ICS65.020CCSB05DB5306昭通市地方標(biāo)準(zhǔn)DB5306/T78-2022半夏組培快繁技術(shù)規(guī)程昭通市市場(chǎng)監(jiān)督管理局DB5306/T78-2022前??言本文件按照GB/T1.1－2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由昭通市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本文件由昭通市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位：昭通市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：權(quán)申春、馬永鵬、龍?jiān)菩恰⒏叱摹⑼踯纭⒃獎(jiǎng)Α⒃绖P、宋賢武、李周、岳萬勇、李啟菊。IDB5306/T78-2022半夏組培快繁技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了半夏（Pinelliaternata(Thunb.)Breit.）組培快繁技術(shù)的術(shù)語和定義、生產(chǎn)及技術(shù)流程、煉苗移栽、采收儲(chǔ)藏操作規(guī)范。本文件適用于半夏組培苗生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T317白砂糖GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。將半夏（Pinelliaternata(Thunb.)Breit.）外植體接種于同一種培養(yǎng)基中，讓外植體在其上脫分化、再分化、長(zhǎng)葉、生根，最終形成完整的植株。用半夏組培苗馴化繁殖產(chǎn)生的第一代繁殖材料（塊莖、成熟珠芽、多塊莖共生體）。4半夏組培快繁的生產(chǎn)及技術(shù)流程4.1組織培養(yǎng)生產(chǎn)設(shè)施設(shè)備實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合GB19489和GB/T22278要求。常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備有：超凈工作臺(tái)，高壓蒸汽滅菌鍋，4.2培養(yǎng)基的配制方法1DB5306/T78-20224.2.1培養(yǎng)基配方半夏組培快繁技術(shù)中所用培養(yǎng)基為MS+6-BA+NAA+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH5.8。培養(yǎng)基配方詳細(xì)情況見附錄A。4.2.2培養(yǎng)基配制程序4.2.2.1母液的配制和保存試劑配制嚴(yán)格按照GB/T603規(guī)定方法配制，所用水執(zhí)行GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)。通常將常用試劑配制成比培養(yǎng)基所需濃度高10倍～100倍的母液，具體配制倍數(shù)見附錄A。母液置于2℃～4℃的冰箱中貯存。4.2.2.2植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配制植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑用量極微量，各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑單獨(dú)配制。4.2.2.2.1NAA的配制精密稱取NAA試劑，先用少量95%乙醇或無水乙醇完全溶解，最后加水定容。常用母液濃度為0.1mg/ml～1.0mg/ml。4.2.2.2.26-BA的配制精密稱取6-BA試劑，先用少量1mol/L的HCl完全溶解，最后加水定容。常用母液濃度為0.1mg/ml～2.0mg/ml。半夏培養(yǎng)基由試劑、蔗糖、瓊脂、水組成，蔗糖和水應(yīng)分別符合GB317和GB5749規(guī)定。培養(yǎng)基的制備：稱取所需量的瓊脂、蔗糖，根據(jù)不同濃縮倍數(shù)量取對(duì)應(yīng)的母液；首先在水浴鍋中加入瓊脂，攪拌讓其慢慢熔化；再依次把量取好的母液及生長(zhǎng)調(diào)劑加入已融化的瓊脂中；最后加入蔗糖，繼續(xù)加溫，不斷攪拌，直至瓊脂和蔗糖完全溶解；最終定容到所需體積。