技術，如擴散加權成像（diffusion-weightedimaging，DWI）、磁共振波譜分析（magneticresonancespectroscopy，MRS）等，進一步提高HCC的診斷準確性。DWI可反映組織內水分子的擴散運動情況，HCC組織由于細胞密度高，水分子擴散受限，在DWI圖像上表現為高信號；MRS則可分析組織內代謝物的含量和變化，有助于鑒別肝臟病變的性質。此外，正電子發射斷層顯像-計算機斷層掃描（positronemissiontomography-computedtomography，PET-CT）在HCC的診斷中也有一定的應用價值，特別是對于檢測肝癌的遠處轉移具有較高的靈敏度。PET-CT通過檢測腫瘤細胞對放射性核素標記的葡萄糖的攝取情況，來判斷病變的性質和有無轉移，但由于其價格昂貴，且對小肝癌的診斷靈敏度有限，目前主要用于HCC患者的分期評估和尋找遠處轉移灶。病理組織學檢查是HCC診斷的金標準。通過肝穿刺活檢獲取肝臟組織標本，進行病理切片和染色，在顯微鏡下觀察組織細胞的形態、結構和分化程度等特征，從而明確診斷。病理組織學檢查不僅能夠確診HCC，還可對腫瘤進行病理分級，評估腫瘤的惡性程度，為臨床治療提供重要依據。然而，肝穿刺活檢屬于有創檢查，存在一定的風險，如出血、感染、腫瘤種植轉移等，因此在臨床應用中需要嚴格掌握適應證。對于一些影像學檢查高度懷疑為HCC，且符合臨床診斷標準的患者，可不進行肝穿刺活檢，直接進行治療。HCC的治療方法多樣，主要包括手術治療、局部治療、全身治療等，具體治療方案應根據患者的腫瘤分期、肝功能狀況、身體狀況等因素綜合考慮，制定個體化的治療方案。手術治療是HCC患者獲得根治的主要方法，包括肝切除術和肝移植術。肝切除術適用于腫瘤單發、局限于肝臟一葉，且肝功能良好的患者。根據腫瘤的大小和位置，可選擇部分肝切除、肝段切除、肝葉切除等不同的手術方式。手術切除的關鍵在于完整切除腫瘤，同時保留足夠的正常肝組織，以維持肝臟的正常功能。對于符合手術指征的患者，肝切除術可顯著提高患者的生存率，5年生存率可達30%-70%。肝移植術是將病變的肝臟切除，植入健康的肝臟，適用于肝功能嚴重受損、合并肝硬化且腫瘤符合米蘭標準（單個腫瘤直徑≤5cm；或腫瘤數目≤3個，最大直徑≤3cm，無血管侵犯和肝外轉移）的患者。肝移植不僅可以切除腫瘤，還能治療肝硬化，從根本上解決肝臟功能問題。肝移植患者的5年生存率可達70%左右，但由于供體短缺、手術費用高昂、術后免疫排斥反應等問題，限制了其廣泛應用。局部治療主要包括射頻消融（radiofrequencyablation，RFA）、微波消融（microwaveablation，MWA）、經動脈化療栓塞（transarterialchemoembolization，TACE）等。RFA和MWA是通過熱消融的原理，利用射頻電流或微波產生的熱量使腫瘤組織凝固性壞死，從而達到治療目的。這兩種方法適用于腫瘤直徑≤5cm，尤其是直徑≤3cm的小肝癌患者，對于不能耐受手術或拒絕手術的患者也是一種有效的治療選擇。RFA和MWA具有創傷小、恢復快、并發癥少等優點，其治療效果與手術切除相當，對于小肝癌患者的5年生存率可達40%-60%。TACE是將化療藥物和栓塞劑混合后注入肝動脈，使腫瘤組織缺血缺氧壞死，同時化療藥物在腫瘤局部緩慢釋放，發揮化療作用。TACE主要適用于無法手術切除的中晚期肝癌患者，對于肝功能較好、腫瘤血供豐富的患者療效較好。TACE可反復進行，能夠有效控制腫瘤生長，延長患者生存期，但長期應用可能導致肝功能損害、腫瘤耐藥等問題。全身治療主要包括化療、靶向治療和免疫治療。傳統化療藥物如多柔比星、順鉑等對HCC的療效有限，且副作用較大，目前已較少單獨應用。靶向治療是近年來HCC治療的重要進展，通過針對腫瘤細胞表面的特定靶點，阻斷腫瘤細胞的生長、增殖和轉移信號通路，從而發揮抗腫瘤作用。索拉非尼是第一個被批準用于晚期HCC治療的靶向藥物，它可以抑制血管內皮生長因子受體（VEGFR）、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）等多個靶點，阻斷腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖。索拉非尼能夠延長晚期HCC患者的總生存期，但其有效率相對較低，且部分患者會出現耐藥。近年來，越來越多的靶向藥物如侖伐替尼、瑞戈非尼、阿帕替尼等相繼被批準用于HCC的治療，為患者提供了更多的選擇。免疫治療是利用機體自身的免疫系統來識別和殺傷腫瘤細胞，具有獨特的作用機制和良好的療效。免疫檢查點抑制劑如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等通過阻斷免疫檢查點蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，解除腫瘤細胞對免疫系統的抑制，激活T淋巴細胞等免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫反應。免疫治療在晚期HCC患者中顯示出較好的療效和安全性，可顯著延長患者的生存期，提高患者的生活質量。目前，免疫治療聯合靶向治療或其他治療方法已成為晚期HCC治療的重要策略，多項臨床試驗正在進行中，有望進一步提高HCC的治療效果。三、HLA-E的生物學特性3.1HLA-E的結構與功能人類白細胞抗原E（HLA-E）屬于非經典的HLAⅠ類分子，在免疫系統中發揮著獨特且關鍵的作用。HLA-E基因定位于人類第6號染色體短臂（6p21.3），處于HLA-A和HLA-C座位之間，其基因包含3個Ah元件和8個外顯子。這8個外顯子分別編碼HLA-E分子不同的功能區域，包括約21個氨基酸組成的信號肽，約90個氨基酸的α1區，約92個氨基酸的α2區，約92個氨基酸的α3區，約30個氨基酸的跨膜區以及約25個氨基酸的胞外區。