生物化學(xué)BIOCHEMISTRY目錄CONTENTS二真核生物DNA的復(fù)制過程一原核生物DNA的復(fù)制過程1.DNA的復(fù)制過程三原核和真核生物復(fù)制的異同DNA復(fù)制的起始階段，由下列步驟構(gòu)成。1、識(shí)別起始點(diǎn)：由解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA復(fù)制起始區(qū)域形成引發(fā)體；2、解旋解鏈：由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。3、SSB結(jié)合：?jiǎn)捂淒NA結(jié)合蛋白（SSB）四聚體結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。4、合成引物：在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

（一）復(fù)制的起始一、原核生物DNA的復(fù)制過程

DnaA

DnaB

DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3

5

3

5

含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引發(fā)體的組裝形成3'HO5'3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物引物酶6在原核細(xì)胞中，每個(gè)DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，因而只有一個(gè)復(fù)制子。在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開始的，所以每個(gè)DNA分子上有許多個(gè)復(fù)制子。

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol

DNA的復(fù)制實(shí)際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧單核苷酸dNTP逐個(gè)加入而延長DNA新鏈，其化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵。

（二）復(fù)制的延長8順著解鏈方向而生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。1、領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制領(lǐng)頭鏈沿著5/→3/方向可以連續(xù)的延長。92、隨從鏈的不連續(xù)復(fù)制復(fù)制的方向與解鏈方向相反生成的子鏈稱為隨從鏈。隨從鏈的復(fù)制必須等待模板鏈解開至足夠長度，才能從5’→3’方向生成引物然后復(fù)制。隨從鏈在延長時(shí)，又要等到下一段暴露出足夠長度的模板，再次生成引物而延長,這就是不連續(xù)復(fù)制。隨從鏈的延長DNA復(fù)制過程簡(jiǎn)圖在形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，DNA雙鏈的走向是相反的。復(fù)制起始時(shí)，母鏈即已解開，兩股單鏈都是模板，但兩股單鏈在復(fù)制叉上走向是相反的。復(fù)制，包括引物合成，只能從5’向3’延伸，而在同一復(fù)制叉上，解鏈的方向只可能有一個(gè)。復(fù)制方向與解鏈方向不一致，是不連續(xù)復(fù)制的成因。在復(fù)制過程中形成的RNA引物，需由RNA酶來水解去除；RNA引物水解后遺留的缺口，由DNA聚合酶Ⅰ（原核生物）或DNA聚合酶

（真核生物）催化延長缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。1、去除引物，填補(bǔ)缺口（三）復(fù)制的終止在DNA連接酶的催化下，生成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的雙螺旋DNA長鏈后分開。2、連接岡崎片段，分開子代DNA哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物DNA的復(fù)制過程

真核生物DNA復(fù)制在細(xì)胞周期的S期（合成期）進(jìn)行，也可分為起始、延長和終止三個(gè)階段，每個(gè)階段的基本過程與原核生物DNA復(fù)制相似，但存在不少差異。1、真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。

2、復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子（RF）。

3、增殖細(xì)胞核抗原在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。（一）復(fù)制的起始3

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體（二）復(fù)制的延長

真核生物的聚合酶δ催化子鏈的延長，并有校正功能。引物和岡崎片段（約200bp）

都比較短。

5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

1、染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。2、復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。3、染色體兩端DNA子鏈上復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）復(fù)制的終止（一）共同點(diǎn)1、均為半保留復(fù)制；2、均為半不連續(xù)復(fù)制；3、均需要解旋酶解開雙螺旋，并由SSB同單鏈區(qū)結(jié)合；4、均需要拓?fù)洚悩?gòu)酶消除解螺旋形成的扭曲張力；5、均需要RNA引物；6、新鏈合成均有校對(duì)機(jī)制；7、復(fù)制可以朝一個(gè)方向，也可向兩個(gè)方向進(jìn)行；8、兩條鏈都從5’端向3’端延伸；三、原核和真核生物復(fù)制的異同1、真核生物有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，而原核只有一個(gè)起始位點(diǎn)；2、真核生物復(fù)制一旦啟動(dòng)，在完成本次復(fù)制前，不能再啟動(dòng)新的復(fù)制；而原核復(fù)制起始位點(diǎn)可以連續(xù)開始新的復(fù)制，特別是快速繁殖的細(xì)胞；3、復(fù)制時(shí)間：原核在整個(gè)細(xì)胞周期，真核只在S期；4、原核生物復(fù)制速率比真核生物快。真核生物多復(fù)制子，因而整個(gè)染色體的復(fù)制速度并不比原核的慢；5、原核的DNA聚合酶Ⅲ復(fù)制時(shí)形成二聚體復(fù)合物，而真核的聚合酶保持分離狀態(tài)。6、真核生物的聚合酶沒有5‘-3’外切酶活性，需要另外的核酸酶切除5‘端引物；原核的DNA聚合酶I具有5'-3'外切酶活性。（二）不同點(diǎn)目錄CONTENTS二DNA的雙向復(fù)制一半保留復(fù)制2.DNA復(fù)制的基本規(guī)律三復(fù)制的半不連續(xù)性四復(fù)制的方向性五DNA復(fù)制的酶類DNA生物合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全重新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。一、半保留復(fù)制（一）半保留復(fù)制的概念DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson

和F.Stahl所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。然后將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，將具有不同密度的DNA分離開。（二）半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù)密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果DNA雙螺旋的兩條鏈堿基通過A-T、G-C之間的氫鍵聯(lián)結(jié)，并且兩條鏈互補(bǔ)。雙螺旋打開，每條鏈作為模板，以四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底物，在依賴于DNA的DNA聚合酶催化下，按照A-T、G-C配對(duì)方式，合成與兩條模板鏈脫氧核苷酸對(duì)應(yīng)的兩條新鏈，然后以一新一舊脫氧多核苷酸組成的雙鏈分別進(jìn)入子細(xì)胞。

（三）半保留復(fù)制模型（四）半保留復(fù)制的意義按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。（一）復(fù)制叉

復(fù)制時(shí)雙鏈打開，分開成兩股，新鏈沿著張開的模板生成，復(fù)制中形成的這種Y字形的結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。二、DNA的雙向復(fù)制DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)。終止復(fù)制的序列位點(diǎn)為終點(diǎn)。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。（二）復(fù)制起始點(diǎn)雙向復(fù)制單向復(fù)制DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。（三）雙向復(fù)制DNA的雙向和單向復(fù)制復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制1、原核生物只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)原核生物雙向復(fù)制——型復(fù)制。環(huán)狀

DNA復(fù)制時(shí)所形成的θ結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)

真核生物雙向復(fù)制中兩個(gè)起始點(diǎn)之間的DNA片段為一個(gè)復(fù)制子。真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。2、真核生物有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’復(fù)制叉相遇匯合復(fù)制子復(fù)制子三、復(fù)制的半不連續(xù)性3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′3′5′前導(dǎo)鏈滯后鏈DNA雙鏈復(fù)制時(shí)，順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈或領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為滯后鏈或隨從鏈。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。（一）前導(dǎo)鏈和滯后鏈由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

（二）岡崎片段3’5’5’3’3’5’5’3’前導(dǎo)鏈：連續(xù)復(fù)制岡崎片段復(fù)制叉復(fù)制叉滯后：不連續(xù)復(fù)制3’5’5’3’四、復(fù)制的方向性DNA新鏈的合成具有方向性，5’→3’DNA復(fù)制時(shí)只能以核苷酸鏈的3’-OH與dNTP的5’-磷酸生成磷酸二酯鍵。復(fù)制是在酶催化下的核苷酸聚合過程，需要多種酶和蛋白因子的共同參與。DNA聚合酶又稱DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，是催化DNA復(fù)制的一系列酶中最重要的酶。該酶在DNA模板鏈的指導(dǎo)下，催化以三磷酸脫氧核苷dNTP為底物，按堿基配對(duì)原則，將三磷酸脫氧核苷逐個(gè)加到寡聚核苷酸的3’末端上，并催化核苷酸之間3’,5’-磷酸二酯鍵的形成，從而可沿著5’-3’方向聚合成為多核苷酸鏈。五、DNA復(fù)制的酶類

1、原核生物DNA聚合酶在大腸桿菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有三種，分別命名為DNA聚合酶Ⅰ，DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與DNA復(fù)制的主要是DNA聚合酶Ⅲ和DNA聚合酶Ⅰ。（一）DNA聚合酶2、真核生物的DNA聚合酶