半夏培養(yǎng)基最佳pH值為5.8，采用酸度計(jì)或精密pH試紙測(cè)定調(diào)整，通常用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl來調(diào)節(jié)。配制好的培養(yǎng)基需趁熱分裝，分裝量以培養(yǎng)容器體積的1/4～1/3為宜，分裝后應(yīng)立即密封。培養(yǎng)基分裝后應(yīng)在24h內(nèi)完成滅菌工作。在壓力為1.1kg/cm，溫度121℃的條件下，滅菌25min～230min。滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存于潔凈、干燥的培養(yǎng)基儲(chǔ)存室中，2℃～4℃條件下7d內(nèi)使用。2DB5306/T78-20224.3外植體的制備及接種4.3.1外植體的選擇無病蟲害、健壯的半夏植株的葉片、珠芽、塊莖均可作為外植體，以塊莖為外植體更易于取樣和操作。4.3.2外植體的消毒用塊莖作為外植體時(shí)應(yīng)先剝?nèi)ケ砥ぃ庵搀w材料應(yīng)先用自來水沖洗30min。將洗凈后的外植體材料轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇浸泡10s～20s，用無菌水沖洗2次，再用0.1%升汞消毒8min～12min（塊莖、珠芽消毒12min；葉柄10min，葉片8min），最后用無菌水沖洗5次～7次后備用。4.3.3接種在超凈工作臺(tái)上，將消毒好的半夏塊莖切成約大小0.5cm×0.5cm，接種到培養(yǎng)基上，帶莖尖的塊莖莖尖朝上擺放，切口接觸培養(yǎng)基固定；葉柄切成1cm左右大小段扦插到培養(yǎng)基上；葉片切成大小0.5cm×0.5cm、葉面朝上平鋪于培養(yǎng)基上，接種后做好標(biāo)記。半夏組培技術(shù)流程圖見附錄B。4.4初代培養(yǎng)4.4.1溫度與光照半夏最適宜的培養(yǎng)溫度25℃±2℃，光照強(qiáng)度為1500Lx～2000Lx，光照時(shí)間為12h/d。接種好的培養(yǎng)瓶放置在條件適宜的培養(yǎng)架上，培養(yǎng)30d～50d左右，形成愈傷組織和叢生芽。叢生芽和愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)或者分割轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30d左右，形成完整組培苗。4.5增殖培養(yǎng)將無菌組培苗濃綠厚大的葉片切成大小約0.5cm×0.5cm，葉面朝上平鋪于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)周期30d～50d，形成愈傷組織和叢生芽。將無菌組培苗生長(zhǎng)健壯的葉柄切成約1cm大小段，扦插于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)周期30d～50d，形成愈傷將剪掉葉片和葉柄的愈傷組織分割成約大小0.5cm×0.5cm，轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)周期30d左右，將叢生芽和愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)周期30d左右，形成完整組培苗。3DB5306/T78-20225設(shè)施馴化移栽操作規(guī)范5.1光照培養(yǎng)煉苗在室溫、自然光下，選擇株高3cm～5cm的半夏組培苗，先擰松瓶蓋2d～3d，再半揭瓶蓋2d～3d，最后完全揭開瓶蓋，煉苗3d～5d后即可進(jìn)行移栽。5.2移栽馴化5.2.1基質(zhì)配制在能調(diào)節(jié)光照、溫度、濕度等因素的設(shè)施大棚內(nèi)，將椰糠、蛭石、生物有機(jī)肥按體積7:2.5:0.5配制成移栽馴化基質(zhì)。5.2.2移栽從瓶中取出經(jīng)過光培煉苗的半夏組織苗，用自來水洗去附著的培養(yǎng)基，按株行距5cm×10cm移栽到基質(zhì)上，然后用薄膜覆蓋保水保濕，在溫度25℃左右，相對(duì)濕度85%條件下生長(zhǎng)5d～7d揭摸。5.3苗期管理5.3.1肥水管理由于組培苗比較脆弱，應(yīng)根據(jù)天氣情況及時(shí)做好管理，保持基質(zhì)內(nèi)含水量50％～60%。整個(gè)生長(zhǎng)期間保持溫度25℃左右，遮陽率75%左右。