DB62/T4634—2022牛結節性皮膚病血清學診斷技術2022-10-20實施2022-10-20實施本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由甘肅省農業農村廳提出并監督實施。本文件由甘肅省畜牧業標準化技術委員會歸口。本文件起草單位：中國農業科學院蘭州獸醫研究所、甘肅省動物疫病預防控制中心、靜寧縣畜牧獸醫中心。本文件主要起草人：景志忠、高建平、唐豪、陳國華、張勇、房永祥、何小兵、景偉、李維克、賈懷杰、婁忠子、張春祥、付寶權。I本文件規定了牛結節性皮膚病的血清學診斷方法及其綜合判定。本文件適用于牛結節性皮膚病的快速診斷、檢疫和流行病學調查。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T39602牛結節性皮膚病診斷技術NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存和運輸技術規范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。牛結節性皮膚病lumpyskindisease(LSD)又名牛疙瘩皮膚病，是由痘病毒科脊椎動物亞科山羊痘病毒屬的牛結節性皮膚病病毒(LSDV)感染牛引起的一種傳染病，主要由吸血節肢動物傳播，其臨床特征主要為發熱，皮膚、黏膜和內臟器官表面的廣泛性結節，淋巴結腫大，動物消瘦，產奶量降低，不孕、不育和流產，以及無癥狀的隱性損傷和繼發感染等表現。4樣品采集與生物安全管理LSD臨床病例檢查與剖檢，診斷檢測樣品的采集、運輸和處理按照GB/T39602和NY/T541執行；實驗室血清學試驗以及待檢樣品、培養物和廢棄物處理中的生物安全管理均按GB19489的相關規定執行。5病毒中和試驗(VNT)MEM培養液，綿羊羔睪丸細胞(LTc),MDBK細胞，LSDV抗原及標準陽性、陰性血清，待檢血5.2方法12將log?06TCIDso/mL的山羊將第1份滅活的待檢血清50μL分別加到微量滴定板A到H行的第1、第2列孔中，第2份血清加到第3、第4列孔中，第3份血清加到第5、第6列孔中，第4份血清加到第7、第8列孔中，陰性對照血清加到第9、第10列孔中，50μL不含血清的Eagle's/HEPES液分別加到第11、第12列以及H行的所有孔中。從G行開始用最大稀釋度的病毒液50μL,加到該行的每個孔中。依加入到相應行的各孔中，直到最小病毒稀釋物加到A行。從培養第3d開始，在倒置顯微鏡下每天觀察單層細胞的細胞病變效應(CPE)情況，直至第9d,H行細胞應無CPE。以待檢血清最高稀釋度50%保護為該待檢血清中和效價，以能保護細胞免受感染的最6.1.1濃縮膠：由5%聚丙酰胺Tris(125mM,pH6.8)和SDS(0.1%)組成；6.1.2分離膠：由10%～12.5%聚丙酰胺Tris(560mM,pH8.7)和SDS(0.1%)組成；6.1.3甘氨酸電泳緩沖液：250mMTris、2M甘氨酸和0.1%SDS;6.1.4封閉液：3%BSA和0.05%Tween20PBS,或5%奶粉和0.05%Tween20PBS;DB62/T4634—206.1.6標準蛋白分子質量marker,硝酸纖維素膜(NCM),病毒粒子抗原或重組蛋白抗原。將待檢血清，包括陽性血清、陰性血清各1份，用封閉液1:50稀釋血清，56℃±0.5℃滅活30min后當山羊痘病毒屬病毒感染LTc的CPE達到90%時收獲細胞，凍融三次，離心，取上清轉移到一個新管，加病毒裂解液煮沸5min,作為組織培養的病毒粒子抗原。也可用體外表達的重組蛋白代替病毒粒子6.2.3SDS/PAGE分析將制備的病毒粒子抗原或重組蛋白抗原與標準蛋白分子質量marker同時分別上樣，加到SDSPAGE凝膠孔中，在甘氨酸電泳緩沖PBS充分沖洗，并用3%牛血清白蛋白PBS或5%脫脂奶粉PBS在旋轉振蕩器上4℃±0.5℃封閉過夜。將NCM按組別剪成數個紙條，用PBS在旋轉振蕩器上徹底沖洗5次，的血清(包括陽性和陰性對照血清)中在室溫下震蕩1.5h,再次充分洗滌NCM,并孵育在特定稀釋的辣震蕩孵育3min～7min,在NCM背景即將變色之前用PBS樣品不出現雜交條帶，表示試驗成立。待檢血清樣品至少出現一條雜交帶即注：抗副痘病毒(牛丘疹性口炎或偽牛痘病毒)的高免血清可與LSDV的一些蛋白反應，但不與32kDa蛋白反應，以區7間接ELISA法pH9.6);7.1.3濃縮洗滌緩沖液(25×PBST)(89.5gNa?HPO412H?O,5gKH?PO?,5gKCl,200gNaCl,5mL3學兔兔標準下載47.1.4封閉緩沖液：0.02molL磷酸鹽緩沖液+3%BSA(0.2g磷酸二氫鉀，2.9g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，30gBSA,加去離子水定容到1000mL);7.1.52M終止液(111mL濃硫酸(H?SO?),899mLH?O,30μLProclin300)。用稀釋液對辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG作1:20000稀釋(工作濃度為1:10000～1:20000),每取出微孔板，每孔加終止液(2mol/LH?SO?)50μL。7.3.1試驗成立條件若陰性對照OD450值<0.3,陽性對照OD?50值(P)>1.0,P/N值>3,則試驗成立，結果有效。7.3.2S/N值計算每份待檢樣品的OD450值(S),除以參考陰性對照的OD450值(N),則得出每份待檢樣品的SN值。如果每份待檢樣品或陰、陽性對照有多孔重復，則應計算平均值后再計算S/N值。7.3.3判定標準待檢樣品的S/N≥2,則判定該樣品為陽性；SN<2,則為陰性。8競爭ELISA法8.1材料山羊痘病毒屬病毒抗原或重組蛋白抗原，競爭抗體工作液，鼠抗兔辣根過氧化物酶結合物，LSDV標準陽性血清、標準陰性血清，洗滌緩沖液(PBST),封閉緩沖液；TMB底物，2M終止液。8.2方法8.2.3抗原包被8.2.4競爭抗體制備用PBS將山羊痘病毒屬病毒抗原或重組蛋白抗原稀釋成200μg/mL,與弗氏完全佐劑按體積1:1混合，乳化后采用皮下多點注射免疫健康實驗家兔，每只接種免疫1mL;第一次免疫間隔14d后，用第一次免疫相同的疫苗和劑量進行第2次免疫；第二次免疫再間隔14d后，用加倍蛋白抗原與弗氏不完全佐劑疫苗進行第3次免疫；用第三次免疫相同的疫苗和劑量進行最后一次免疫，免疫接種后14d從家兔心臟采血，稀釋為競爭抗體工作液。8.2.5加血清樣品取已包被抗原的酶標板，每次檢測設標準陽性血清對照、陰性血清對照及空白對照孔，其中標準陽性血清對照設2孔，陰性血清對照設2孔，每孔加入相應血清(陽性或陰性對照血清)50μL/孔；空白對8.2.6加競爭抗體56用稀釋液(即洗滌液)對辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG作1:8000稀釋(工作濃度為1:1000~