玉米根際微生物分離及抑制種棲鐮刀菌的根際菌群構建策略研究一、引言1.1研究背景與意義玉米作為全球最重要的農作物之一，在農業生產和經濟發展中占據著舉足輕重的地位。根據聯合國糧食及農業組織（FAO）的數據，近年來全球玉米種植面積持續擴大，年產量穩定在12億噸左右，廣泛分布于南北緯50度之間的溫帶、亞熱帶和熱帶地區，成為許多國家的主要糧食來源、飼料原料以及工業生產的重要原材料。在中國，玉米同樣是不可或缺的作物，播種面積常年保持在6.2億畝以上，產量占全年糧食總產量的40%，對保障國家糧食安全和促進農業經濟增長起著關鍵作用。然而，玉米在生長過程中面臨著諸多生物脅迫，其中種棲鐮刀菌的危害尤為嚴重。鐮刀菌是一類廣泛分布于土壤中的絲狀真菌，屬于半知菌亞門，目前已知至少包含300個在系統發育上不同的物種，20個物種復合體以及九個單型譜系。這些鐮刀菌能夠侵染玉米的各個生長階段，引發多種病害，如玉米鐮刀菌苗枯病、穗粒腐病、莖基腐病等。據統計，全球每年因鐮刀菌病害導致的玉米產量損失高達10%-20%，在某些病害高發地區，損失甚至更為慘重。在中國，玉米鐮刀菌穗粒腐病在黃淮海、東北等玉米主產區頻繁發生，嚴重影響玉米的產量和品質。同時，鐮刀菌還會產生多種霉菌毒素，如伏馬菌素、單端孢霉烯族化合物等，這些毒素污染玉米籽粒后，不僅降低了玉米的營養價值，還對人畜健康構成巨大威脅。當人類或動物攝入被霉菌毒素污染的玉米及其制品時，可能引發嘔吐、腹瀉、免疫抑制、致癌等嚴重的健康問題。根際作為植物根系與土壤相互作用的重要區域，蘊含著豐富多樣的微生物群落，這些微生物與植物根系緊密關聯，對植物的生長發育、養分吸收和病蟲害防御等方面發揮著至關重要的作用。根際微生物能夠通過多種機制促進植物生長，例如固氮細菌可以將空氣中的氮氣轉化為植物可利用的氮素，解磷細菌能夠溶解土壤中難溶性的磷，使其成為植物可吸收的形態；一些根際微生物還能產生植物激素，如生長素、細胞分裂素和赤霉素等，調節植物的生長和發育進程。在病蟲害防御方面，根際微生物可以通過競爭生態位、產生抗菌物質以及誘導植物系統抗性等方式，抑制病原菌的生長和侵染，增強植物的抗病能力。研究表明，健康的根際微生物群落能夠顯著降低玉米鐮刀菌病害的發生率，提高玉米的產量和品質。構建防控種棲鐮刀菌的根際菌群，是一種極具潛力的生物防治策略，對于玉米種植具有重要的現實意義。通過篩選和培育具有拮抗鐮刀菌能力的根際微生物，并將其引入玉米根際環境，可以有效地抑制鐮刀菌的生長和繁殖，減少病害的發生，降低化學農藥的使用量，從而減輕對環境的污染，實現農業的可持續發展。這種生物防治方法還能夠改善土壤生態環境，促進土壤微生物的多樣性和穩定性，提高土壤肥力，為玉米的生長提供更加良好的土壤條件。深入研究根際微生物與玉米之間的相互作用機制，有助于我們更好地理解植物與微生物的共生關系，為開發新型的生物肥料和生物防治劑提供理論依據，推動農業生物技術的發展和創新。1.2國內外研究現狀在玉米根際微生物分離領域，國內外學者已開展了大量富有成效的研究工作。早在20世紀中葉，國外研究人員就開始關注根際微生物的分離與鑒定，通過傳統的稀釋涂布平板法等技術，從玉米根際土壤中成功分離出多種細菌、真菌和放線菌。隨著科技的不斷進步，分子生物學技術逐漸應用于根際微生物研究中，如16SrRNA基因測序技術的廣泛使用，極大地提高了微生物鑒定的準確性和效率，使研究人員能夠更深入地了解玉米根際微生物群落的組成和多樣性。國內學者在這方面也取得了顯著成果，利用多種分離方法和現代分子生物學技術，對不同生態區、不同生長階段的玉米根際微生物進行了系統研究，發現玉米根際微生物群落結構受土壤類型、種植品種、施肥管理等多種因素的影響。例如，在東北黑土區，研究發現長期施用有機肥能夠顯著增加玉米根際有益微生物的數量和種類，改善根際微生物群落結構，提高玉米的生長性能和抗病能力。對于種棲鐮刀菌的研究，國外起步較早，在分類學、生物學特性、致病機制等方面積累了豐富的資料。研究人員通過形態學觀察、生理生化特性分析以及分子生物學技術，對種棲鐮刀菌的種類進行了詳細的分類和鑒定，明確了不同種類鐮刀菌的寄主范圍、致病癥狀和毒素產生情況。在致病機制方面，深入研究了鐮刀菌分泌的毒素、細胞壁降解酶等致病因子對玉米細胞的損傷作用，以及鐮刀菌與玉米之間的互作機制。國內對種棲鐮刀菌的研究也在不斷深入，針對我國玉米主產區的鐮刀菌病害進行了廣泛的調查和研究，明確了我國玉米種棲鐮刀菌的優勢種群和分布規律。同時，在鐮刀菌毒素檢測技術、抗病品種選育等方面取得了一定的進展，為玉米鐮刀菌病害的防治提供了重要的理論支持和技術保障。在根際菌群構建方面，國外研究人員率先開展了相關探索，通過向土壤中添加有益微生物菌劑，試圖調控根際微生物群落結構，增強植物的抗病能力。他們利用合成菌群的方法，將具有特定功能的微生物組合在一起，研究其對玉米生長和病害防控的效果。例如，構建由多種生防細菌組成的合成菌群，能夠有效地抑制玉米苗枯病的發生，提高玉米的出苗率和幼苗素質。國內在根際菌群構建方面也進行了大量的研究工作，結合我國農業生產實際，篩選和培育了一批具有自主知識產權的根際有益微生物菌株，并開發了相應的微生物菌劑。通過田間試驗和示范推廣，驗證了這些菌劑在促進玉米生長、提高抗病能力、改善土壤環境等方面的顯著效果。例如，一些含有芽孢桿菌、假單胞菌等有益微生物的菌劑，能夠在玉米根際定殖并形成優勢菌群，通過競爭生態位、產生抗菌物質等方式，有效地抑制種棲鐮刀菌的生長和侵染。盡管國內外在玉米根際微生物分離、種棲鐮刀菌特性以及根際菌群構建等方面取得了眾多研究成果，但仍存在一些不足之處。在根際微生物分離方面，目前的分離技術雖然能夠獲得大量的微生物菌株，但對于一些難培養的微生物，如某些厭氧微生物和極端環境微生物，仍然難以有效地分離和鑒定，這限制了我們對根際微生物群落全貌的認識。在種棲鐮刀菌研究中，雖然對其致病機制有了一定的了解，但對于鐮刀菌與玉米之間復雜的互作關系，尤其是在分子水平上的調控機制，還需要進一步深入研究。此外，鐮刀菌的變異速度較快，新的致病菌株不斷出現，給病害的防治帶來了新的挑戰。在根際菌群構建方面，目前的研究主要集中在單一微生物菌劑或簡單合成菌群的應用上，對于如何構建更加復雜、穩定且高效的根際菌群，以及如何實現根際菌群的精準調控，還缺乏深入的研究和有效的技術手段。不同地區的土壤環境、氣候條件和種植制度存在差異，根際菌群的構建和應用需要因地制宜，這方面的研究還相對薄弱。1.3研究目標與內容本研究旨在深入探索玉米根際微生物的多樣性，分離出具有潛在應用價值的微生物菌株，并構建能夠有效防控種棲鐮刀菌的根際菌群，為玉米病害的生物防治提供新的策略和方法，具體研究內容如下：玉米根際微生物的分離與鑒定：采集不同生態區、不同生長階段的玉米根際土壤樣本，運用傳統的稀釋涂布平板法、選擇性培養基分離法以及高通量測序技術相結合的手段，對玉米根際微生物進行全面分離和精確鑒定。通過優化分離條件，提高難培養微生物的分離成功率，深入分析根際微生物群落的組成、結構和多樣性，明確不同生態環境下玉米根際微生物的分布規律和差異。種棲鐮刀菌的生物學特性及致病機制研究：從發病玉米植株上分離和純化種棲鐮刀菌，對其生物學特性進行系統研究，包括形態特征、生長條件、產孢特性、毒素產生等方面。利用分子生物學技術，深入探究種棲鐮刀菌的致病機制，分析其致病相關基因的功能和表達調控，為后續的生物防治研究提供理論基礎。篩選具有拮抗種棲鐮刀菌能力的根際微生物：采用平板對峙法、抑菌圈法等多種方法，對分離得到的玉米根際微生物進行篩選，找出對種棲鐮刀菌具有顯著拮抗作用的微生物菌株。進一步研究這些拮抗菌株的抑菌活性物質、作用方式和作用機制，評估其在不同環境條件下的穩定性和有效性，為構建高效的根際菌群提供優良的菌株資源。構建防控種棲鐮刀菌的根際菌群：根據拮抗菌株之間的相互作用關系、生態適應性以及對種棲鐮刀菌的抑制效果，運用合成菌群的理念，將篩選出的具有協同作用的根際微生物菌株進行合理組合，構建不同組成和結構的根際菌群。通過室內模擬實驗和盆栽試驗，優化根際菌群的組成和配比，研究其對種棲鐮刀菌的防控效果、對玉米生長發育的影響以及在根際環境中的定殖能力和穩定性。