從分子結構來看，HLA-E分子由一條重鏈（α鏈）和一條輕鏈（β2微球蛋白，β2m）非共價結合而成。α鏈包含α1、α2和α3三個結構域，其中α1和α2結構域共同構成了抗原肽結合槽，該結合槽主要容納長度為8-10個氨基酸的抗原肽。與經典HLAⅠ類分子相比，HLA-E的抗原肽結合槽相對保守，多態性較低，目前僅發現5種多態性，分別記為E0101、E0102、E01031、E01032、E0104，這些多態性主要體現在83、107、157等位點的氨基酸差異上。雖然這些多態性在功能上的具體意義尚未完全明確，但研究表明，不同的多態性可能會影響HLA-E分子與抗原肽的結合親和力以及與受體的相互作用。α3結構域則與β2m結合，對維持HLA-E分子的穩定性和結構完整性起著重要作用。β2m不含有跨膜區和胞內區，它通過與α3結構域相互作用，穩定HLA-E分子的構象，促進HLA-E分子在細胞表面的表達。HLA-E的主要功能之一是參與抗原呈遞過程。HLA-E所提呈的抗原肽主要來源于經典HLAⅠ類分子（如HLA-A、HLA-B、HLA-C）及某些HLA-G亞類分子的信號肽。這些信號肽被轉運至內質網后，與新合成的HLA-E分子結合，形成穩定的HLA-E/抗原肽復合物，隨后該復合物被轉運至細胞表面，供免疫細胞識別。例如，在病毒感染細胞或腫瘤細胞中，細胞內的抗原加工機制會將病毒抗原或腫瘤抗原降解為短肽，其中一些短肽可以與HLA-E分子結合，形成HLA-E/抗原肽復合物。這種復合物可以被自然殺傷細胞（NK細胞）和CD8+T細胞表面的受體識別，從而激活免疫細胞的功能。HLA-E在免疫調節中也扮演著重要角色，其主要通過與NK細胞表面的CD94/NKG2類受體結合來發揮作用。CD94/NKG2類受體包括CD94/NKG2A、CD94/NKG2C等，其中CD94/NKG2A是一種抑制性受體，而CD94/NKG2C是一種激活性受體。當HLA-E與CD94/NKG2A結合時，會向NK細胞傳遞抑制性信號，抑制NK細胞的殺傷活性，使表達HLA-E的細胞逃避NK細胞的攻擊。這一機制在維持機體免疫耐受和免疫平衡方面具有重要意義。在正常生理狀態下，機體自身細胞表面表達的HLA-E與NK細胞表面的CD94/NKG2A結合，防止NK細胞對自身細胞的過度殺傷。然而，在腫瘤發生發展過程中，腫瘤細胞可能會上調HLA-E的表達，利用這一機制逃避NK細胞的免疫監視和殺傷。相反，當HLA-E與CD94/NKG2C結合時，則會向NK細胞傳遞激活性信號，增強NK細胞的殺傷活性。這種雙重調節機制使得HLA-E能夠根據機體的免疫狀態，精確調節NK細胞的功能，維持免疫系統的穩定。此外，HLA-E還可以通過與CD8+T細胞表面的T細胞受體（TCR）相互作用，激活CD8+T細胞，介導細胞免疫應答。HLA-E限制性CD8+T細胞在感染性疾病中發揮著重要作用，它們可以識別并殺傷被病原體感染的細胞，增強機體的適應性免疫應答。3.2HLA-E的表達調控機制HLA-E的表達調控是一個復雜且精細的過程，涉及轉錄、轉錄后及翻譯后等多個水平，這些調控機制共同維持著HLA-E在細胞內的穩態，并對其在免疫調節中的功能發揮至關重要的作用。在轉錄水平，HLA-E基因的表達受到多種轉錄因子的調控。其中，核因子κB（NF-κB）是一種重要的轉錄調節因子。在炎癥或病毒感染等刺激下，細胞內的信號通路被激活，促使NF-κB從細胞質轉位到細胞核，與HLA-E基因啟動子區域的特定序列結合，從而增強HLA-E基因的轉錄。研究表明，在病毒感染的細胞中，病毒蛋白可以激活NF-κB信號通路，上調HLA-E的表達，這可能是病毒逃避機體免疫監視的一種機制。干擾素調節因子（IRF）家族成員也參與了HLA-E轉錄水平的調控。IRF-1和IRF-2是最早被發現與HLA-E轉錄調控相關的IRF家族成員。IRF-1可以與HLA-E基因啟動子區域的干擾素刺激反應元件（ISRE）結合，促進HLA-E基因的轉錄，而IRF-2則在一定程度上抑制HLA-E的轉錄。在IFN-γ刺激下，IRF-1被激活，與ISRE結合，啟動HLA-E基因的轉錄，從而上調HLA-E在細胞表面的表達。此外，一些細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）也可以通過激活相關的信號通路，影響轉錄因子與HLA-E基因啟動子的結合，進而調控HLA-E的轉錄。TNF-α可以激活MAPK信號通路，使相關轉錄因子磷酸化，增強其與HLA-E基因啟動子的親和力，促進轉錄。轉錄后水平的調控主要涉及mRNA的穩定性和翻譯效率。HLA-EmRNA的穩定性受到多種因素的影響。例如，一些RNA結合蛋白可以與HLA-EmRNA結合，調節其穩定性。HuR是一種廣泛表達的RNA結合蛋白，它可以與HLA-EmRNA的3'非翻譯區（3'UTR）結合，抑制mRNA的降解，從而提高HLA-EmRNA的穩定性。研究發現，在某些腫瘤細胞中，HuR的表達上調，導致HLA-EmRNA的穩定性增加，進而使HLA-E的表達水平升高。微小RNA（miRNA）也在HLA-E轉錄后調控中發揮作用。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，它們可以通過與靶mRNA的互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解。已有研究表明，一些miRNA如miR-148a等可以靶向HLA-EmRNA，通過抑制其翻譯過程，降低HLA-E的表達水平。在乳腺癌細胞中，miR-148a的過表達可以顯著降低HLA-E的蛋白表達，同時不影響HLA-EmRNA的水平，說明miR-148a是在轉錄后水平抑制HLA-E的表達。