真核細(xì)胞中至少有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA-pol

、DNA-pol

、DNA-pol

、DNA-pol

和DNA-pol

。它們的主要活性是催化dNTP的5’-3’聚合活性。真核細(xì)胞在DNA復(fù)制中其主要作用的是DNA-pol

，主要負(fù)責(zé)染色體DNA的復(fù)制。DNA-pol

的模板特異性是具有缺口的DNA分子，它被認(rèn)為與DNA修復(fù)有關(guān)。DNA-pol

在線粒體DNA的復(fù)制中起作用。DNA-pol

不但有5’-3’聚合活性，而且還具有3’-5’外切酶活性。

引物酶是一種特殊的RNA聚合酶，用于引物的合成

，催化以起始部位DNA為模板，合成短片段RNA作為引物，為DNA合成提供3’-OH末端。復(fù)制完成后引物被水解。（二）引物酶

1、拓?fù)洚悩?gòu)酶

能解開DNA超螺旋，有內(nèi)切酶和連接酶功能。拓?fù)洚悩?gòu)酶有兩類。（三）解旋和解鏈酶類可切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ2、解鏈酶能使DNA互補(bǔ)雙鏈分離，每解開一個(gè)堿基對(duì)，消耗2個(gè)ATP，可沿模板隨復(fù)制方向的伸展而移動(dòng)。3、單鏈結(jié)合蛋白（SSB）

與解開的單鏈結(jié)合以穩(wěn)定單鏈：防止DNA重新形成雙螺旋，防止復(fù)制中單鏈模板被核酸酶水解，有激活DNA聚合酶的作用。

催化兩段DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來。DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。是基因工程的重要工具酶之一。35535353HOP

DNAligaseNADATPNMNAMP+PPi′′′′′′′′+（四）DNA連接酶目錄CONTENTS二DNA損傷的修復(fù)一DNA損傷的因素3.DNA的損傷與修復(fù)51一、DNA損傷的因素

某些理化因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，作用于DNA，造成其結(jié)構(gòu)和功能的破壞，從而引起生物突變和致死的效應(yīng)，稱為DNA的損傷。52

DNA復(fù)制中的錯(cuò)誤以DNA為模板按堿基配對(duì)進(jìn)行DNA復(fù)制是一個(gè)嚴(yán)格而精確的事件，但也不是完全不發(fā)生錯(cuò)誤的。復(fù)制過程中如有錯(cuò)誤的核苷酸摻入，DNA聚合酶還會(huì)暫停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除錯(cuò)誤接上的核苷酸，然后再繼續(xù)正確的復(fù)制，這種校正作用廣泛存在于原核和真核的DNA聚合酶中，可以說是對(duì)DNA復(fù)制錯(cuò)誤的修復(fù)形式，從而保證了復(fù)制的準(zhǔn)確性。但校正后的錯(cuò)配率仍約在10－10左右，即每復(fù)制1010個(gè)核苷酸大概會(huì)有一個(gè)堿基的錯(cuò)誤。（一）自發(fā)因素

由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會(huì)引起復(fù)制障礙。

（二）物理因素相鄰的胸腺嘧啶紫外線照射環(huán)丁烷胸腺嘧啶二聚體1、脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成H。（三）化學(xué)因素2、烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。3、DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價(jià)結(jié)合引起損傷。4、堿基類似物：如5-FU、6-巰基嘌呤（6-MP）等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。5、斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。

二、DNA損傷的修復(fù)細(xì)胞內(nèi)具有一系列修復(fù)系統(tǒng)，可以除去DNA上的損傷，恢復(fù)DNA的正常雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)知道大腸桿菌有光裂合酶修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)和SOS修復(fù)等幾種修復(fù)系統(tǒng)，其中第一種修復(fù)作用需要光照，也稱為光修復(fù)。其余機(jī)制不需要光，又稱為暗修復(fù)。

這是一種廣泛存在的修復(fù)作用，能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。修復(fù)過程由光修復(fù)酶(photolyase)催化完成。其修復(fù)過程為：此酶能特異性識(shí)別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價(jià)結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受400nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個(gè)正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。（一）光修復(fù)（二）切除修復(fù)是細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)機(jī)制，由DNA聚合酶1切除DNA的損傷序列，并以另一條正常鏈為模板，重新合成新的該段DNA序列，最后由連接酶將DNA鏈連接起來。復(fù)制核酸酶及重組蛋白修復(fù)復(fù)制胸腺嘧啶二聚體DNA聚合酶DNA連接酶重組（三）重組修復(fù)在進(jìn)行DNA修復(fù)之前，受損壞的DNA鏈常常會(huì)跨過受損堿基進(jìn)行復(fù)制，在新合成的子鏈DNA中形成缺口。這時(shí)，由第二個(gè)子代分子中正常的姊妹鏈的相應(yīng)片段插入子代DNA分子中的缺口部位，姊妹鏈中的缺口可以正常鏈為模板重新合成。這種修復(fù)實(shí)際是將受損的DNA鏈在子代DNA中通過擴(kuò)大繁殖進(jìn)行稀釋。62

重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)后合成的DNA分子是不帶損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，