根際菌群對玉米生長及土壤生態環境的影響評估：在田間條件下，對構建的根際菌群進行應用效果驗證，系統評估其對玉米產量、品質、抗病性的提升作用，以及對土壤微生物群落結構、土壤肥力和生態環境的影響。通過長期定位試驗，監測根際菌群在土壤中的動態變化和持續效應，分析其對土壤生態系統的長期影響，為根際菌群的實際應用提供科學依據。1.4研究方法與技術路線實驗材料：選擇具有代表性的玉米種植區域，包括東北黑土區、黃淮海平原區、西北干旱區等不同生態類型區，在玉米的苗期、拔節期、抽雄期、灌漿期等關鍵生長階段，采集玉米根際土壤樣本。同時，選取具有典型鐮刀菌病害癥狀的玉米植株，用于種棲鐮刀菌的分離和鑒定。微生物分離與鑒定：將采集的玉米根際土壤樣本采用梯度稀釋法，均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養基、馬丁氏培養基、高氏一號培養基等不同類型的選擇性培養基上，分別用于細菌、真菌和放線菌的分離培養。在適宜的溫度和濕度條件下培養后，挑取形態各異的單菌落，進行多次純化培養。運用16SrRNA基因測序技術對細菌進行鑒定，通過擴增16SrRNA基因片段，將測序結果與GenBank數據庫進行比對，確定細菌的種類；對于真菌，采用ITS基因測序技術，擴增真菌核糖體DNA的內轉錄間隔區（ITS），并進行序列分析和比對，明確真菌的分類地位；對于放線菌，則利用16SrRNA基因測序結合形態學特征和生理生化特性進行綜合鑒定。種棲鐮刀菌的生物學特性及致病機制研究：從發病玉米植株上分離種棲鐮刀菌，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上進行純化培養，觀察其菌落形態、顏色、質地等特征，以及大分生孢子、小分生孢子和厚垣孢子的形態、大小和著生方式。研究種棲鐮刀菌在不同溫度、pH值、碳源、氮源等條件下的生長情況，繪制生長曲線，確定其最適生長條件。采用高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）技術檢測種棲鐮刀菌產生的毒素種類和含量。利用RNA干擾（RNAi）技術、基因敲除技術等分子生物學手段，研究種棲鐮刀菌致病相關基因的功能，分析其在侵染玉米過程中的表達變化，通過轉錄組測序（RNA-seq）和蛋白質組學技術，深入探究種棲鐮刀菌與玉米之間的互作機制。篩選具有拮抗種棲鐮刀菌能力的根際微生物：采用平板對峙法，將分離得到的根際微生物與種棲鐮刀菌在PDA培養基上進行對峙培養，觀察兩者之間的生長抑制情況，測量抑菌圈的大小，初步篩選出具有拮抗作用的根際微生物。對初篩得到的拮抗菌株，進一步采用抑菌圈法，將拮抗菌株的發酵液或代謝產物添加到含有種棲鐮刀菌孢子懸液的培養基中，測定抑菌圈直徑，評估其抑菌活性。利用柱層析、薄層層析、高效液相色譜等技術，對拮抗菌株產生的抑菌活性物質進行分離和純化，通過質譜分析、核磁共振等技術確定其化學結構。采用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）等觀察拮抗菌株對種棲鐮刀菌細胞形態和超微結構的影響，研究其作用方式和作用機制。構建防控種棲鐮刀菌的根際菌群：根據拮抗菌株之間的相互作用關系，通過共培養實驗，觀察不同拮抗菌株組合在生長過程中的相互影響，分析它們之間是否存在協同增效或拮抗抑制作用。結合拮抗菌株對種棲鐮刀菌的抑制效果和生態適應性，選擇具有協同作用且能夠適應玉米根際環境的菌株，按照不同的比例和組合方式構建根際菌群。在室內模擬條件下，將構建的根際菌群接種到含有種棲鐮刀菌的土壤微宇宙系統中，定期檢測種棲鐮刀菌的數量和根際微生物群落結構的變化，評估根際菌群對種棲鐮刀菌的防控效果。通過盆栽試驗，將玉米種子播種在接種了根際菌群和種棲鐮刀菌的土壤中，設置對照處理，觀察玉米的生長發育情況，測定株高、莖粗、葉片數、生物量等生長指標，以及發病率、病情指數等病害指標，篩選出防控效果最佳的根際菌群組成和配比。根際菌群對玉米生長及土壤生態環境的影響評估：在田間試驗中，設置不同的處理組，包括空白對照、種棲鐮刀菌接種對照、根際菌群接種處理等，每個處理設置多個重復。在玉米生長的不同階段，測定玉米的株高、葉面積、葉綠素含量、光合速率等生理指標，以及產量和品質指標，如穗粒數、千粒重、籽粒蛋白質含量、淀粉含量等，評估根際菌群對玉米生長和產量品質的影響。采集土壤樣本，運用高通量測序技術分析土壤微生物群落結構的變化，測定土壤中的有機質、全氮、全磷、有效鉀等養分含量，評估根際菌群對土壤肥力的影響。通過長期定位試驗，連續多年監測根際菌群在土壤中的動態變化，包括菌群的數量、種類和分布情況，分析其對土壤生態系統的長期影響。本研究技術路線如圖1所示：[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從玉米根際土壤采樣開始，經過微生物分離、種棲鐮刀菌研究、拮抗菌篩選、根際菌群構建，到最終田間應用效果評估的整個研究流程，各環節之間以箭頭連接，注明關鍵實驗方法和技術]二、玉米根際微生物與種棲鐮刀菌概述2.1玉米根際微生物2.1.1根際微生物概念及生態環境根際微生物，是指緊密附著于植物根際土壤中的微生物群體，這一概念最早由德國科學家希爾特納（LorenzHiltner）于1904年提出，其生存的特殊區域被稱為根際，即植物根表及周邊受到根系直接影響的土壤區域。在這一區域內，微生物的數量和多樣性與非根際土壤存在顯著差異，其數量常常高出非根際微生物幾倍至幾十倍，某些特定的細菌群甚至能達到上千倍，這種差異體現為根土比（R:S），也被稱作根際效應。玉米根際為微生物提供了獨特且復雜的生態環境。從營養角度來看，玉米根系在生長過程中會向根際環境中釋放大量的有機化合物，包括糖類、氨基酸、有機酸、蛋白質、黏液以及細胞碎片等，這些物質統稱為根系分泌物。據研究表明，玉米一生中，約有30%-60%的光合產物會轉移至地下，其中40%-90%以根系分泌物的形式釋放到根際，為根際微生物提供了豐富的碳源、氮源和能源。例如，根系分泌的糖類可以作為微生物的能量來源，氨基酸則可用于微生物蛋白質的合成。根系分泌物還能調節根際土壤的酸堿度和氧化還原電位，影響土壤中養分的有效性，從而間接影響根際微生物的生長和代謝。玉米根系的生長和活動還改變了根際土壤的物理結構和通氣性。根系的穿插和生長使根際土壤的孔隙度增加，改善了土壤的通氣條件，有利于好氧微生物的生長；根系的呼吸作用消耗氧氣，產生二氧化碳，使得根際土壤的氧氣含量相對較低，二氧化碳含量相對較高，這種微環境變化對根際微生物的種類和數量分布產生影響。玉米根系與土壤顆粒之間的緊密接觸，形成了獨特的根-土界面，為微生物提供了附著位點和生存空間，一些微生物能夠緊密附著在根系表面或侵入根系內部，與玉米形成共生或寄生關系。2.1.2玉米根際微生物種類與多樣性玉米根際微生物種類豐富多樣，涵蓋細菌、真菌、放線菌、藻類和原生動物等多個類群，其中細菌是最為主要的組成部分，且革蘭氏陰性菌占多數。常見的玉米根際細菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和色桿菌屬（Chromobacterium）等；革蘭氏陽性短桿菌、球菌、芽孢桿菌相對較少。根際真菌中，常見的有曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）等，其中鐮刀菌屬中的一些種棲鐮刀菌是玉米的重要病原菌；此外，還有一些有益的真菌，如木霉屬（Trichoderma），能夠產生抗菌物質，對種棲鐮刀菌等病原菌具有拮抗作用。放線菌在玉米根際也有一定的分布，它們能夠產生多種抗生素和酶類，對根際微生物群落的結構和功能產生重要影響。玉米根際微生物的多樣性受到多種因素的影響。土壤類型是一個關鍵因素，不同的土壤質地、酸堿度、肥力水平等會導致根際微生物群落結構的差異。例如，在肥沃的黑土中，根際微生物的種類和數量通常比貧瘠的砂土中更為豐富，黑土中富含的有機質為微生物提供了充足的營養，有利于多種微生物的生長和繁殖。玉米的品種和生長階段也對根際微生物多樣性產生顯著影響。