翻譯后水平的調控主要包括蛋白質的修飾和加工。HLA-E分子在翻譯后需要經過一系列的修飾和加工過程，才能形成具有功能的成熟分子。糖基化是HLA-E分子翻譯后修飾的重要方式之一。HLA-E分子的α鏈上存在多個糖基化位點，糖基化修飾可以影響HLA-E分子的穩定性、構象以及與其他分子的相互作用。研究表明，缺乏糖基化修飾的HLA-E分子在細胞內的穩定性降低，容易被降解，從而影響其在細胞表面的表達。此外，HLA-E分子的磷酸化修飾也可能對其功能產生影響。雖然目前關于HLA-E磷酸化修飾的研究較少，但已有研究發現，在某些細胞刺激條件下，HLA-E分子可以發生磷酸化，其具體的生物學意義還有待進一步深入研究。泛素化修飾在蛋白質降解和細胞內信號傳導中起著重要作用。HLA-E分子也可能受到泛素化修飾的調控，泛素化修飾后的HLA-E分子可能被蛋白酶體識別并降解，從而調節細胞內HLA-E的水平。3.3HLA-E在免疫系統中的作用HLA-E在免疫系統中扮演著關鍵角色，對NK細胞和T細胞的功能具有重要影響，同時參與了腫瘤細胞的免疫逃逸過程。NK細胞作為固有免疫系統的重要組成部分，能夠識別并殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞，在機體的免疫防御中發揮著重要作用。HLA-E主要通過與NK細胞表面的CD94/NKG2類受體相互作用，調節NK細胞的活性。CD94/NKG2A是NK細胞表面的抑制性受體，當HLA-E與CD94/NKG2A結合時，會向NK細胞傳遞抑制性信號，抑制NK細胞的殺傷活性。這種抑制作用的分子機制涉及到細胞內的信號傳導通路。CD94/NKG2A與HLA-E結合后，會招募含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。這些磷酸酶被招募到受體附近后，會對下游信號分子進行去磷酸化修飾，從而阻斷NK細胞活化信號的傳導，抑制NK細胞的殺傷功能。在正常生理狀態下，機體自身細胞表面表達的HLA-E與NK細胞表面的CD94/NKG2A結合，維持NK細胞的免疫耐受，避免NK細胞對自身細胞的過度殺傷。然而，在腫瘤發生發展過程中，腫瘤細胞常常會上調HLA-E的表達，利用這一機制逃避NK細胞的免疫監視和殺傷。研究發現，在多種腫瘤細胞系中，如乳腺癌細胞系、肺癌細胞系等，HLA-E的表達水平明顯升高，且與NK細胞的殺傷活性呈負相關。通過基因沉默技術下調腫瘤細胞中HLA-E的表達，可以增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。此外，CD94/NKG2C是NK細胞表面的激活性受體，雖然HLA-E與CD94/NKG2C的親和力較低，但在某些情況下，如病毒感染或腫瘤微環境中，HLA-E與CD94/NKG2C的結合可以向NK細胞傳遞激活性信號，增強NK細胞的殺傷活性。這種雙重調節機制使得HLA-E能夠根據機體的免疫狀態，精確調節NK細胞的功能，維持免疫系統的穩定。T細胞在適應性免疫應答中發揮著核心作用，可分為CD4+T細胞和CD8+T細胞。HLA-E對T細胞功能的影響主要體現在CD8+T細胞方面。HLA-E可以提呈抗原肽給CD8+T細胞表面的T細胞受體（TCR）識別，從而激活CD8+T細胞，介導細胞免疫應答。HLA-E所提呈的抗原肽主要來源于經典HLAⅠ類分子及某些HLA-G亞類分子的信號肽。這些抗原肽與HLA-E分子結合形成復合物后，被轉運至細胞表面，供CD8+T細胞識別。HLA-E限制性CD8+T細胞在感染性疾病中發揮著重要作用。在病毒感染過程中，病毒抗原被加工處理成抗原肽，與HLA-E分子結合，形成HLA-E/抗原肽復合物。CD8+T細胞通過TCR識別該復合物后，被激活并增殖分化為細胞毒性T淋巴細胞（CTL）。CTL可以特異性地殺傷被病毒感染的細胞，清除病毒感染，增強機體的適應性免疫應答。研究表明，在乙肝病毒感染患者中，HLA-E限制性CD8+T細胞能夠識別并殺傷被乙肝病毒感染的肝細胞，對控制乙肝病毒感染具有重要意義。此外，在腫瘤免疫中，HLA-E也可能提呈腫瘤抗原肽給CD8+T細胞，激活抗腫瘤免疫應答。然而，腫瘤細胞可能通過多種機制干擾HLA-E的抗原提呈功能，如下調HLA-E的表達、改變抗原肽的加工和提呈途徑等，從而逃避T細胞的免疫監視。免疫逃逸是腫瘤細胞逃避機體免疫系統攻擊的重要機制，HLA-E在其中發揮著關鍵作用。腫瘤細胞通過上調HLA-E的表達，與NK細胞表面的CD94/NKG2A結合，抑制NK細胞的殺傷活性，從而逃避NK細胞的免疫監視。如在肝癌細胞中，研究發現HLA-E的高表達與NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性降低相關。腫瘤細胞還可能通過干擾HLA-E的抗原提呈功能，逃避T細胞的免疫識別。腫瘤細胞可能會改變自身的抗原加工和提呈機制，使得腫瘤抗原不能有效地與HLA-E結合并呈遞給T細胞。腫瘤細胞也可能分泌一些免疫抑制因子，抑制T細胞的活化和功能，進一步促進免疫逃逸。例如，腫瘤細胞分泌的轉化生長因子β（TGF-β）可以抑制T細胞的增殖和細胞因子的分泌，降低T細胞的免疫活性。此外，腫瘤微環境中的其他細胞成分，如腫瘤相關巨噬細胞、調節性T細胞等，也可能通過與腫瘤細胞相互作用，促進HLA-E介導的免疫逃逸。腫瘤相關巨噬細胞可以分泌一些細胞因子，如IL-10等，上調腫瘤細胞中HLA-E的表達，增強腫瘤細胞的免疫逃逸能力。四、HLA-E在肝細胞性肝癌中的表達研究4.1研究方法與樣本選取為深入探究HLA-E在肝細胞性肝癌（HCC）中的表達情況，本研究采用了多種實驗技術和方法。在樣本選取方面，嚴格遵循科學、嚴謹的原則，以確保研究結果的可靠性和代表性。樣本主要來源于[具體醫院名稱]在[具體時間段]內收治的HCC患者。