熱點專題13

PCR技術及其應用(本欄目對應學生用書P312)［熱點歸納］1.概念PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫，它是一項根據DNA半保留復制原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，迅速擴增DNA片段的技術，它能以極少量的DNA為模板，在短時間內復制出上百萬份的DNA。2.PCR的原理（1）DNA分子的熱變性原理。當溫度超過90℃時，DNA的雙螺旋結構將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。溫度緩慢降低到50℃左右時，兩條彼此分離的DNA鏈重新結合成雙鏈，這個過程稱為復性。DNA雙鏈DNA單鏈（2）耐高溫的DNA聚合酶。高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的DNA聚合酶解決了高溫導致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化。（3）關于引物。①概念：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物長度一般為20~30個核苷酸。②作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸，見下圖：

（4）PCR（體外的DNA復制）的條件。①控制溫度，但不需解旋酶。②DNA模板。③原料：dNTP，包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，除提供原料外，還提供能量。④耐高溫的DNA聚合酶。⑤分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物。⑥需要在一定的緩沖液中進行。3.PCR的過程（1）一般情況下，DNA模板鏈較長，需要PCR擴增的基因只是DNA模板鏈的一段。（2）第一輪循環，兩引物與模板鏈互補，DNA分子模板鏈最長，新合成的DNA單鏈（含有引物的鏈）較短。（3）第二輪循環，以含有引物的母鏈為模板合成的DNA分子，會出現含有引物的DNA，其中新合成的單鏈b會比母鏈量更短，其實b就是我們所需擴增的目的基因的長度，只是b為單鏈。（4）第三輪循環，以b為模板合成的DNA片段就是目的基因片段的長度。（5）結果分析。①兩條單鏈等長DNA（目的基因）從第三輪循環開始出現（甲、乙）。隨循環次數的增加，目的基因含量會不斷增加。②通過以上分析可知，PCR反應的產物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，還會存在四種類型的DNA分子（這四種類型同第二輪循環產生的4個DNA分子）。③DNA聚合酶只能特異性地復制處于兩個引物之間的DNA序列，等長DNA（目的基因）從第三輪循環開始出現，隨著循環次數的增多，呈指數擴增。4.PCR的應用現在PCR技術已廣泛應用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和基因測序等?！镜淅咳绻阎恍《蜠NA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如圖（以EcoRⅠ酶切為例）：請據圖回答問題。（1）步驟Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于

生物中，限制酶存在于該類生物中的主要作用是

。

（2）步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'-羥基與5'-磷酸間形成

；PCR每次循環一般可分為

（按順序書寫）三步，其中第二步的目的是

。原核切割外源DNA，保證自身安全磷酸二酯鍵變性、復性、延伸引物與兩條模板DNA單鏈結合（3）若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是

（從引物①②③④中選擇，填編號）。

項目DNA序列（虛線處省略了部分核苷酸序列）已知序列PCR引物①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'②5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'③5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'③④（4）對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中（虛線處省略了部分核苷酸序列），結果正確的是

。

A.5'-AACTATGCG……AGCCCTT-3'B.5'-TTGATACGC……CGAGTAC-3'C.5'-GCAATGCGT……TCGGGAA-3'D.5'-AATTCCATG……CTGAATT-3'D【解析】（1）步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種限制酶，主要存在于原核生物中，它能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，進而在特定部位將雙鏈DNA切開，顯然限制酶在原核生物中能切割外源DNA，保證自身安全。（2）步驟Ⅱ用的是

DNA

連接酶，DNA連接酶催化形成的是磷酸二酯鍵，即催化相鄰核苷酸之間的

3'-羥基與

5'-磷酸間形成磷酸二酯鍵；PCR循環包括變性、復性和延伸三步，該過程中升溫到95

℃是為了使DNA變性解旋，進而獲得DNA單鏈，其中第二步復性是指引物與兩條模板DNA單鏈結合，進而為后續的延伸做準備。（3）由于DNA聚合酶只能從5'→3'方向催化子鏈延伸，根據堿基互補配對原則可知，引物①是以目的基因下邊那條鏈的左端為模板向右側延伸，引物②是以目的基因上邊那條鏈為模板的右端向左側延伸，引物③是以目的基因下邊那條鏈的右端為模板向右側延伸，引物④是以目的基因上邊那條鏈的左端為模板向左側延伸，本題的目的是要擴增已知序列兩側的未知序列，因此，應該選擇引物③和④。（4）選項中，A、B、C都是已知序列，只有D是未知序列，而要測定的是未知序列，故選D。解題指導