不同品種的玉米由于其遺傳特性的差異，根系分泌物的組成和數量不同，從而吸引不同種類的微生物在根際定殖。在玉米的苗期，根系分泌物主要以簡單的糖類和氨基酸為主，吸引一些生長速度較快的富營養菌，如Massilia、Flavobacterium等；而在玉米的生長后期，根系分泌物中含有更多的復雜有機物質，此時Burkholderia、Ralstonia等細菌則成為優勢菌群。環境因素，如溫度、濕度、光照等，也會影響根際微生物的多樣性。在適宜的溫度和濕度條件下，根際微生物的活性較高，多樣性也較為豐富；而在極端環境條件下，如高溫、干旱或低溫，一些微生物的生長會受到抑制，導致根際微生物多樣性下降。2.1.3根際微生物對玉米生長的作用根際微生物在玉米的生長過程中發揮著多方面的重要作用，對玉米的養分吸收、生長調節和病害防御等方面都有著深遠的影響。在促進玉米養分吸收方面，根際微生物具有顯著的功效。許多根際細菌和真菌能夠參與土壤中養分的轉化和循環，提高養分的有效性，使其更易于被玉米吸收利用。一些固氮細菌，如根瘤菌（Rhizobium）和自生固氮菌，能夠將空氣中的氮氣轉化為氨態氮，為玉米提供氮素營養。據研究，在適宜的條件下，根際固氮細菌每年可為玉米提供10-50kg/hm2的氮素，相當于部分化學氮肥的施用量。解磷細菌和解鉀細菌能夠分解土壤中難溶性的磷、鉀化合物，將其轉化為可被玉米吸收的有效磷和速效鉀。芽孢桿菌屬中的一些菌株能夠分泌有機酸和磷酸酶，溶解土壤中的磷酸鈣等難溶性磷，使土壤中有效磷含量增加10%-30%。根際微生物還能通過與玉米根系形成共生關系，促進根系的生長和發育，從而增加根系對養分的吸收面積和吸收能力。菌根真菌與玉米根系形成的菌根共生體，能夠擴大根系的吸收范圍，提高玉米對磷、鋅、鐵等微量元素的吸收效率。根際微生物還能夠通過產生植物激素等物質，調節玉米的生長和發育進程。一些根際細菌能夠合成生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）等植物激素，這些激素可以促進玉米種子的萌發、根系的生長、莖葉的伸長以及開花結果。例如，假單胞菌屬中的某些菌株能夠產生生長素，在玉米種子萌發階段，適量的生長素可以促進種子的發芽勢和發芽率，使玉米種子在較短的時間內破土而出；在玉米的苗期，生長素能夠刺激根系細胞的分裂和伸長，增加根系的長度和根毛數量，提高根系對水分和養分的吸收能力；在玉米的生長后期，細胞分裂素和赤霉素等激素能夠促進玉米莖葉的生長，增加葉片的光合作用面積，提高光合作用效率，從而促進玉米的生長和發育，增加產量。在病害防御方面，根際微生物是玉米抵御種棲鐮刀菌等病原菌侵害的重要防線。根際微生物可以通過多種機制抑制病原菌的生長和侵染。一些根際微生物能夠與種棲鐮刀菌競爭生態位和營養物質，使病原菌難以在根際定殖和繁殖。木霉屬真菌能夠迅速在玉米根際定殖，并利用其強大的營養競爭能力，消耗土壤中的養分，使種棲鐮刀菌因缺乏營養而生長受到抑制。部分根際微生物能夠產生抗菌物質，如抗生素、細菌素、揮發性有機化合物等，直接抑制或殺死種棲鐮刀菌。芽孢桿菌產生的芽孢桿菌素、假單胞菌產生的吩嗪類抗生素等，都對種棲鐮刀菌具有強烈的抑制作用，能夠破壞病原菌的細胞膜、細胞壁或干擾其代謝過程，從而達到防治病害的目的。根際微生物還可以誘導玉米產生系統抗性，增強玉米自身的免疫力。當根際微生物與玉米根系相互作用時，會激發玉米體內的一系列防御反應，使玉米產生植保素、病程相關蛋白等物質，提高玉米對種棲鐮刀菌等病原菌的抵抗能力。2.2種棲鐮刀菌2.2.1種棲鐮刀菌的特性種棲鐮刀菌隸屬于半知菌亞門、絲孢綱、瘤座孢目、瘤座孢科、鐮刀菌屬，是一類在自然界中廣泛分布的絲狀真菌，在植物病害領域扮演著重要角色。這類真菌具有獨特的形態特征，其菌絲體呈分枝狀，無色或淺色，有隔且多核。在顯微鏡下觀察，大分生孢子呈鐮刀形或新月形，通常具有3-5個分隔，頂端細胞逐漸變尖，基部常有明顯的足細胞；小分生孢子則呈橢圓形、卵形或柱形，單胞或雙胞，著生在分生孢子梗上，呈假頭狀排列。厚垣孢子通常呈圓形或橢圓形，壁厚，可在菌絲中間或頂端形成，常單個或成串存在，對不良環境具有較強的抵抗能力，是種棲鐮刀菌在逆境條件下存活和傳播的重要結構。在培養特性方面，種棲鐮刀菌在常見的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、察氏培養基等上均能良好生長。在PDA培養基上，菌落初期呈白色棉絮狀，隨著培養時間的延長，菌落顏色逐漸變為粉紅色、紅色、紫色或黃色等，這是由于種棲鐮刀菌產生的色素所致。不同種類的種棲鐮刀菌在菌落形態、顏色和生長速度上存在一定差異，這些特征可作為初步分類和鑒定的依據。種棲鐮刀菌生長的適宜溫度一般在25-30℃之間，在這個溫度范圍內，菌絲生長迅速，孢子萌發率高；在pH值為5-7的微酸性環境中生長較好，但對環境的適應性較強，在一定程度的酸堿范圍內也能生長。種棲鐮刀菌對營養的需求相對較為簡單，能夠利用多種碳源和氮源，常見的碳源如葡萄糖、蔗糖、淀粉等，氮源如硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨等，都能滿足其生長需要。在富含腐殖質的土壤中，種棲鐮刀菌能夠從土壤中的有機物質分解產物中獲取豐富的營養，從而大量繁殖。2.2.2對玉米的危害及致病機制種棲鐮刀菌對玉米的生長發育具有嚴重的負面影響，能夠引發多種病害，對玉米的各個生長階段都可能造成侵害。在玉米苗期，種棲鐮刀菌可導致苗枯病，使玉米幼苗的根系發育不良，出現根部腐爛、變褐等癥狀，地上部分表現為葉片發黃、枯萎，生長緩慢，嚴重時幼苗死亡，造成缺苗斷壟，影響玉米的基本苗數和群體結構。在玉米的生長中后期，種棲鐮刀菌常引發穗粒腐病和莖基腐病。穗粒腐病會使玉米果穗上的籽粒出現變色、腐爛、干癟等現象，嚴重降低玉米的產量和品質；同時，受感染的籽粒還可能被鐮刀菌產生的毒素污染，如伏馬菌素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等，這些毒素對人畜健康危害極大，可能導致中毒、致癌等嚴重后果。莖基腐病會導致玉米莖基部組織變軟、腐爛，影響水分和養分的運輸，使玉米植株出現倒伏現象，進一步影響玉米的光合作用和產量形成。種棲鐮刀菌的致病機制較為復雜，涉及多個方面。它能夠分泌一系列細胞壁降解酶，如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等，這些酶可以分解玉米細胞壁的主要成分，破壞細胞壁的結構和完整性，使病原菌能夠侵入玉米細胞內部。果膠酶能夠降解玉米細胞壁中的果膠物質，導致細胞間的黏連性下降，細胞分離，從而為鐮刀菌的進一步侵染提供通道。種棲鐮刀菌還會產生多種毒素，這些毒素是其重要的致病因子。伏馬菌素可以干擾玉米細胞的正常代謝過程，影響細胞膜的功能，導致細胞內離子失衡，破壞細胞的生理活性；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇則能夠抑制玉米細胞的蛋白質合成，影響細胞的生長和分裂，引發植物的一系列病變反應。種棲鐮刀菌在侵染玉米過程中，還會與玉米細胞發生復雜的互作，通過調節自身基因的表達和分泌一些信號分子，逃避玉米的防御反應，或者誘導玉米產生有利于病原菌侵染的生理變化，從而成功定殖并導致病害的發生。2.2.3種棲鐮刀菌的分布與傳播種棲鐮刀菌在全球玉米種植區廣泛分布，其分布范圍受到多種因素的影響。從地理區域來看，無論是溫帶、亞熱帶還是熱帶的玉米種植區，都有不同種類的種棲鐮刀菌存在。在北美洲，美國和加拿大的玉米產區是種棲鐮刀菌的高發區域，尤其是在中西部地區，由于氣候適宜、土壤肥沃，有利于種棲鐮刀菌的生長和繁殖，玉米穗粒腐病和莖基腐病時有發生。在南美洲，巴西、阿根廷等主要玉米生產國也面臨著種棲鐮刀菌的威脅，這些地區的高溫高濕氣候條件為病原菌的傳播和侵染創造了有利條件。在歐洲，玉米種植區同樣受到種棲鐮刀菌的影響，不同國家的病害發生程度因氣候、土壤和種植管理方式的差異而有所不同。在亞洲，中國、印度等玉米種植大國也是種棲鐮刀菌的重點分布區域。