納入標準為：經病理組織學確診為肝細胞性肝癌；患者簽署了知情同意書，自愿參與本研究；臨床資料完整，包括患者的基本信息、病史、手術記錄、病理報告以及隨訪資料等。排除標準為：合并其他惡性腫瘤；患有嚴重的自身免疫性疾病或免疫缺陷疾病；術前接受過放療、化療或免疫治療等可能影響HLA-E表達的治療措施。共收集到符合標準的HCC患者手術切除標本[X]例，同時采集了相應的癌旁組織標本作為對照。癌旁組織定義為距離腫瘤邊緣至少[X]cm以上的肝臟組織，經病理檢查證實為非腫瘤組織，且無明顯的炎癥、壞死等病變。所有標本在手術切除后，立即用生理鹽水沖洗，去除血液和雜質，然后一部分標本置于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱，用于蛋白質免疫印跡法（Westernblotting）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測；另一部分標本用10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，制成石蠟切片，用于免疫組織化學染色（IHC）檢測。免疫組織化學染色是檢測組織中蛋白質表達和定位的常用方法。具體實驗步驟如下：將石蠟切片脫蠟至水，采用高溫高壓抗原修復法，使抗原充分暴露。然后用3%過氧化氫溶液孵育切片，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。加入正常山羊血清封閉非特異性抗原結合位點，隨后滴加兔抗人HLA-E多克隆抗體（工作濃度為[X]），4℃孵育過夜。次日，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗切片，加入生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30分鐘。再次用PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。最后用二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染細胞核，脫水，透明，封片。采用雙盲法，由兩位經驗豐富的病理科醫師在光學顯微鏡下觀察切片，根據陽性細胞的數量和染色強度對HLA-E的表達進行半定量分析。陽性細胞數占全部細胞數的比例＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），＞50%為強陽性（++）。蛋白質免疫印跡法用于檢測細胞或組織中蛋白質的表達水平。將凍存的組織標本研磨成粉末，加入細胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃條件下12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，使各樣本蛋白濃度一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結束后，將凝膠中的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以阻斷非特異性結合。隨后加入兔抗人HLA-E多克隆抗體（工作濃度為[X]），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（工作濃度為[X]），室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌后，采用化學發光法（ECL）顯色，在凝膠成像系統下曝光、拍照，分析條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算HLA-E蛋白的相對表達量。實時熒光定量聚合酶鏈式反應用于檢測基因的mRNA表達水平。從凍存的組織標本中提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行qRT-PCR反應。引物序列根據GenBank中HLA-E基因序列設計，上游引物為：5'-[具體序列]-3'，下游引物為：5'-[具體序列]-3'；內參基因GAPDH的上游引物為：5'-[具體序列]-3'，下游引物為：5'-[具體序列]-3'。反應體系為20μl，包括SYBRGreenMasterMix10μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板1μl，ddH2O8μl。反應條件為：95℃預變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算HLA-EmRNA的相對表達量。4.2HLA-E在肝癌組織中的表達水平通過免疫組織化學染色（IHC）對HCC組織及癌旁組織中HLA-E的表達進行檢測，結果顯示，HLA-E在癌旁組織中表達不明顯，多呈陰性或弱陽性。在癌巢中，HLA-E的陽性表達（++/+）率為[X]%，顯著高于癌旁組織。陽性染色主要定位于肝癌細胞的細胞膜和細胞質，呈現棕黃色顆粒狀。從染色強度來看，部分高分化肝癌組織中HLA-E染色強度較弱，而在低分化肝癌組織中，HLA-E染色強度相對較強。這一結果初步表明，HLA-E在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，且其表達強度可能與肝癌的分化程度有關。為進一步驗證IHC的結果，并從蛋白水平定量分析HLA-E的表達，采用蛋白質免疫印跡法（Westernblotting）對樣本進行檢測。結果顯示，HCC組織中HLA-E蛋白的相對表達量為[X]，顯著高于癌旁組織的[X]，差異具有統計學意義（P<0.01）。