待所有組培苗成活并長(zhǎng)出新葉后，全面噴施第1次2000倍水溶復(fù)合肥（氮磷鉀比列為12:8:30）；待多數(shù)葉片形成珠芽芽點(diǎn)時(shí)，全面噴施第2次1000倍水溶復(fù)合肥；珠芽成熟過程中進(jìn)行第三次800倍～1000倍水溶復(fù)合肥噴施。病蟲草害以預(yù)防為主，整個(gè)生育期及時(shí)除草，除小除早，嚴(yán)防草荒。主要病害有立枯病，主要蟲害有蚜蟲和薊馬。半夏組培苗主要病蟲害種類及防治方法見附錄C。5.4.1采收馴化繁殖90d～120d左右，倒苗即可正常收獲。5.4.1.2方法收獲前7d停止?jié)菜Ｊ斋@時(shí)先撿拾散落的珠芽，再按行開挖采收，最后用細(xì)篩將基質(zhì)篩1遍，篩撿將超級(jí)原種涼干水分后在4℃以下低溫冷庫(kù)中貯存；也可薄攤在通風(fēng)陰涼的室內(nèi)，適當(dāng)加少量基質(zhì)，4DB5306/T78-2022AA錄A附（規(guī)范性）半夏組培快繁技術(shù)MS培養(yǎng)基配方半夏組培快繁技術(shù)MS培養(yǎng)基配方見表A.1。表A.1半夏組培快繁MS培養(yǎng)基配方表成分母液濃度（g/L）38.00033.0007.400培養(yǎng)基母液培養(yǎng)基劑量mg/L編組藥品相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)名稱硝酸鉀硝酸銨硫酸鎂分子式KNO3用量/ml1900.0001650.000370.000170.000440.00027.800GB/T647GB/T659GB/T671GB/T1274GB/T26520GB/T664大量元素NH4NO3MgSO4·7H2OKH2PO45010（20倍）磷酸二氫鉀3.400氯化鈣CaCl28.800鐵鹽（100倍）鐵硫酸亞鐵乙二胺四乙酸二鈉FeSO4·7H2O2.780Na2-EDTA·2H2O3.73037.300GB/T1401硫酸錳MnSO4·H2OZnSO4·7H2O2.2300.8600.00250.00250.00250.0830.62010.0000.0100.0500.0500.20022.3008.6000.0250.0250.2500.8306.200100.0000.1000.5000.5002.000300006000GB/T15899GB/T666GB437硫酸鋅GB/T1270GB/T1272GB/T628H3BO35DB5306/T78-2022BB附錄B（規(guī)范性）半夏組培技術(shù)流程圖半夏組培技術(shù)流程圖見圖B.1。6DB5306/T78-2022CC附錄C（規(guī)范性）半夏組培快繁技術(shù)主要病蟲害種類及防治方法半夏組培快繁技術(shù)主要病蟲害種類及防治方法見表C.1。表C.1半夏組培快繁技術(shù)主要病蟲害防治表危害部位名稱病原及發(fā)病特點(diǎn)防治方法病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani），多發(fā)于幼苗期，主要危害葉柄和葉片。播種后如土溫較低，出苗緩慢，增加病原菌侵染的機(jī)會(huì)。出苗后半個(gè)月如遇干早少雨，幼莖柔嫩，易遭受病原菌侵染。一般在土溫10℃左右病原菌即開始活動(dòng)，在多雨、土壤濕度大時(shí)，極有利于病原菌的繁殖、傳播和侵染。發(fā)病初期只見個(gè)別幼苗發(fā)病，病株葉柄基部產(chǎn)生橢圓形暗褐色病斑，早期病苗白天萎蔫，夜晚恢復(fù)，病斑逐漸凹陷，最后病部收縮干枯，病株死亡。在適合的環(huán)境條件下病害擴(kuò)展迅速，葉片和葉柄呈水漬狀，逐步變成灰白至灰褐色，常引起大面積幼苗枯死。當(dāng)持續(xù)遇到潮濕的天氣時(shí)，病部常出現(xiàn)白色蛛絲網(wǎng)狀霉，發(fā)病后期在病株基部和土壤中有時(shí)出現(xiàn)淺褐色至深褐色的菌核。用1000倍～1200倍液70％甲基硫菌靈或500倍～800倍液50％多菌靈噴施2次～3次，每次間隔7d～9d。葉柄、葉片立枯病蚜蟲又稱膩蟲、蜜蟲，是一類植食性昆蟲，蚜總科利用黃色粘蟲板粘蚜，利用銀色反光膜避（Aphidoidea）昆蟲總稱。以成蚜和若蚜聚集在半夏幼蚜；蚜蟲發(fā)生初期，有翅蚜遷飛之前用20%苗、嫩芽、嫩葉上吸食汁液，蚜蟲繁殖力強(qiáng)，密集危害，滅蚜松可濕性粉劑1000倍～1500倍液、10%吡蟲啉4000倍～6000倍液交替噴灑，每7d～10d噴1次，連噴2次～3次。及時(shí)除草，收集殘株，清潔田園，減少蟲源數(shù)量，防止遷移危害；利用薊馬的趨藍(lán)習(xí)性，在田間與作物等高位置設(shè)藍(lán)色