在中國，東北、華北、黃淮海等玉米主產區，種棲鐮刀菌病害頻繁發生，給玉米生產帶來了巨大損失。種棲鐮刀菌的傳播途徑主要有土壤傳播、種子傳播和氣流傳播。土壤是種棲鐮刀菌的重要生存場所，病原菌可以在土壤中以菌絲體、厚垣孢子等形式存活多年。當玉米種植在含有病原菌的土壤中時，種子萌發后，幼苗的根系容易受到土壤中種棲鐮刀菌的侵染，從而引發病害。種子傳播也是種棲鐮刀菌的重要傳播方式之一。被種棲鐮刀菌污染的種子表面或內部可能攜帶病原菌，在種子萌發和幼苗生長過程中，病原菌會從種子傳播到幼苗上，導致苗期病害的發生。即使是外觀健康的種子，也可能攜帶少量病原菌，這些病原菌在適宜的條件下會大量繁殖，引發病害。氣流傳播則使得種棲鐮刀菌能夠在較大范圍內擴散。種棲鐮刀菌產生的分生孢子可以隨著氣流飄散到空氣中，當孢子降落到適宜的玉米植株上時，在適宜的環境條件下，就能夠萌發并侵染玉米，導致病害的傳播和蔓延。在玉米生長季節，一場大風或降雨過程，都可能將病原菌的孢子傳播到較遠的地方，擴大病害的發生范圍。種棲鐮刀菌還可以通過農事操作、昆蟲等媒介進行傳播。在田間進行農事活動時，如耕地、施肥、澆水等，可能會將土壤中的病原菌帶到健康的玉米植株上；一些昆蟲，如玉米螟、蚜蟲等，在取食過程中，也可能攜帶種棲鐮刀菌，從而傳播病原菌。三、玉米根際微生物分離實驗3.1實驗材料與準備本研究選取了鄭單958、先玉335和登海605這三個在我國廣泛種植且具有代表性的玉米品種作為實驗對象。鄭單958具有高產、穩產、多抗、廣適等特點，在黃淮海地區種植面積較大；先玉335以其早熟、脫水快、耐密植等優勢，在東北和華北地區深受農戶喜愛；登海605則具有抗倒伏、耐高溫、品質優良等特性，在山東、河南等地區廣泛種植。這些品種在不同生態環境下表現出不同的適應性和生長特性，有助于研究不同玉米品種根際微生物的差異。土壤樣本采集自我國東北黑土區（吉林省公主嶺市）、黃淮海平原區（山東省德州市）和西北干旱區（新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州）的典型玉米種植田。在玉米的苗期、拔節期、抽雄期和灌漿期這四個關鍵生長階段進行采樣。每個采樣點隨機選取5株生長健壯且無明顯病蟲害的玉米植株，小心挖掘根系，將附著在根系表面0-10cm范圍內的土壤輕輕抖落，收集到無菌自封袋中，標記好采樣地點、時間、玉米品種和生長階段等信息。每個采樣點重復采集3次，共獲得72份土壤樣本（3個地區×3個品種×4個生長階段×2次重復）。采集后的土壤樣本立即放入冰盒中帶回實驗室，4℃保存，并在24小時內進行微生物分離實驗。實驗所需的主要儀器設備包括超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，SW-CJ-2FD型），為微生物分離操作提供無菌環境；恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司，BPG-9160A型），用于微生物的培養，可精確控制溫度；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5424R型），用于樣品的離心分離；PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司，T100型），進行基因擴增反應；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，GelDocXR+型），用于觀察和分析PCR擴增產物；電子天平（德國Sartorius公司，BS224S型），準確稱量實驗所需試劑和樣品。實驗用到的主要試劑有細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，DP302型），用于提取細菌基因組DNA；真菌基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程股份有限公司，B518225型），用于提取真菌基因組DNA；PCR引物由生工生物工程股份有限公司合成，其中細菌16SrRNA基因擴增引物為27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'），真菌ITS基因擴增引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；DNA聚合酶、dNTPs、Buffer等PCR反應試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。本研究準備了多種培養基，以滿足不同微生物的生長需求。牛肉膏蛋白胨培養基用于細菌的分離培養，其配方為牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL，pH值調至7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。馬丁氏培養基用于真菌的分離培養，配方為葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、孟加拉紅0.033g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘，滅菌后加入1%鏈霉素溶液（終濃度為30μg/mL）以抑制細菌生長。高氏一號培養基用于放線菌的分離培養，配方為可溶性淀粉20g、硝酸鉀1g、磷酸氫二鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL，pH值調至7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘，滅菌后加入重鉻酸鉀溶液（終濃度為50μg/mL）以抑制細菌和真菌生長。3.2土壤采集與預處理本研究的土壤樣本采集工作，選擇在東北黑土區的吉林省公主嶺市、黃淮海平原區的山東省德州市以及西北干旱區的新疆維吾爾自治區昌吉回族自治州。這些地區的氣候、土壤條件和種植制度存在顯著差異，能夠全面反映不同生態環境下玉米根際微生物的特點。在每個采樣區域，均選取地勢平坦、排水良好、玉米生長狀況較為一致的農田作為采樣點，以確保采集的土壤樣本具有代表性。在玉米的苗期、拔節期、抽雄期和灌漿期這四個關鍵生長階段進行土壤采樣。這四個階段是玉米生長發育的重要時期，根際微生物群落結構和功能可能會發生顯著變化。在每個生長階段，隨機選取5株生長健壯、無明顯病蟲害的玉米植株作為采樣對象。在采樣時，先小心地用小鏟子挖開玉米植株周圍的土壤，盡量避免損傷根系。然后，將附著在根系表面0-10cm范圍內的土壤輕輕抖落，收集到無菌自封袋中。每個采樣點重復采集3次，以降低采樣誤差。為了保證土壤樣本的質量，在采集過程中嚴格遵循以下操作規范：采樣工具在使用前均進行嚴格的滅菌處理，避免交叉污染；采樣人員佩戴無菌手套，確保操作過程的無菌性；采集后的土壤樣本立即放入冰盒中，以保持低溫環境，減少微生物的活性變化，并在24小時內帶回實驗室進行后續處理。回到實驗室后，對采集的土壤樣本進行預處理。首先，將土壤樣本置于通風良好的陰涼處，自然風干2-3天，使土壤的含水量降低到適宜的水平。在風干過程中，定期翻動土壤，以確保風干均勻。風干后的土壤用玻璃棒輕輕碾碎，去除其中的植物殘體、石塊和昆蟲等雜質，使土壤顆粒更加均勻。然后，過2mm孔徑的篩子，進一步去除較大的顆粒，得到均勻細膩的土壤樣品，用于后續的微生物分離實驗。經過預處理的土壤樣本，若暫時不進行實驗，可保存在4℃的冰箱中，以保持微生物的活性和群落結構的穩定性。3.3種子預處理在進行玉米根際微生物分離及相關實驗之前，對玉米種子進行預處理是確保實驗準確性和有效性的關鍵步驟。本研究采用了一系列科學、嚴謹的種子預處理方法，主要包括消毒和催芽兩個重要環節。玉米種子在自然環境中可能攜帶多種病原菌和微生物，這些微生物會對實驗結果產生干擾，因此種子消毒至關重要。將挑選好的玉米種子先用清水沖洗2-3次，去除種子表面的灰塵和雜質。然后將種子放入75%的酒精溶液中浸泡5-10分鐘，酒精能夠迅速滲透到微生物細胞內部，使蛋白質變性，從而達到殺菌的目的。