以β-actin作為內參，通過分析條帶灰度值，直觀地展示了HLA-E蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達差異。在不同的肝癌樣本中，HLA-E蛋白的表達水平存在一定的個體差異，但總體上肝癌組織中的表達量均高于癌旁組織。這與IHC的結果相互印證，進一步證實了HLA-E在肝癌組織中高表達的結論。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）從mRNA水平檢測HLA-E的表達情況。結果表明，HCC組織中HLA-EmRNA的相對表達量為[X]，明顯高于癌旁組織的[X]，差異具有統計學意義（P<0.01）。通過2-ΔΔCt法計算得出的相對表達量，準確地反映了HLA-E基因在肝癌組織和癌旁組織中的轉錄水平差異。這一結果從基因層面揭示了HLA-E在肝癌組織中高表達的現象，可能是由于HLA-E基因轉錄增強，或者其mRNA穩定性增加等原因導致。結合IHC和Westernblotting的結果，說明HLA-E在肝癌組織中的高表達不僅體現在蛋白水平，也體現在基因轉錄水平，這種高表達可能在肝癌的發生、發展過程中發揮著重要作用。4.3HLA-E在肝癌細胞系中的表達情況為了進一步探討HLA-E在肝癌中的表達機制，研究選取了多種肝癌細胞系，包括HepG2、BEL-7402、PLC、MHCC97、Hep3B2.1-7等，并以正常胎肝細胞系L02作為對照。運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-timePCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblotting）技術，對這些細胞系中HLA-EmRNA和蛋白的表達情況進行相對定量分析。Real-timePCR檢測結果顯示，與L02胎肝細胞系相比，Hep3B2.1-7細胞系中HLA-EmRNA表達幾乎接近缺失，差異具有統計學意義（P<0.01）。而HepG2細胞、BEL-7402細胞、PLC細胞、MHCC97細胞這4種肝癌細胞系與L02胎肝細胞系的HLA-EmRNA水平比較，無顯著差異（P>0.05）。這表明不同肝癌細胞系中HLA-EmRNA的表達存在差異，部分肝癌細胞系在轉錄水平上并未表現出明顯的HLA-E表達上調。然而，Westernblotting檢測結果卻呈現出不同的情況。HepG2細胞、BEL-7402細胞、PLC細胞、MHCC97細胞和Hep3B2.1-7細胞與L02細胞的HLA-E蛋白水平比較，差異顯著（P<0.01），其中Hep3B2.1-7細胞中HLA-E蛋白表達缺失。在HepG2、BEL-7402、PLC、MHCC97這些肝癌細胞系中，盡管HLA-EmRNA水平與正常胎肝細胞系無顯著差異，但蛋白表達卻顯著升高，這說明肝癌細胞系中HLA-E的表達在轉錄后水平存在調控機制。可能是由于mRNA的穩定性、翻譯效率或翻譯后修飾等因素的影響，導致了HLA-EmRNA和蛋白表達的不同步。例如，某些RNA結合蛋白可能與HLA-EmRNA結合，影響其翻譯效率，使得mRNA水平雖未改變，但蛋白合成量增加；或者在翻譯后修飾過程中，如糖基化、磷酸化等修飾方式的改變，影響了HLA-E蛋白的穩定性和功能，從而導致其在肝癌細胞系中蛋白表達水平的變化。本研究結果與相關研究報道具有一定的一致性。有研究表明，在多種腫瘤細胞中，HLA-E的表達調控存在轉錄后水平的復雜機制。在乳腺癌細胞中，miR-148a等微小RNA可以通過靶向HLA-EmRNA，抑制其翻譯過程，從而降低HLA-E的蛋白表達。在肝癌細胞系中，雖然本研究未直接檢測微小RNA等轉錄后調控因子對HLA-E表達的影響，但HLA-EmRNA和蛋白表達的不同步現象提示了轉錄后調控機制的存在。此外，其他研究也發現，腫瘤細胞中HLA-E的表達還可能受到細胞信號通路的調節。在一些腫瘤細胞中，NF-κB信號通路的激活可以上調HLA-E的表達，這可能涉及到轉錄水平的調控，但也不能排除對轉錄后過程的影響。因此，進一步深入研究肝癌細胞系中HLA-E表達的轉錄后調控機制，對于揭示肝癌免疫逃逸的分子機制具有重要意義。4.4影響HLA-E表達的因素分析HLA-E在肝細胞性肝癌（HCC）中的表達受到多種因素的綜合影響，這些因素相互作用，共同調控著HLA-E的表達水平，進而影響肝癌的發生、發展和免疫逃逸過程。腫瘤的病理特征與HLA-E表達密切相關。腫瘤的分化程度是一個重要因素，低分化的肝癌組織往往表現出更高的HLA-E表達水平。在低分化肝癌細胞中，細胞的增殖速度加快，細胞周期調控紊亂，這可能導致相關信號通路的異常激活，進而促進HLA-E基因的轉錄和表達。腫瘤的大小和分期也與HLA-E表達存在關聯。隨著腫瘤體積的增大和分期的進展，腫瘤細胞所處的微環境逐漸惡化，缺氧、營養物質缺乏等因素會刺激腫瘤細胞，使其上調HLA-E的表達，以逃避機體免疫系統的監視和攻擊。有研究對不同分期的HCC患者腫瘤組織進行檢測，發現晚期患者腫瘤組織中HLA-E的表達明顯高于早期患者。腫瘤的血管侵犯情況也可能影響HLA-E表達，當腫瘤侵犯血管時，腫瘤細胞更容易進入血液循環，發生遠處轉移，為了在轉移過程中躲避免疫細胞的殺傷，腫瘤細胞可能會增加HLA-E的表達。病毒感染是HCC發生的重要危險因素之一，同時也對HLA-E的表達產生影響。HBV和HCV感染在HCC患者中較為常見，研究表明，HBV或HCV感染的肝癌細胞中，HLA-E的表達水平可能會發生改變。HBV感染的肝癌細胞中，HBV的一些蛋白產物，如HBx蛋白，可能通過激活相關的信號通路，影響HLA-E基因的轉錄調控。HBx蛋白可以與轉錄因子結合，促進HLA-E基因啟動子區域的轉錄活性，從而上調HLA-E的表達。