ICS65.020.20CCSB053717菏澤市地方標準DB3717/T23—2024植物種苗組培技術規程Technicalcodeofplantmicropropagation菏澤市市場監督管理局??發布DB3717/T23—2024目次前言........................................................................................................................................................................II1范圍...................................................................................................................................................................12規范性引用文件..............................................................................................................................................13術語和定義......................................................................................................................................................14培養基的配制..................................................................................................................................................14.14.2母液的配制...............................................................................................................................................1植物接種培養基.......................................................................................................................................15植物材料的選擇與外植體滅菌......................................................................................................................25.15.2植物組培苗外植體母本圃種植...............................................................................................................2植物材料選擇時間...................................................................................................................................25.3植物材料部位的確定和選擇...................................................................................................................25.45.5儀器和植物外植體材料的滅菌...............................................................................................................2儀器及培養基的最少消毒時間...............................................................................................................25.6儀器和培養基與外植體消毒...................................................................................................................25.7植物外植體的無菌操作...........................................................................................................................36組織培養苗試管培養......................................................................................................................................36.1愈傷組織誘導分化培養...........................................................................................................................36.2增殖繼代培養...........................................................................................................................................36.3植物組織生根培養...................................................................................................................................36.4組織苗煉苗移栽.......................................................................................................................................36.5移栽穴盤苗的管理...................................................................................