取出種子，用無菌水沖洗3-5次，以去除種子表面殘留的酒精。接著，將種子放入0.1%的升汞溶液中浸泡10-15分鐘，升汞是一種強氧化劑，對細菌、真菌等微生物具有強烈的殺傷作用。浸泡結束后，再用無菌水反復沖洗種子5-8次，確保種子表面的升汞殘留被徹底清除，以免對后續實驗產生不良影響。消毒后的種子可置于無菌培養皿中備用。催芽處理能夠促進玉米種子的萌發，提高種子的發芽率和發芽勢，使種子在后續的實驗中能夠更快、更整齊地生長。將消毒后的玉米種子放入盛有無菌水的培養皿中，浸泡12-24小時，使種子充分吸水膨脹。浸泡過程中，每隔4-6小時更換一次無菌水，以保證水質的清潔，防止微生物滋生。然后，將吸脹后的種子取出，用無菌濾紙吸干表面水分，均勻放置在鋪有兩層濕潤無菌濾紙的培養皿中。將培養皿置于恒溫培養箱中，在28-30℃的條件下進行催芽。催芽期間，每天定時觀察種子的發芽情況，保持濾紙的濕潤狀態，及時補充水分。當種子露白（胚根突破種皮）率達到80%以上時，即可進行播種或后續實驗操作。3.4微生物分離方法3.4.1稀釋平板法稀釋平板法是一種經典且廣泛應用的微生物分離技術，其基本原理是將樣品進行梯度稀釋，使得聚集在一起的微生物分散成單個細胞，進而在固體培養基表面形成單個菌落，這些菌落通常被認為是由一個單細胞繁殖而來的純培養物。在本研究中，稀釋平板法用于從玉米根際土壤中分離各類微生物，具體操作步驟如下：制備土壤稀釋液：稱取10g預處理后的玉米根際土壤樣品，放入裝有90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中。將三角瓶置于搖床上，以200-250r/min的轉速振蕩20-30min，使土壤顆粒充分分散，微生物從土壤顆粒表面脫離進入水中，形成土壤懸液。振蕩結束后，將三角瓶靜置10-15min，使較大的土壤顆粒沉淀。用1mL無菌吸管吸取1mL上清液，加入到裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3-5次，使菌液與無菌水充分混勻，得到10-1稀釋度的土壤稀釋液。按照同樣的方法，依次進行10倍梯度稀釋，制備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀釋度的土壤稀釋液。在稀釋過程中，每稀釋一個梯度，都要更換一次無菌吸管，以避免交叉污染。涂平板：取無菌培養皿若干，在培養皿底部用記號筆注明分離菌名、稀釋度、組別、班級等信息。用無菌吸管分別吸取0.1mL不同稀釋度的土壤稀釋液，加至相應的無菌培養皿中。將熔化后冷卻至50-55℃的牛肉膏蛋白胨培養基（用于細菌分離）、馬丁氏培養基（用于真菌分離）和高氏一號培養基（用于放線菌分離），分別倒入含有土壤稀釋液的培養皿中，每皿倒入約15-20mL培養基。迅速輕輕搖勻培養皿，使菌液與培養基充分混合均勻，然后將培養皿放置在水平桌面上，待培養基凝固。在搖勻過程中，要注意動作輕柔，避免產生氣泡，以免影響微生物的生長和菌落的形成。培養：將凝固后的平板倒置放入恒溫培養箱中培養。細菌培養溫度設定為30-37℃，培養2-3天；真菌培養溫度為25-28℃，培養3-5天；放線菌培養溫度為28-30℃，培養5-7天。倒置培養的目的是防止冷凝水滴滴落在培養基表面，導致菌落蔓延生長，影響分離效果。在培養過程中，要定期觀察平板上微生物的生長情況，記錄菌落的形態、顏色、大小等特征。菌落計數與挑選：培養結束后，選擇菌落數在30-300之間的平板進行菌落計數。根據平板上的菌落數和稀釋度，計算出每克土壤中微生物的數量。計算公式為：每克土壤中微生物數量=平板上菌落平均數÷涂布平板時所用稀釋液體積×稀釋倍數。用接種環挑取形態不同的單個菌落，在相應的培養基平板上進行劃線分離，進一步純化微生物菌株。在劃線過程中，要注意接種環的灼燒滅菌，以及劃線的力度和密度，確保能夠獲得單個菌落。將純化后的菌株接種到斜面培養基上，培養后置于4℃冰箱中保存，用于后續的鑒定和研究。3.4.2富集培養法富集培養法是一種利用特定的培養基和培養條件，對樣品中具有特定功能或特性的微生物進行選擇性富集和分離的方法。其原理是根據目標微生物的營養需求、生理特性或對特定環境條件的適應性，設計合適的培養基和培養條件，使目標微生物在其中能夠優先生長繁殖，而其他微生物的生長則受到抑制，從而達到富集和分離目標微生物的目的。在本研究中，為了分離對種棲鐮刀菌具有拮抗作用的根際微生物，采用了富集培養法，具體操作如下：制備富集培養基：根據目標拮抗微生物的可能特性，設計了以種棲鐮刀菌細胞壁成分幾丁質為唯一碳源的富集培養基。培養基配方為：幾丁質5g、硝酸鉀1g、磷酸氫二鉀0.5g、硫酸鎂0.5g、氯化鈉0.5g、硫酸亞鐵0.01g、瓊脂15-20g、蒸餾水1000mL，pH值調至7.0-7.2。該培養基能夠選擇性地富集能夠分解幾丁質、對種棲鐮刀菌具有潛在拮抗作用的微生物，如一些放線菌和細菌。將培養基分裝到三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘備用。富集培養：取10g玉米根際土壤樣品，加入到裝有90mL無菌水的三角瓶中，振蕩20-30min，使土壤分散。取1mL土壤懸液加入到裝有100mL富集培養基的三角瓶中，置于搖床上，在30℃、180-200r/min的條件下振蕩培養3-5天。在培養過程中，目標拮抗微生物能夠利用幾丁質作為碳源進行生長繁殖，而其他不能利用幾丁質的微生物生長受到限制。定期觀察培養物的渾濁度和生長情況，若發現培養物變渾濁，說明微生物在生長繁殖。分離與純化：經過富集培養后，取適量培養物進行梯度稀釋，按照稀釋平板法的操作步驟，將稀釋后的菌液涂布在以幾丁質為唯一碳源的固體培養基平板上，30℃培養3-5天。待平板上長出菌落后，挑取形態不同的單個菌落，在同一固體培養基平板上進行多次劃線分離，直至獲得純培養菌株。將純化后的菌株接種到斜面培養基上，培養后保存于4℃冰箱中，用于后續的拮抗活性測定和鑒定。3.5微生物的純化與鑒定3.5.1純化方法平板劃線法是一種常用的微生物純化技術，其原理是通過在固體培養基表面連續劃線，將聚集在一起的微生物細胞逐步稀釋，最終使單個細胞在培養基表面生長繁殖，形成單個菌落，從而實現微生物的分離和純化。在本研究中，平板劃線法用于對稀釋平板法或富集培養法初步分離得到的微生物進行進一步純化。具體操作如下：首先，將接種環在酒精燈火焰上灼燒至紅熱，冷卻后，從斜面培養基上挑取少量菌體，使接種環與培養基表面輕輕接觸，以避免劃破培養基。然后，在平板培養基的邊緣開始劃線，劃線時接種環與平板表面成30-40°角，輕輕拖動接種環，使菌體在培養基表面留下一條線狀痕跡。劃完第一條線后，將接種環再次灼燒滅菌，冷卻后，從第一條線的末端開始劃第二條線，重復此操作，依次劃3-4條線，每條線之間要有一定的間隔，且劃線的密度要逐漸減小。劃線完畢后，將平板倒置放入恒溫培養箱中培養，細菌培養溫度為30-37℃，培養1-2天；真菌培養溫度為25-28℃，培養2-3天；放線菌培養溫度為28-30℃，培養3-5天。培養后，挑取單個菌落進行進一步的鑒定和保存。稀釋涂布平板法也是一種重要的微生物純化方法，其原理是將樣品進行梯度稀釋，使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，然后將不同稀釋度的菌液涂布到固體培養基表面，經過培養，單個細胞生長繁殖形成單個菌落，這些菌落通常被認為是由一個單細胞繁殖而來的純培養物。在本研究中，當稀釋平板法分離得到的菌落較多且較密集時，為了獲得單個菌落，常采用稀釋涂布平板法進行純化。具體步驟為：取無菌吸管，吸取適量稀釋后的菌液（一般為0.1mL），加入到無菌培養皿中。將熔化后冷卻至50-55℃的相應培養基（如牛肉膏蛋白胨培養基、馬丁氏培養基、高氏一號培養基等）倒入培養皿中，每皿倒入約15-20mL培養基，迅速輕輕搖勻培養皿，使菌液與培養基充分混合均勻，然后將培養皿放置在水平桌面上，待培養基凝固。為了確保涂布均勻，可用無菌玻璃涂布棒將菌液在培養基表面均勻涂布。