HCV感染可能通過引發肝臟的慢性炎癥反應，導致免疫微環境的改變，間接影響HLA-E的表達。在HCV感染引起的慢性炎癥環境中，細胞因子如干擾素γ（IFN-γ）等的分泌增加，IFN-γ可以激活JAK-STAT信號通路，進而調節HLA-E基因的表達。IFN-γ可以誘導IRF-1等轉錄因子的表達，這些轉錄因子與HLA-E基因啟動子區域的ISRE結合，促進HLA-E基因的轉錄。免疫微環境在HCC的發生發展過程中起著關鍵作用，也與HLA-E的表達相互影響。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是腫瘤免疫微環境中的重要組成部分，TAM可以分泌多種細胞因子和趨化因子，調節腫瘤細胞的生長和免疫逃逸。研究發現，TAM分泌的白細胞介素10（IL-10）可以上調肝癌細胞中HLA-E的表達。IL-10通過與肝癌細胞表面的IL-10受體結合，激活下游的信號通路，促進HLA-E基因的轉錄。調節性T細胞（Treg）也在腫瘤免疫微環境中發揮重要作用，Treg可以抑制效應T細胞的功能，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。Treg細胞分泌的轉化生長因子β（TGF-β）可以影響HLA-E的表達。TGF-β可以通過激活Smad信號通路，調節HLA-E基因的轉錄，從而上調HLA-E的表達。此外，NK細胞和T細胞等免疫細胞與肝癌細胞之間的相互作用也可能影響HLA-E的表達。當NK細胞或T細胞識別肝癌細胞表面的抗原時，會釋放一些細胞因子，這些細胞因子可能會反饋調節肝癌細胞中HLA-E的表達。NK細胞分泌的腫瘤壞死因子α（TNF-α）在一定條件下可以上調肝癌細胞中HLA-E的表達，這可能是腫瘤細胞對NK細胞攻擊的一種適應性反應。五、HLA-E表達與肝細胞性肝癌預后的關系5.1臨床病例隨訪與數據收集為深入分析HLA-E表達與肝細胞性肝癌（HCC）患者預后的關系，本研究對納入的HCC患者進行了系統的隨訪，并嚴格按照科學規范的流程收集相關數據。隨訪工作從患者手術出院后開始，采用門診復查、電話隨訪和線上問卷等多種方式相結合，以確保能夠全面、準確地獲取患者的生存信息。隨訪時間截至患者死亡、失訪或隨訪研究結束（具體時間為[截止日期]）。隨訪內容涵蓋患者的生存狀態，包括是否存活、死亡原因；復發情況，如復發時間、復發部位；治療情況，如術后是否接受輔助治療（化療、靶向治療、免疫治療等）及其治療方案、治療時間和治療反應；患者的身體狀況，如體力狀況評分（ECOG評分）、是否出現并發癥及其類型和嚴重程度；以及其他可能影響預后的因素，如患者的生活習慣（吸煙、飲酒等）、基礎疾病（高血壓、糖尿病等）。在數據收集過程中，設立了專門的數據收集小組，由經過培訓的醫護人員負責。對于門診復查的患者，醫護人員詳細記錄患者的各項檢查結果，包括血清學指標（AFP、DCP、肝功能指標等）、影像學檢查結果（超聲、CT、MRI等），并詢問患者的身體狀況和治療情況，將這些信息準確錄入電子病歷系統。對于電話隨訪和線上問卷收集的數據，醫護人員仔細核對信息的完整性和準確性，對于存在疑問或不完整的信息，及時與患者或其家屬溝通確認。所有收集到的數據定期進行整理和備份，確保數據的安全性和可追溯性。在數據收集完成后，運用統計學軟件對數據進行分析。首先對患者的一般臨床資料進行描述性統計分析，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數目、TNM分期、分化程度、HBV感染情況、HCV感染情況、Child-Pugh分級、HLA-E表達水平等，了解患者的基本特征和各因素的分布情況。然后采用Kaplan-Meier法計算患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS），并繪制生存曲線，比較不同HLA-E表達水平患者的生存差異，通過Log-rank檢驗判斷差異是否具有統計學意義。將HLA-E表達水平與其他臨床病理因素一起納入Cox比例風險模型進行多因素分析，篩選出影響HCC患者預后的獨立危險因素，評估HLA-E在預測患者預后中的價值。5.2HLA-E表達與肝癌患者生存分析通過對納入研究的肝細胞性肝癌（HCC）患者進行長期隨訪，收集患者的生存數據，深入分析HLA-E表達與患者總生存（OverallSurvival，OS）和無瘤生存（Disease-FreeSurvival，DFS）時間的關系，評估HLA-E作為HCC預后生物標志物的潛在價值。采用Kaplan-Meier法計算患者的OS和DFS，并繪制生存曲線。結果顯示，HLA-E高表達組患者的總生存時間顯著短于HLA-E低表達組患者，差異具有統計學意義（P<0.05）。從生存曲線來看，HLA-E高表達組患者的生存曲線在隨訪早期就開始下降，且下降趨勢較為陡峭，表明這組患者的死亡風險較高；而HLA-E低表達組患者的生存曲線下降相對平緩，患者的生存時間相對較長。在無瘤生存方面，HLA-E高表達組患者的無瘤生存時間也明顯短于HLA-E低表達組患者，差異具有統計學意義（P<0.05）。這意味著HLA-E高表達的患者術后更容易出現腫瘤復發，從而影響患者的無瘤生存期。進一步運用Log-rank檢驗對不同HLA-E表達水平患者的生存差異進行驗證，結果進一步證實了上述結論。這表明HLA-E表達水平與HCC患者的預后密切相關，HLA-E高表達可能是HCC患者預后不良的一個重要指標。從臨床實踐角度來看，這一結果具有重要的指導意義。對于HLA-E高表達的HCC患者，臨床醫生在制定治療方案時應更加謹慎，考慮采取更積極的治療措施，如聯合免疫治療、靶向治療等，以降低患者的復發風險，延長患者的生存期。同時，也需要加強對這部分患者的術后隨訪和監測，及時發現腫瘤復發的跡象，以便盡早進行干預。