原代細胞培養(yǎng)操作流程演講人：日期:目錄CONTENTS01實驗前準備02樣本取材與處理03細胞消化與分離04接種與培養(yǎng)條件05日常觀察與維護06凍存與復(fù)蘇規(guī)范01實驗前準備無菌設(shè)備滅菌確認采用高壓蒸汽滅菌法，確保培養(yǎng)皿、吸管、離心管等無菌。滅菌方法通過無菌試驗驗證滅菌效果，確保無菌操作。滅菌效果驗證檢查無菌操作臺、培養(yǎng)箱等設(shè)備的運行狀態(tài)和清潔度。設(shè)備檢查培養(yǎng)基與試劑配制pH值調(diào)整使用無菌的NaOH或HCl調(diào)整培養(yǎng)基的pH值至適宜范圍。03添加生長因子、抗生素等必要的試劑，促進細胞生長和抑制細菌生長。02試劑添加培養(yǎng)基選擇根據(jù)細胞種類選擇適宜的培養(yǎng)基，如MEM、DMEM等。01操作臺紫外預(yù)處理紫外燈照射在操作前使用紫外燈對操作臺進行照射，以殺死潛在的細菌或病毒。01照射時間通常照射30分鐘以上，確保操作臺表面達到無菌狀態(tài)。02操作臺清潔照射前需清理操作臺，保證無塵埃、紙屑等雜質(zhì)。0302樣本取材與處理組織樣本快速獲取在無菌條件下，將組織樣本放入無菌容器中，盡快轉(zhuǎn)移至實驗室進行后續(xù)處理。手術(shù)切除的組織樣本活檢樣本細胞懸液在活檢過程中，使用無菌器械和技術(shù)，確保樣本的完整性和無菌性，避免交叉污染。通過離心、過濾等方法，將細胞從血液、尿液等體液中分離出來，制成細胞懸液。機械剪切分塊標準剪切速度根據(jù)不同的組織類型和細胞特性，選擇適當?shù)募羟兴俣龋员苊饧毎麚p傷。分塊大小剪切工具根據(jù)實驗需求和細胞特性，將組織樣本剪切成適當?shù)拇笮。员愀玫剡M行細胞分離和培養(yǎng)。選擇鋒利的剪刀或手術(shù)刀，以減少細胞損傷和碎片產(chǎn)生。123根據(jù)組織類型和細胞特性，選擇適當?shù)拿附鈺r間，以獲得更多的活細胞。酶解時間的選擇在酶解過程中，保持適宜的溫度，以促進酶的活性，同時避免細胞損傷。酶解溫度的控制在酶解結(jié)束后，及時用完全培養(yǎng)基終止酶解反應(yīng)，并進行細胞計數(shù)和活力檢測。酶解后的處理酶解時間梯度控制03細胞消化與分離消化酶類型選擇胰蛋白酶常用于消化蛋白質(zhì)，使細胞間的蛋白質(zhì)分解，從而使細胞分離。01膠原酶針對結(jié)締組織消化，使細胞更容易從組織中分離。02透明質(zhì)酸酶用于消化透明質(zhì)酸，提高細胞分離效率。03終止液添加比例胰蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶按1:1比例混合，終止胰蛋白酶的活性。01完全培養(yǎng)基加入與消化液等量的完全培養(yǎng)基，終止消化并保護細胞。02轉(zhuǎn)速通常使用1000rpm，既能有效分離細胞，又能避免細胞損傷。時長離心時間一般為5分鐘，確保細胞與消化液完全分離。離心轉(zhuǎn)速及時長04接種與培養(yǎng)條件細胞密度計算標準使用血細胞計數(shù)板或電子細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，確保細胞密度準確。計數(shù)方法接種密度細胞狀態(tài)根據(jù)不同細胞類型和實驗需求，選擇合適的接種密度，以保證細胞在培養(yǎng)過程中的生長和繁殖。觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)，確保細胞健康、無污染。培養(yǎng)基更換頻率根據(jù)細胞類型和生長速度，確定培養(yǎng)基的更換頻率，一般每2-3天更換一次。更換時間在無菌條件下，輕輕倒出舊培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌細胞，然后加入新的培養(yǎng)基。更換方法選擇適合細胞生長和繁殖的培養(yǎng)基，注意無菌操作。培養(yǎng)基選擇CO?濃度與溫度設(shè)置6px6px6px細胞培養(yǎng)箱中CO?濃度一般設(shè)置在5%左右，以維持適宜的pH值。CO?濃度保持培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度，以保證細胞的正常生長和繁殖。環(huán)境濕度根據(jù)不同細胞類型，設(shè)置適宜的培養(yǎng)溫度，一般在37℃左右。溫度設(shè)置010302確保培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣流通，避免細胞因缺氧而死亡。氣體環(huán)境0405日常觀察與維護污染跡象排查方法肉眼觀察培養(yǎng)基注意顏色變化、渾濁度及是否有漂浮物。01顯微鏡觀察細胞檢查細胞形態(tài)是否正常，有無細菌、真菌污染跡象。02檢查培養(yǎng)箱環(huán)境確認溫度、濕度及CO2濃度是否適宜細胞生長。03細胞形態(tài)評估要點觀察細胞形態(tài)是否規(guī)則，有無變形、萎縮或腫脹。細胞形態(tài)細胞密度細胞貼壁情況評估細胞密度是否適中，過密可能導(dǎo)致細胞生長受限，過疏則影響細胞功能。貼壁細胞需觀察其貼壁是否牢固，懸浮細胞則需評估其懸浮狀態(tài)。細胞達到80%-90%融合度時需進行傳代。細胞生長狀態(tài)培養(yǎng)基顏色變黃、變稠或營養(yǎng)耗盡時，需進行傳代。培養(yǎng)基消耗情況細胞形態(tài)發(fā)生異常變化，如變圓、透亮或伸出偽足時，可能是傳代信號。細胞形態(tài)變化傳代時機判斷依據(jù)06凍存與復(fù)蘇規(guī)范凍存液梯度降溫流程注意事項在降溫過程中要避免細胞懸液直接暴露于高溫或低溫環(huán)境中，以免影響細胞活性。03將細胞懸液放入細胞凍存盒中，置于-20℃冰箱中過夜，然后再放入-80℃冰箱中長期保存。02梯度降溫初始降溫將細胞懸液放入4℃冰箱中，放置30分鐘左右，讓細胞逐漸適應(yīng)溫度下降。01液氮儲存安全操作儲存容器使用專業(yè)的液氮罐或液氮儲存系統(tǒng)，確保密封性良好，避免液氮泄漏。01儲存環(huán)境液氮罐應(yīng)放置在安全、通風、干燥的環(huán)境中，避免陽光直射和震動。02儲存管理定期檢查液氮罐的液氮量，及時補充液氮，確保細胞長期保存在液氮中。03復(fù)蘇后活性檢測檢測方法計數(shù)板計數(shù)形態(tài)觀察活力檢測采用細胞計數(shù)、細胞形態(tài)觀察和細胞活力檢測等多種方法，評估復(fù)蘇后細胞的活性。使