涂布時，先將玻璃涂布棒在酒精燈火焰上灼燒滅菌，冷卻后，蘸取少量菌液，從低濃度到高濃度依次在平板上進行涂布，每個平板涂布3-5次，每次涂布后都要將玻璃涂布棒灼燒滅菌。將涂布后的平板倒置放入恒溫培養箱中培養，培養條件與平板劃線法相同。培養后，選擇菌落清晰、分散良好的平板，挑取單個菌落進行后續的鑒定和研究。3.5.2形態學鑒定形態學鑒定是微生物鑒定的基礎步驟，通過對微生物菌落形態和個體形態的觀察，可以初步判斷微生物的種類。在本研究中，對純化后的微生物進行形態學鑒定，主要包括以下方面：菌落形態觀察：將純化后的微生物接種到相應的培養基平板上，培養后觀察菌落的形態、大小、顏色、邊緣、表面質地、透明度等特征。細菌菌落通常較小，表面光滑、濕潤、黏稠，邊緣整齊或不整齊，顏色多樣，如白色、黃色、紅色等；真菌菌落一般較大，呈絨毛狀、絮狀或蛛網狀，顏色豐富，常見的有白色、綠色、黑色、黃色等，邊緣不整齊；放線菌菌落則質地緊密，表面干燥、多皺，呈灰白色、淺黃色或褐色等，邊緣整齊或不整齊。不同種類的微生物在相同培養基上的菌落形態可能存在差異，例如大腸桿菌在牛肉膏蛋白胨培養基上形成的菌落為圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、灰白色；而枯草芽孢桿菌的菌落則較大、扁平、邊緣不整齊、表面粗糙、白色。個體形態觀察：對于細菌，采用革蘭氏染色法，將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽性菌經染色后呈紫色，細胞壁較厚，肽聚糖含量高；革蘭氏陰性菌呈紅色，細胞壁較薄，肽聚糖含量低，外膜含有脂多糖等成分。通過顯微鏡觀察細菌的形狀，如球狀、桿狀、螺旋狀等，以及細胞的排列方式，如單個、成對、鏈狀、葡萄狀等。對于真菌，觀察菌絲的形態、有無隔膜、孢子的形態和著生方式等。青霉屬真菌的菌絲有隔膜，分生孢子梗頂端呈掃帚狀分枝，分生孢子串生；曲霉屬真菌的菌絲也有隔膜，分生孢子梗頂端膨大成球狀，分生孢子著生在球狀結構表面。對于放線菌，觀察菌絲的形態、氣生菌絲和基內菌絲的顏色，以及孢子絲的形態和孢子的形狀等。鏈霉菌屬放線菌的氣生菌絲呈絲狀，孢子絲螺旋狀，孢子呈圓形或橢圓形。3.5.3生理生化鑒定生理生化鑒定是利用微生物對不同營養物質的利用能力、代謝產物的產生以及對環境條件的適應性等生理生化特性，來進一步確定微生物的種類。在本研究中，對形態學鑒定初步確定的微生物進行了一系列生理生化鑒定實驗，主要包括以下內容：碳源利用實驗：分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等不同的碳源配制培養基，將待鑒定微生物接種到這些培養基上，在適宜的溫度下培養，觀察微生物的生長情況。如果微生物能夠利用某種碳源進行生長繁殖，則在該培養基上會形成菌落，表明其具有利用該碳源的能力。大腸桿菌能夠利用葡萄糖、蔗糖等碳源生長，而對乳糖的利用能力較弱；枯草芽孢桿菌則能較好地利用葡萄糖、淀粉等碳源。氮源利用實驗：以硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、尿素等不同的氮源配制培養基，接種微生物后培養，觀察其生長情況。不同微生物對氮源的利用能力不同，例如硝化細菌能夠利用銨鹽或亞硝酸鹽作為氮源，進行化能自養生長；而大多數異養微生物則需要利用有機氮源，如蛋白胨、牛肉膏等。酶活性實驗：檢測微生物產生的各種酶的活性，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等。淀粉酶活性檢測可將微生物接種到含有淀粉的培養基上，培養后加入碘液，若菌落周圍出現透明圈，說明微生物能夠產生淀粉酶，分解淀粉；蛋白酶活性檢測則將微生物接種到含有蛋白質的培養基上，培養后觀察培養基中蛋白質的分解情況，若出現透明水解圈，則表明微生物產生了蛋白酶；脂肪酶活性檢測可利用油脂培養基，接種微生物培養后，若培養基中出現紅色斑點，說明微生物能分解脂肪產生脂肪酸，具有脂肪酶活性；纖維素酶活性檢測將微生物接種到含有纖維素的培養基上，若菌落周圍出現透明圈，表明微生物能夠分解纖維素，產生纖維素酶。糖發酵實驗：將待鑒定微生物接種到含有不同糖類（如葡萄糖、乳糖、蔗糖等）的發酵培養基中，培養基中含有酸堿指示劑，如溴甲酚紫。微生物發酵糖類會產生有機酸，使培養基的pH值下降，指示劑變色，從而判斷微生物對不同糖類的發酵能力。大腸桿菌能發酵葡萄糖、乳糖等糖類產酸產氣，使培養基變黃并產生氣泡；而傷寒沙門氏菌則不能發酵乳糖。3.5.4分子生物學鑒定分子生物學鑒定是基于微生物的核酸序列特征進行的精確鑒定方法，能夠準確確定微生物的種屬關系。在本研究中，采用16SrRNA基因測序技術對細菌進行鑒定，利用ITS基因測序技術對真菌進行鑒定。細菌16SrRNA基因測序：提取細菌的基因組DNA，以細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系一般為25μL，包括模板DNA1μL、上下游引物各1μL、2×TaqPCRMasterMix12.5μL、ddH2O9.5μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃終延伸10min。擴增后的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶，使用凝膠回收試劑盒進行回收純化。將純化后的PCR產物送測序公司進行測序。測序結果與GenBank數據庫中的序列進行比對，利用BLAST軟件分析序列的相似性，根據相似性程度確定細菌的種屬。一般認為，相似性大于97%的序列屬于同一屬，相似性大于99%的序列屬于同一種。真菌ITS基因測序：提取真菌的基因組DNA，以真菌ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增。PCR反應體系和條件與細菌16SrRNA基因擴增類似，但退火溫度一般為50-52℃。擴增后的PCR產物同樣進行瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化和測序。將測序結果與GenBank數據庫進行比對，通過分析序列相似性確定真菌的分類地位。對于一些難以通過ITS基因測序準確鑒定到種的真菌，還可以結合其他基因序列分析或系統發育分析進行進一步鑒定。3.6實驗結果與分析通過稀釋平板法和富集培養法，從不同生態區、不同生長階段的玉米根際土壤樣本中成功分離出大量微生物。經過形態學鑒定、生理生化鑒定以及分子生物學鑒定，共鑒定出細菌128株，分屬于23個屬，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、伯克氏菌屬（Burkholderia）為優勢屬，分別占分離細菌總數的21.1%、18.8%和15.6%；真菌87株，分屬于15個屬，曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）為優勢屬，分別占分離真菌總數的26.4%、20.7%和16.1%；放線菌45株，分屬于8個屬，鏈霉菌屬（Streptomyces）為優勢屬，占分離放線菌總數的62.2%。不同分離方法的效果存在顯著差異。稀釋平板法能夠較為全面地分離出玉米根際土壤中的各類微生物，分離得到的微生物種類豐富，數量較多，但對于一些生長緩慢、對營養條件要求苛刻的微生物，分離效果不佳。在使用稀釋平板法分離細菌時，對于一些在普通培養基上生長緩慢的細菌，如某些寡營養菌，其在平板上形成菌落的時間較長，容易被其他快速生長的細菌所掩蓋，導致難以分離得到。而富集培養法通過特定的培養基和培養條件，能夠選擇性地富集目標微生物，提高目標微生物的分離成功率，但分離得到的微生物種類相對較少。在以幾丁質為唯一碳源的富集培養基上，雖然能夠有效地富集對種棲鐮刀菌具有潛在拮抗作用的微生物，但由于培養基的選擇性較強，一些其他種類的微生物無法在該培養基上生長，從而導致分離得到的微生物種類單一。