................................................37包裝與運輸......................................................................................................................................................37.1包裝...........................................................................................................................................................37.2運輸...........................................................................................................................................................4附錄A（規范性）培養基母液配制................................................................................................................5附錄B（規范性）不同植物品種常用培養基配法........................................................................................6附錄C（規范性）生物調節物質母液的配制................................................................................................7附錄D（規范性）植物不同器官消毒順序....................................................................................................9附錄E（規范性）器皿及培養基的最少滅菌時間......................................................................................10附錄F（規范性）儀器和培養基的消毒壓力和溫度與排氣的關系..........................................................11附錄G（規范性）植物外植體材料的滅菌常用消毒劑效果......................................................................12附錄H（規范性）ABT生根粉種類及使用濃度............................................................................................8附錄I（規范性）不同植物激素種類與使用濃度........................................................................................13IDB3717/T23—2024前言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》給出的規則起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由菏澤市林業局提出、歸口并組織實施。本文件起草單位：菏澤市林業科學研究院、菏澤市林業產業發展中心、菏澤市自然資源和規劃局、菏澤市行政審批踏勘評審中心、菏澤林業技術服務中心、鄆城縣陽光花卉有限公司。本文件主要起草人：袁全國﹑王金國﹑任升﹑李艷玲﹑陳和平、晁新勝﹑羅松﹑李新艷﹑劉金錦﹑王海燕﹑蘇麗娟﹑張淼﹑王傳印﹑左傳偵。IIDB3717/T23—2024植物種苗組培技術規程1范圍本文件規定了植物種苗組培的術語和定義、培養基配制、接種操作流程、包裝和運輸。本文件適用于菏澤市植物種苗的組培。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T1965-2003日光溫室和塑料大棚結構與性能要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。種子播種發芽后，一般生長到2對真葉，適合移植到其它環境生長的幼小植株。利用植物器官、組織、細胞、原生質體，在無菌和適宜的人工條件下，培育植株。培養基母液配制參見附錄A。不同植物品種常用培養基配制方法見附錄B。配制好的母液瓶上分別貼上標簽，注明母液號﹑配制倍數﹑日期及配制1L培養基時應取的量。定容后貯藏于冰箱中保存備用。生物調節物質母液的配制見附錄C，定容后貯藏于冰箱中保存備用，若貯藏時間過長，發生乳析現象應震蕩均勻后使用。1DB3717/T23—20244.2.1.1先將貯藏的母液依次按順序擺放好,再準備好各種玻璃器皿﹑量筒﹑燒杯﹑吸管﹑玻璃棒﹑漏斗等。稱好瓊脂﹑蔗糖，配好生長調節劑。準備好蒸餾水和封瓶口用的繩子﹑封口紙。4.2.1.2根據培養基的配方分別用吸管吸取培養基母液，把依母液的濃度量取規定量滴入量筒中。加完母液依培養基的配方計算出所需生長調節劑的量，吸取滴入量筒中，定容到1000ml所需的體積。把定容的培養基液倒入含有0.6%～1.0%瓊脂﹑1%～5%蔗糖的加熱容器內繼續加熱，不斷攪拌，直至使瓊脂完全溶解。4.2.1.3接種培養基的pH值控制在5.5～6.0，用0.1N～1N的HCL(NaOH)對培養基pH值進行調整。4.2.2分裝趁熱分裝培養基，一般占試管、三角瓶等容器1/3～1/4左右為宜。注意避免培養基粘到瓶壁上，防止感染雜菌。4.2.3消毒分裝好的培養基、無菌水、接種工具放入高壓消毒鍋中(滅菌壓力0.11MPa～0.14MPa,120℃～126℃,15min～20min)，不要裝入太滿影響蒸汽循環。高壓滅菌后培養基取出，放置凝固后接種使用。5植物材料的選擇與外植體滅菌5.1植物組培苗外植體母本圃種植將性狀優良的組培苗種植在溫室內,加強水肥管理,使植株生長健壯,減少植物體表面的細菌﹑真菌﹑微生物的數量。3月植物外植體形成愈傷組織最多，7月次之，最次12月愈傷組織形成最少，確定最佳時間為3月份。5.3植物材料部位的確定和選擇根據組織培育目的，可選擇根﹑莖﹑葉等組織和器官，一般選擇植物的莖段作為植物培育外植體。5.5儀器及培養基的最少消毒時間見附錄E。器皿和金屬器械滅菌采用高溫高壓蒸汽滅菌法，器皿、金屬器械和培養基的最少滅菌時間參見附錄。2DB3717/T23—20245.6.3無菌室的滅菌接種前一天,高錳酸鉀與甲醛混合產生的霧化氣體封閉無菌室滅菌，并紫外燈照射30min。植物外植體的無菌操作5.7植物組織的整個接種過程均需無菌操作。