為了更全面地評估HLA-E表達對HCC患者預后的影響，將HLA-E表達水平與其他臨床病理因素（如腫瘤大小、腫瘤數目、TNM分期、分化程度、HBV感染情況、Child-Pugh分級等）一起納入Cox比例風險模型進行多因素分析。結果顯示，HLA-E表達水平是影響HCC患者總生存和無瘤生存的獨立危險因素（P<0.05）。在調整了其他因素后，HLA-E高表達患者的死亡風險和腫瘤復發風險仍然顯著高于HLA-E低表達患者。這進一步說明HLA-E在預測HCC患者預后方面具有獨特的價值，不受其他臨床病理因素的干擾。除HLA-E表達水平外，多因素分析還發現腫瘤大小、TNM分期、Child-Pugh分級等因素也與HCC患者的預后密切相關。腫瘤越大、TNM分期越晚、Child-Pugh分級越高，患者的預后越差。這些結果為臨床醫生綜合評估HCC患者的預后提供了更全面的信息。臨床醫生在評估患者預后時，不僅要考慮腫瘤本身的特征和肝功能狀況，還應關注HLA-E的表達水平，以便更準確地預測患者的生存情況，為制定個性化的治療方案提供依據。5.3多因素分析確定HLA-E的預后價值為了更準確地評估HLA-E在肝細胞性肝癌（HCC）患者預后中的獨立作用，本研究采用Cox回歸模型，綜合考慮多種臨床病理因素，對HLA-E表達與患者預后的關系進行深入分析。將HLA-E表達水平（高表達/低表達）、腫瘤大小（＞5cm/≤5cm）、腫瘤數目（單發/多發）、TNM分期（Ⅰ-Ⅱ期/Ⅲ-Ⅳ期）、分化程度（高分化/中低分化）、HBV感染情況（感染/未感染）、Child-Pugh分級（A/B-C）等因素納入Cox比例風險模型。首先進行單因素Cox回歸分析，初步篩選出與患者總生存期（OS）和無病生存期（DFS）可能相關的因素。結果顯示，HLA-E高表達、腫瘤大小＞5cm、腫瘤多發、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、中低分化、HBV感染、Child-Pugh分級為B-C等因素在單因素分析中均與較差的OS和DFS顯著相關（P均＜0.05）。隨后，將單因素分析中有統計學意義的因素納入多因素Cox回歸模型進行進一步分析。多因素分析結果表明，HLA-E高表達是影響HCC患者OS和DFS的獨立危險因素。在調整了其他臨床病理因素后，HLA-E高表達患者的死亡風險比（HR）為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05），腫瘤復發風險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05）。這意味著，與HLA-E低表達患者相比，HLA-E高表達患者的死亡風險和腫瘤復發風險顯著增加。除HLA-E表達水平外，多因素分析還顯示，TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、腫瘤大小＞5cm、Child-Pugh分級為B-C也是影響HCC患者預后的獨立危險因素。TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者死亡風險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05），腫瘤大小＞5cm的患者死亡風險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05），Child-Pugh分級為B-C的患者死亡風險比為[X]（95%CI：[X]-[X]，P＜0.05）。本研究通過多因素分析，明確了HLA-E表達水平在預測HCC患者預后中的重要價值，為臨床醫生更準確地評估患者預后提供了重要依據。在臨床實踐中，醫生可以結合HLA-E表達水平以及其他獨立危險因素，制定更加個體化的治療方案和隨訪策略。對于HLA-E高表達且伴有其他不良預后因素的患者，應加強術后監測，積極考慮聯合免疫治療、靶向治療等綜合治療措施，以降低腫瘤復發風險，提高患者的生存率。同時，本研究結果也為進一步研究HCC的發病機制和尋找新的治療靶點提供了方向。未來的研究可以深入探討HLA-E高表達導致不良預后的具體分子機制，以及如何通過干預HLA-E相關信號通路來改善HCC患者的預后。5.4HLA-E作為預后標志物的臨床應用潛力HLA-E表達水平在肝細胞性肝癌（HCC）患者預后評估中展現出巨大的臨床應用潛力，有望成為指導臨床治療決策的重要生物標志物。在預測HCC患者預后方面，HLA-E表達具有較高的準確性和可靠性。如前文所述，本研究通過對大量HCC患者的隨訪和生存分析發現，HLA-E高表達組患者的總生存期和無病生存期均顯著短于HLA-E低表達組患者，且HLA-E表達水平是影響HCC患者預后的獨立危險因素。這一結果表明，HLA-E表達水平能夠獨立于其他臨床病理因素，為醫生提供關于患者預后的關鍵信息。與傳統的預后評估指標，如腫瘤大小、TNM分期等相比，HLA-E表達水平能夠從免疫逃逸的角度，更深入地反映腫瘤的生物學行為和患者的生存風險。腫瘤大小和TNM分期主要反映腫瘤的解剖學特征和疾病進展程度，而HLA-E表達則揭示了腫瘤細胞逃避機體免疫系統監視和攻擊的能力。在臨床實踐中，對于腫瘤大小和TNM分期相似的患者，HLA-E表達水平不同，其預后可能存在顯著差異。因此，將HLA-E表達水平納入HCC患者的預后評估體系，能夠更全面、準確地預測患者的生存情況，為患者提供更精準的預后信息。在指導治療方案選擇方面，HLA-E表達水平也具有重要的價值。對于HLA-E高表達的HCC患者，由于其腫瘤細胞免疫逃逸能力較強，預后較差，臨床醫生可以考慮采取更積極的治療策略。在手術治療方面，對于符合手術指征的患者，可以在切除腫瘤的基礎上，適當擴大切除范圍，以降低腫瘤殘留和復發的風險。