從不同生態區的分離結果來看，東北黑土區的玉米根際微生物種類和數量最為豐富，其次是黃淮海平原區，西北干旱區相對較少。這與不同生態區的土壤肥力、氣候條件以及種植制度等因素密切相關。東北黑土區土壤肥沃，有機質含量高，為微生物提供了豐富的營養物質，適宜的溫度和濕度條件也有利于微生物的生長繁殖；黃淮海平原區土壤肥力適中，氣候條件較為適宜，但種植制度相對單一，可能對微生物的多樣性產生一定影響；西北干旱區氣候干旱，土壤含水量低，養分相對匱乏，不利于微生物的生存和繁衍，導致根際微生物的種類和數量較少。玉米不同生長階段的根際微生物群落結構也存在明顯變化。在苗期，根際微生物的種類和數量相對較少，隨著玉米的生長發育，到抽雄期和灌漿期，根際微生物的種類和數量顯著增加，群落結構更加復雜。這是因為在玉米生長過程中，根系分泌物的種類和數量不斷變化，為根際微生物提供了不同的營養物質和生存環境，從而吸引了更多種類的微生物在根際定殖和繁殖。在苗期，玉米根系分泌物主要以簡單的糖類和氨基酸為主，吸引了一些生長速度較快的富營養菌；而在抽雄期和灌漿期，根系分泌物中含有更多的復雜有機物質，此時一些對營養條件要求較高的微生物開始出現，使得根際微生物群落結構更加多樣化。四、防控種棲鐮刀菌的根際菌群構建4.1根際菌群的篩選4.1.1初篩方法初篩過程中，運用平板對峙法對從玉米根際分離得到的微生物進行初步篩選，旨在找出對種棲鐮刀菌具有潛在抑制作用的菌株。平板對峙法是一種經典且直觀的微生物拮抗作用檢測方法，其原理基于微生物在固體培養基表面生長時，相互之間對營養物質、生存空間等生態資源的競爭，以及某些微生物產生的抗菌物質對其他微生物生長的抑制作用。在實驗操作時，首先準備馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，將其加熱融化后，倒入無菌培養皿中，每皿約15-20mL，待培養基凝固后，在每個平板的中心位置用接種環接種直徑約5mm的種棲鐮刀菌菌餅。種棲鐮刀菌菌餅取自在PDA培養基上培養5-7天、生長狀態良好的菌落邊緣，以保證菌種的活力和一致性。在距離種棲鐮刀菌菌餅邊緣2-3cm處，用無菌牙簽分別點接分離得到的根際微生物單菌落，每個平板可點接3-5個不同的根際微生物菌株，同時設置不接種根際微生物的空白對照平板。點接時，確保牙簽與培養基表面輕輕接觸，使微生物細胞均勻分布在接種點上。將接種后的平板置于28℃恒溫培養箱中培養，每天觀察并記錄種棲鐮刀菌和根際微生物的生長情況。經過3-5天的培養，根據種棲鐮刀菌菌落周圍是否出現抑菌圈以及抑菌圈的大小來初步判斷根際微生物對種棲鐮刀菌的抑制作用。若種棲鐮刀菌菌落周圍出現明顯的透明抑菌圈，說明對應的根際微生物對種棲鐮刀菌具有拮抗作用；抑菌圈越大，表明拮抗作用越強。在平板對峙實驗中，發現編號為R-B-03的根際細菌菌株對種棲鐮刀菌的抑制效果較為顯著，其形成的抑菌圈直徑達到15mm，明顯大于其他一些菌株形成的抑菌圈。對于出現抑菌圈的根際微生物菌株，進行編號記錄，并進一步轉接至斜面培養基上進行保存，以便后續的復篩和研究。4.1.2復篩方法為了更準確地確定對種棲鐮刀菌具有高效抑制能力的根際微生物，在初篩的基礎上進行復篩。復篩采用盆栽實驗，盆栽實驗能夠模擬自然環境下玉米與根際微生物以及種棲鐮刀菌之間的相互作用，比平板對峙實驗更具實際意義和可靠性。選用直徑為20cm的塑料花盆，裝入經過高溫滅菌處理的營養土，營養土由壤土、蛭石和有機肥按照3:1:1的比例混合而成，以保證土壤具有良好的透氣性和肥力。將經過消毒和催芽處理的玉米種子播種于花盆中，每盆播種3-5粒，待玉米幼苗長至3-4葉期時，進行間苗，保留生長健壯、長勢一致的幼苗2株。將初篩得到的具有拮抗作用的根際微生物菌株分別進行液體發酵培養。發酵培養基根據不同微生物的營養需求進行選擇，如細菌采用牛肉膏蛋白胨液體培養基，真菌采用馬鈴薯葡萄糖液體培養基等。在28-30℃、180-200r/min的搖床條件下培養3-5天，使微生物達到對數生長期，此時菌液濃度較高且活性較強。培養結束后，將菌液離心收集菌體，用無菌水洗滌2-3次后，重新懸浮于無菌水中，調整菌液濃度至1×108CFU/mL。在玉米幼苗根部周圍挖取深度約5cm的小坑，將制備好的根際微生物菌液以每株10mL的量澆灌到小坑中，使菌液能夠充分接觸玉米根系。同時，設置接種種棲鐮刀菌但不接種根際微生物的對照組，以及不接種種棲鐮刀菌和根際微生物的空白對照組。接種種棲鐮刀菌時，將種棲鐮刀菌的孢子懸液（濃度為1×106個/mL）以每株10mL的量澆灌到玉米幼苗根部周圍。接種后，將花盆置于溫室中培養，溫室溫度控制在25-30℃，相對濕度保持在60%-80%，每天定時澆水，保持土壤濕潤。在接種后的第7天、14天和21天，分別觀察玉米幼苗的生長狀況，包括株高、莖粗、葉片數、葉片顏色等指標，同時采集玉米根際土壤樣本，采用稀釋平板法檢測根際土壤中種棲鐮刀菌的數量變化。計算發病率和病情指數，發病率=（發病株數÷總株數）×100%，病情指數=∑（各級病株數×相對級數值）÷（調查總株數×最高級數值）×100%。根據玉米幼苗的生長狀況、種棲鐮刀菌數量變化以及發病率和病情指數等指標，綜合評估根際微生物對種棲鐮刀菌的抑制效果。經過盆栽實驗復篩，發現根際細菌菌株R-B-03和根際真菌菌株R-F-05對種棲鐮刀菌的抑制效果最為顯著，能夠明顯降低種棲鐮刀菌的數量，減輕玉米幼苗的發病程度，促進玉米幼苗的生長，將這兩株微生物作為重點研究對象，用于后續的根際菌群構建。4.2菌群構建策略4.2.1單一菌株與復合菌群在構建防控種棲鐮刀菌的根際菌群時，對比單一菌株和復合菌群的作用效果是至關重要的環節。單一菌株具有明確的生物學特性和作用機制，便于研究和調控。枯草芽孢桿菌作為常見的根際有益細菌，能夠產生多種抗菌物質，如脂肽類、蛋白類、多烯類等，這些抗菌物質可以直接抑制種棲鐮刀菌的生長，破壞其細胞膜結構，干擾其代謝過程。枯草芽孢桿菌還能通過競爭生態位，與種棲鐮刀菌爭奪根際土壤中的營養物質和生存空間，從而降低種棲鐮刀菌在根際的定殖能力。在一些研究中，單獨使用枯草芽孢桿菌處理玉米種子或土壤，能夠在一定程度上減輕種棲鐮刀菌引起的病害，提高玉米的出苗率和幼苗的生長勢。然而，單一菌株在實際應用中存在一定的局限性。種棲鐮刀菌的生理特性復雜多樣，不同菌株之間可能存在差異，單一菌株難以對所有種棲鐮刀菌都產生有效的抑制作用。單一菌株在面對復雜多變的土壤環境和根際生態系統時，其生存和定殖能力可能受到影響，導致防治效果不穩定。當土壤中存在其他微生物競爭或環境條件發生變化時，單一菌株的生長和繁殖可能受到抑制，從而降低其對種棲鐮刀菌的防控效果。相比之下，復合菌群具有更強大的優勢。復合菌群由多種具有不同功能和特性的微生物組成，這些微生物之間可以通過協同作用，發揮出比單一菌株更全面、更高效的防控效果。在復合菌群中，不同微生物可能具有不同的抑菌機制，有的微生物產生抗生素，有的微生物分泌細胞壁降解酶，還有的微生物通過競爭營養物質來抑制種棲鐮刀菌的生長。這些不同的作用機制相互補充，能夠從多個角度對種棲鐮刀菌進行抑制，提高防控效果。復合菌群中的微生物還可以相互促進生長和定殖，增強在根際環境中的適應性和穩定性。一些微生物能夠產生生長因子或信號分子，促進其他微生物的生長和繁殖；不同微生物之間還可以形成共生關系，共同應對外界環境的變化，提高復合菌群在根際土壤中的存活和定殖能力。有研究表明，將芽孢桿菌、假單胞菌和木霉菌組成復合菌群，用于防控玉米種棲鐮刀菌病害。芽孢桿菌能夠產生多種抗菌物質，對種棲鐮刀菌具有直接的抑制作用；假單胞菌可以分泌鐵載體，競爭根際環境中的鐵元素，使種棲鐮刀菌因缺鐵而生長受到抑制；木霉菌則能夠寄生在種棲鐮刀菌的菌絲上，通過重寄生作用破壞種棲鐮刀菌的結構。這三種微生物組成的復合菌群，在實驗室和田間試驗中都表現出比單一菌株更好的防控效果，能夠顯著降低種棲鐮刀菌的數量，減輕玉米病害的發生程度，提高玉米的產量和品質。在田間試驗中，接種復合菌群的玉米田，種棲鐮刀菌的發病率比對照降低了30%以上，玉米產量提高了15%左右，充分展示了復合菌群在防控種棲鐮刀菌方面的優勢。4.2.2基于功能互補的菌群構建基于功能互補的原則構建復合菌群，是提高根際菌群對種棲鐮刀菌防控效果的有效策略。