將滅菌沖洗干凈的嫩梢0.5cm～1cm小段放在超凈工作臺無菌的環境中,用左手鑷子夾住莖尖,右手用解剖刀除去幼芽的外面部分,切取頂端0.5mm～1mm大小的芽接種在滅菌的培養基中進行愈傷組織分化培養，可將病毒除去。6組織培養苗試管培養6.1愈傷組織誘導分化培養MS+6-BA0.5mg/L+2·4-D1mg/L+KT0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH值為6.0左右，培養室溫25±2℃，每天12h光照。（不同植物激素使用種類與濃度見附錄H）。6.2增殖繼代培養6.2.1愈傷組織脫分化培養后，切下形成的小芽，接種在MS+6-BA2mg/L+IAA0.5mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH值為6.0左右的培養基上進行增殖培養,經2～4周器官分化,形成纖弱小芽。6.2.2芽長至1～2cm時切下轉到MS+6-BA（2mg/L）+KT（0.3mg/L）+IAA（0.5mg/L）+3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH值為6.0左右的培養基上,用于壯苗。隨著繼代增殖培養逐漸減少6-BA的用量，最后一次繼代增殖培養可以加少量的IAA﹑NAA﹑IBA便于外植體的復壯與生根。生長健壯、適于生根的叢生無根苗,接種在1/2MS(大量元素減半)+NAA0.2-0.5mg/L+IBA2.0mg/L+3%蔗糖+0.7%瓊脂,PH值6.0左右的培養基上，培養30～40天,基部切口處產生新根。6.4.1當組培苗新根長至1㎝～5㎝,苗高5cm～8cm時,培養瓶內加入少量無菌水,轉移到23℃～25℃的溫室中接受自然光的照射，3天～6天后取出試管,無菌蒸餾水沖干凈黏附在根部的瓊脂。6.4.2將清洗干凈的試管苗在50%可濕性粉劑多菌靈30～70倍液與ABT生根劑液中浸泡（ABT生根粉種類與濃度見附錄I），定植在混合基質中，混合基質配方是泥炭：蛭石：珍珠巖（2：1：1）。注意覆蓋小拱棚及遮陰網，避強光且保濕；移栽前試管苗澆灌0.5g/L的多菌靈溶液進行基質消毒。溫度控制在15℃～28℃，相對濕度控制在80%～90%，光照強度控制在5000LX～10000LX。施肥用10%MS培養基澆灌。每3天噴施稀釋1000～1500倍的多菌靈或百菌清等殺菌劑一次。3DB3717/T23—2024試管苗及穴盤苗包裝:將代有試管的組培苗裝在泡沫箱里,外面在用紙箱包裝；穴盤苗連同穴盤放在紙箱里，層層放置，保持立體空間。每箱貼上標簽,注明品種﹑等級﹑規格﹑數量、產地等放在托盤上運輸。7.2運輸及時冷藏運輸,避免極端天氣。4DB3717/T23—2024附錄A（規范性）培養基母液配制培養基母液配置見表A.1。表1.1培養基母液配置母液體積1L培養基吸取量(ml)母液編號化合物名稱規定量擴大倍數稱取量(ml)KNO?1900165010101900016500NH4NO?MgSO4·7H2O370103700KH2PO417044022.38.61010170044002230860母液11000100CaCl2·2H2OMnSO4·4H2OZnSO4·7H2O100100H3BO3MnSO4·4H2OZnSO4·7H2OH3BO36.222.38.6100100100100100100100100--6202230860620836.2母液2IK0.830.250.0250.0251000105DB3717/T23—2024附錄B（規范性）不同植物品種常用培養基配法不同植物品種常用培養基配法見表B.1。表1.2不同植物品種常用培養基配法名稱泡桐愈傷組織誘導分化培養基繼代增值培養基生根培養基MS+6-BA1.0mg/L+KT0.2mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+B90.5mg/L康乃馨MS+6-BA0.5mg/L+2·4-D1mg/LMS+6-BA0.5mg/L+KT2.0mg/LMS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/LMS+6-BA0.5mg/L+GA35mg/LMS+6-BA2.0mg/L+KT0.5mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA0.5mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+NAA1.0mg/L1/2MS+NAA0.5mg/L蘋果滿天星獼猴桃MS+6-BA3.0mg/L+KT0.5mg/LMS+IBA0.5mg/L+ZT2.0mg/L1/2MS+IBA2.0mg/L+0.4~0.5%活性炭水仙人參甜橙菠蘿MS+ZT2.0+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/LMS+6-BA0.1mg/L+KT0.5mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/LMS+6-BA2.0mg/L+NAA2.0mg/LMS+NAA2.0mg/L+IAA0.5mg/LMS+6-BA0.1mg/L+IBA0.5mg/L1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.4mg/L1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/LMS+6-BA0.5mg/L+IBA1mg/L+NAA0.5mg/LMS+GA30.4mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.3mg/LMS+GA30.2mg/L+NAA0.2mg/L+KT0.02mg/L1/2MS+IBA1mg/L+NAA0.5mg/L+0.5%活性炭6DB3717/T23—2024附錄C（規范性）生物調節物質母液的配制生物調節物質母液的配制見表C.1。表1.3生物調節物質母液的配制名稱IAANAAIBA溶質濃度(mg/ml)稱取量(單位:mg)母液體積(ml)95%酒精少量95%酒精少量95%酒精少量1NHCL少量1NHCL少量95%酒精少量0.10.10.10.10.10.1101010101010100100100100100100KT6-BAZT7DB3717/T23—2024附錄D（規范性）植物不同器官消毒順序植物不同器官消毒順序見表D.1。表1.4植物不同器官消毒順序消毒順序器官消毒前消毒消毒后備注純酒精浸泡15分鐘,用10%次氯酸鈣20~30min,無菌水沖洗3次，放在無菌環用幼芽與幼根產生愈傷組種子果實無菌水沖洗再用1%溴水浸泡5min。境中發芽。無菌水反復沖洗，清除內部組織和種子。織。純酒精迅速清洗2%的次氯酸鈉浸泡15min獲得無菌組織。直接接種在培養基上或切取組織進行培養莖切段洗滌液清洗自來水沖洗2%的次氯酸鈉浸泡15min無菌水清洗3~5次無菌水清洗3~5次2%次氯酸鈉浸泡20~30min取出消毒材料內部組織進行培養貯藏器官用自來水清洗吸干用洗70%的酒精漂洗;2%次氯無菌水沖洗3次,無菌濾紙吸嫩葉