術后輔助治療對于HLA-E高表達的患者尤為重要，可考慮聯合免疫治療和靶向治療。免疫治療通過激活機體的免疫系統，增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷活性，有望打破HLA-E介導的免疫逃逸。例如，免疫檢查點抑制劑可以阻斷免疫檢查點蛋白，如PD-1/PD-L1等，解除腫瘤細胞對免疫系統的抑制，使免疫細胞能夠重新識別和殺傷腫瘤細胞。靶向治療則通過針對腫瘤細胞表面的特定靶點，阻斷腫瘤細胞的生長、增殖和轉移信號通路，發揮抗腫瘤作用。對于HLA-E高表達的患者，聯合使用免疫治療和靶向治療，可能會取得更好的治療效果。侖伐替尼聯合帕博利珠單抗治療晚期HCC患者，在一些臨床試驗中顯示出較好的療效和安全性，為HLA-E高表達的HCC患者提供了新的治療選擇。此外，對于無法手術切除的HLA-E高表達患者，還可以考慮局部治療聯合全身治療的綜合方案。局部治療如射頻消融、微波消融、經動脈化療栓塞等可以直接作用于腫瘤組織，縮小腫瘤體積，減輕腫瘤負荷；全身治療則可以通過血液循環到達全身，抑制腫瘤細胞的生長和轉移。通過綜合運用多種治療手段，有望提高HLA-E高表達患者的治療效果，延長患者的生存期。對于HLA-E低表達的HCC患者，其腫瘤細胞免疫逃逸能力相對較弱，預后相對較好。在治療方案選擇上，可以根據患者的具體情況，采取相對保守的治療策略。對于早期患者，可優先考慮手術切除或局部消融等根治性治療方法，這些方法創傷較小，患者恢復較快，且能夠有效控制腫瘤。對于中晚期患者，在評估患者身體狀況和腫瘤情況后，可以選擇合適的全身治療方案，如化療、靶向治療等。在治療過程中，應密切關注患者的病情變化，根據治療反應及時調整治療方案。對于一些對化療敏感的患者，可以適當減少化療藥物的劑量，降低化療的副作用，提高患者的生活質量。將HLA-E表達水平納入HCC患者的常規檢測項目，有助于實現HCC的精準治療。通過檢測HLA-E表達水平，醫生可以為不同風險的患者制定個性化的治療方案，避免過度治療或治療不足，提高治療效果，改善患者的預后。目前，免疫組織化學染色、蛋白質免疫印跡法和實時熒光定量聚合酶鏈式反應等技術已較為成熟，能夠準確檢測HLA-E的表達水平，為其臨床應用提供了技術支持。未來，隨著檢測技術的不斷發展和完善，HLA-E檢測將更加便捷、準確，有望在臨床廣泛推廣應用。六、HLA-E在肝細胞性肝癌發生發展中的作用機制6.1HLA-E與肝癌細胞免疫逃逸在肝細胞性肝癌（HCC）的發生發展過程中，免疫逃逸是腫瘤細胞得以生存和增殖的關鍵機制之一，而HLA-E在這一過程中扮演著重要角色，主要通過抑制NK細胞和T細胞功能，幫助肝癌細胞逃避免疫監視。NK細胞作為固有免疫系統的重要成員，能夠識別并殺傷腫瘤細胞，在機體抗腫瘤免疫中發揮著重要作用。HLA-E主要通過與NK細胞表面的抑制性受體CD94/NKG2A結合，抑制NK細胞的殺傷活性。正常情況下，NK細胞表面的CD94/NKG2A與健康細胞表面的HLA-E結合，傳遞抑制信號，使NK細胞處于抑制狀態，避免對自身正常細胞的攻擊。在肝癌細胞中，HLA-E表達上調，大量的HLA-E與NK細胞表面的CD94/NKG2A結合，持續激活NK細胞內的抑制性信號通路。這一過程涉及到一系列的分子事件，當CD94/NKG2A與HLA-E結合后，其胞內段的免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）被磷酸化，招募含有SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2。這些磷酸酶被招募到CD94/NKG2A附近后，對下游信號分子如磷脂酶Cγ（PLCγ）、蛋白激酶C（PKC）等進行去磷酸化修飾，阻斷NK細胞活化信號的傳導，從而抑制NK細胞的殺傷功能。研究表明，在肝癌細胞系中，上調HLA-E的表達可以顯著降低NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性。通過基因沉默技術下調肝癌細胞中HLA-E的表達后，NK細胞對肝癌細胞的殺傷能力明顯增強。這充分說明HLA-E與CD94/NKG2A的結合是肝癌細胞逃避NK細胞免疫監視的重要機制之一。T細胞在適應性免疫應答中發揮著核心作用，可分為CD4+T細胞和CD8+T細胞。HLA-E對T細胞功能的影響主要體現在CD8+T細胞方面。在正常的免疫應答過程中，腫瘤抗原被抗原提呈細胞（APC）攝取、加工處理后，與HLAⅠ類分子結合形成復合物，提呈給CD8+T細胞表面的T細胞受體（TCR）識別，激活CD8+T細胞，使其分化為細胞毒性T淋巴細胞（CTL），進而殺傷腫瘤細胞。在肝癌細胞中，HLA-E的異常表達干擾了這一正常的免疫識別和激活過程。一方面，肝癌細胞上調HLA-E的表達，占據了APC表面的抗原提呈位點，使得腫瘤抗原無法有效地與HLAⅠ類分子結合并提呈給CD8+T細胞。另一方面，HLA-E與CD8+T細胞表面的TCR結合后，可能傳遞錯誤的信號，抑制CD8+T細胞的活化和增殖。研究發現，在肝癌組織中，HLA-E高表達的區域，CD8+T細胞的浸潤數量明顯減少，且CD8+T細胞的活性受到抑制，表現為細胞因子分泌減少、增殖能力降低等。此外，HLA-E還可能通過影響T細胞的遷移和歸巢，使其難以到達腫瘤組織，進一步削弱了T細胞對肝癌細胞的免疫監視作用。腫瘤微環境中的其他細胞成分和細胞因子也參與了HLA-E介導的肝癌細胞免疫逃逸過程。腫瘤相關巨噬細胞（TAM）是腫瘤微環境中的重要組成部分，TAM可以分泌多種細胞因子和趨化因子，調節腫瘤細胞的生長和免疫逃逸。研究發現，TAM分泌的白細胞介素10（IL-10）可以上調肝癌細胞中HLA-E的表達。IL-10通過與肝癌細胞表面的