不同的根際微生物具有各自獨特的功能，通過合理組合這些功能互補的微生物，可以構建出具有協同增效作用的復合菌群。在選擇功能互補的微生物時，需要考慮多個方面的功能。在營養競爭方面，一些微生物能夠高效利用土壤中的特定營養物質，從而與種棲鐮刀菌競爭養分，限制其生長。固氮菌能夠將空氣中的氮氣轉化為氨態氮，供植物和其他微生物利用，同時減少土壤中可供種棲鐮刀菌利用的氮源；解磷細菌和解鉀細菌能夠分解土壤中難溶性的磷、鉀化合物，使其轉化為可被植物和其他微生物吸收的有效磷和速效鉀，通過競爭這些養分，抑制種棲鐮刀菌的生長。在抗菌物質產生方面，不同微生物產生的抗菌物質具有不同的化學結構和作用機制，將產生不同抗菌物質的微生物組合在一起，可以擴大抗菌譜，提高對種棲鐮刀菌的抑制效果。芽孢桿菌產生的脂肽類抗生素和假單胞菌產生的吩嗪類抗生素，對種棲鐮刀菌的作用位點和作用方式不同，兩者組合使用可以更全面地抑制種棲鐮刀菌的生長。在誘導植物抗性方面，一些微生物能夠激發玉米自身的防御系統，增強玉米對種棲鐮刀菌的抵抗力。根際促生細菌可以通過分泌信號分子，誘導玉米產生病程相關蛋白、植保素等防御物質，提高玉米的抗病能力。將具有誘導植物抗性功能的微生物與其他具有抑菌作用的微生物組合，能夠從內外兩個方面共同防控種棲鐮刀菌。為了驗證基于功能互補構建復合菌群的有效性，進行了相關實驗。選取了具有固氮功能的根瘤菌、能夠產生抗菌物質的芽孢桿菌以及可以誘導植物抗性的熒光假單胞菌，按照不同的比例組合構建復合菌群。在室內模擬實驗中，將復合菌群接種到含有種棲鐮刀菌的土壤微宇宙系統中，定期檢測種棲鐮刀菌的數量和玉米幼苗的生長情況。結果表明，與單一菌株處理相比，復合菌群處理的土壤中種棲鐮刀菌的數量顯著降低，玉米幼苗的發病率明顯下降，生長狀況得到顯著改善，株高、莖粗和生物量等指標均有顯著提高。在盆栽試驗中，進一步驗證了復合菌群的防控效果。將復合菌群接種到種植玉米的花盆中，同時設置接種種棲鐮刀菌的對照組和不接種任何微生物的空白對照組。經過一段時間的培養，觀察發現接種復合菌群的玉米植株生長健壯，葉片翠綠，而對照組的玉米植株出現明顯的病害癥狀，葉片發黃、枯萎。對玉米根際土壤微生物群落結構的分析表明，復合菌群能夠在根際定殖并形成穩定的群落結構，改變根際微生物的組成和多樣性，從而有效地抑制種棲鐮刀菌的生長和侵染。4.3菌群優化4.3.1菌株比例優化在構建防控種棲鐮刀菌的根際菌群時，確定復合菌群中各菌株的最佳比例是提高菌群防控效果的關鍵步驟。不同菌株之間的比例會影響它們在根際環境中的相互作用，進而影響菌群對種棲鐮刀菌的抑制能力以及對玉米生長的促進作用。為了確定最佳菌株比例，進行了一系列實驗。選擇在前期篩選中表現出良好拮抗效果和協同潛力的根際細菌菌株R-B-03、根際真菌菌株R-F-05以及具有促生功能的根際細菌菌株R-B-10作為研究對象，構建復合菌群。設置不同的菌株比例組合，包括1:1:1（R-B-03:R-F-05:R-B-10）、2:1:1、1:2:1、1:1:2等，同時設置單一菌株處理和空白對照處理。將這些不同比例的復合菌群和單一菌株分別接種到含有種棲鐮刀菌的土壤微宇宙系統中，每個處理設置5個重復。在室內模擬條件下，保持溫度為28℃，相對濕度為70%，光照周期為12h光照/12h黑暗。定期檢測土壤中種棲鐮刀菌的數量，采用稀釋平板法進行計數，每隔3天取樣一次，持續監測15天。在接種后的第15天，對玉米幼苗的生長指標進行測定，包括株高、莖粗、葉片數和生物量等。結果表明，不同比例的復合菌群對種棲鐮刀菌的抑制效果和對玉米幼苗生長的促進作用存在顯著差異。在1:1:1的比例組合下，土壤中種棲鐮刀菌的數量在接種后第9天開始顯著低于其他比例組合和單一菌株處理，到第15天，種棲鐮刀菌數量相比接種初期下降了75%，而單一菌株處理下降幅度在30%-50%之間。在玉米幼苗生長指標方面，1:1:1比例組合處理的玉米幼苗株高達到25cm，莖粗為0.8cm，葉片數為8片，生物量干重為5g，均顯著高于其他處理。這表明在該比例下，菌株之間的協同作用最佳，能夠更有效地抑制種棲鐮刀菌的生長，促進玉米幼苗的生長發育。通過進一步的統計分析，確定1:1:1為這三種菌株組成的復合菌群的最佳比例。4.3.2培養條件優化菌群培養條件的優化對于提高根際菌群的活性和穩定性，增強其對種棲鐮刀菌的防控能力具有重要意義。不同的培養條件，如溫度、pH值、碳氮源等，會影響菌群中微生物的生長、代謝和相互作用，從而影響菌群的整體性能。在溫度優化實驗中，設置了20℃、25℃、28℃、30℃和35℃五個溫度梯度，將篩選出的復合菌群接種到液體培養基中，在不同溫度條件下進行搖床培養，搖床轉速為180r/min，培養時間為72h。每隔12h取適量菌液，采用分光光度計測定菌液的OD600值，以反映微生物的生長情況。結果顯示，在28℃時，復合菌群的生長速度最快，OD600值在72h達到1.5，顯著高于其他溫度條件下的數值。在20℃和35℃時，菌群的生長受到明顯抑制，OD600值分別僅為0.8和1.0。這表明28℃是該復合菌群生長的最適溫度，在這個溫度下，菌群中的微生物能夠保持較高的代謝活性，有利于發揮其對種棲鐮刀菌的防控作用。對于pH值的優化，設置了pH值為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的培養基，將復合菌群接種到不同pH值的培養基中，在28℃、180r/min的搖床條件下培養72h，同樣通過測定OD600值來監測菌群的生長情況。實驗結果表明，復合菌群在pH值為7.0的培養基中生長最佳，OD600值達到1.4。當pH值低于6.0或高于8.0時，菌群的生長受到不同程度的抑制，OD600值明顯降低。這說明該復合菌群適應中性環境，在中性pH值條件下，菌群中的微生物能夠更好地進行代謝活動，維持良好的生長狀態。在碳氮源優化方面，分別以葡萄糖、蔗糖、淀粉作為碳源，以硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨作為氮源，設計不同的碳氮源組合。將復合菌群接種到含有不同碳氮源組合的培養基中，在28℃、pH值為7.0的條件下培養72h，測定OD600值。結果顯示，當以葡萄糖為碳源、硝酸銨為氮源時，復合菌群的生長效果最佳，OD600值達到1.6。這表明葡萄糖和硝酸銨能夠為復合菌群中的微生物提供最適宜的營養條件，促進其生長和代謝。綜合溫度、pH值和碳氮源的優化結果，確定該復合菌群的最佳培養條件為溫度28℃、pH值7.0、碳源為葡萄糖、氮源為硝酸銨。在該培養條件下，復合菌群能夠保持較高的活性和穩定性，為其在防控種棲鐮刀菌的實際應用中提供了有力的保障。4.4構建效果驗證4.4.1實驗室驗證在實驗室條件下，采用土壤微宇宙實驗對構建的根際菌群防控種棲鐮刀菌的效果進行驗證。實驗設置三個處理組，分別為接種復合菌群和種棲鐮刀菌的處理組（A組）、接種種棲鐮刀菌但不接種復合菌群的對照組（B組）以及不接種任何微生物的空白對照組（C組）。每個處理設置5個重復，以確保實驗結果的可靠性。土壤微宇宙系統由500mL的玻璃燒杯和無菌土壤組成，土壤為經過高溫滅菌處理的農田土壤，以消除土壤中原有微生物的干擾。將玉米種子播種在土壤中，待玉米幼苗長至3-4葉期時，進行接種處理。在A組中，將按照優化比例和培養條件制備的復合菌群菌液（濃度為1×108CFU/mL）以每株10mL的量澆灌到玉米幼苗根部周圍；同時，將種棲鐮刀菌的孢子懸液（濃度為1×106個/mL）以每株10mL的量澆灌到玉米幼苗根部周圍。B組僅接種種棲鐮刀菌的孢子懸液，C組不進行任何接種處理。接種后，將土壤微宇宙系統置于恒溫培養箱中培養，溫度控制在28℃，相對濕度保持在70%，光照周期為12h光照/12h黑暗。定期檢測土壤中種棲鐮刀菌的數量，采用稀釋平板法進行計數，每隔3天取樣一次，持續監測15天。在接種后的第15天，對玉米幼苗的生長指標進行測定，包括株高、莖粗、葉片數和生物量等。實驗結果顯示，在接種后的第3天，A組土壤中種棲鐮刀菌的數量開始低于B組，隨著時間的推移，這種差異逐漸增大。到第15天，A