熟知PCR擴增技術的原理、步驟和相關的技術流程是解答本題的關鍵，正確分析圖示的信息是解答本題的前提，明確題意是解答本題的基礎，掌握堿基互補配對原則是解答本題的法寶。［高考試練］1.（2024年四川部分學校一模）人們所需要的大部分核酸的堿基對數量遠遠超過DNA合成儀可以合成的最長核酸鏈的堿基對數量，而這種大片段基因的人工合成則可以利用重疊延伸PCR的方法（合成過程如圖所示）。據圖分析回答下列問題。（1）利用重疊延伸PCR人工合成大片段基因，首先需要設計n條單鏈寡核苷酸片段作為引物（如圖中P1~P15），合成這些引物的前提是已知_______

。根據圖示分析，相鄰近的每2條引物之間均有15~25bp的序列

，若第1輪循環需要加入引物P6~P9，請在下圖中標注出每個引物的位置。

一段目的基因的核苷酸序列重疊（2）第1輪循環

（填“需要”或“不需要”）添加模板；第2輪循環選擇Px和Py分別對應引物

。圖示多輪循環

（填“能”或“不能”）在同一個PCR體系中完成，原因是_____________________________

。（3）利用重疊延伸PCR人工合成大片段基因相對于普通PCR還需要用到

酶；結合上述內容分析利用該技術合成基因的優勢有______

。

需要P7、P4不能引物之間存在重疊區域，在同一個PCR體系中引物之間會因為發生堿基互補配對而無法完成PCR擴增DNA連接可以實現基因的定點突變、定點敲除【解析】（1）PCR過程中需要有一對引物，引物設計的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列；根據圖示分析，相鄰近的每2條引物之間均有15~25bp的序列存在重疊區域；若第1輪循環需要加入引物P6~P9，結合圖示可知，

引物的位置可標注如下：

。（2）PCR擴增時需要模板，故第一輪循環也需要加入模板；引物需要與模板的3'端結合，結合圖示箭頭方向可知，第2輪循環選擇Px和Py分別對應引物是P7、P4；由于引物之間存在重疊區域，在同一個PCR體系中引物之間會因為發生堿基互補配對而無法完成PCR擴增，故圖示多輪循環不能在同一個PCR體系中完成。（3）利用重疊延伸PCR人工合成大片段基因需要連接不同的DNA片段，故相對于普通PCR還需要用到DNA連接酶；結合上述內容分析利用該技術合成基因的優勢有可以實現基因的定點突變、定點敲除。2.（2025年湖南長沙階段練習）豬大腸桿菌會引起仔豬發生腸炎、腸毒血癥等疾病。LTB和ST1是豬源大腸桿菌腸毒素基因。研究人員通過重組PCR技術構建了LTB-ST1融合基因，其表達產物LTB-ST1融合蛋白可有效預防仔豬黃痢，該融合基因構建過程如圖所示。請回答下列問題：（1）重組PCR技術依據的生物學原理是

。（2）PCR1和PCR2是在兩個不同反應體系中進行的，兩個反應體系中加入的物質中不同的是

。PCR1和PCR2的目的是__________

，從而有利于LTB基因和ST1基因融合。

（3）在②過程中，PCR1和PCR2產物的作用是作為

。DNA的半保留復制模板、引物擴增出末端部分堿基序列互補配對的LTB和ST1單鏈模板、引物（4）引物的作用是_______________________________________________

。（5）定點突變是指使基因特定位點發生堿基對的增添、缺失或者替換。重組PCR技術不僅可用于構建融合基因，還可用于基因定點突變。請結合下圖，說明利用重組PCR技術進行基因內部定點突變的方法：__________

。

使耐高溫的DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸根據突變位點的堿基序列設計引物b和引物c，進行重組PCR【解析】（1）PCR是一項根據DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。（2）PCR1和PCR2是在兩個不同反應體系中進行，擴增的是兩個不同的基因，所以加入的模板不同，引物也不同；由圖可知，PCR1和PCR2的目的是擴增出末端部分堿基序列互補配對的LTB和ST1單鏈，以便于將兩個基因單鏈根據堿基互補配對接到一起，再以剩下的單鏈部分互為模板擴增出LTB—ST1融合基因。（3）PCR1和PCR2的產物是末端部分堿基序列互補配對的LTB和ST1單鏈，以便于將兩個基因連接到一起，所以PCR1和PCR2產物堿基互補序列可起到引物的作用，剩余未互補序列可作為PCR擴增的模板。（4）（耐高溫的）DNA聚合酶不能從頭開始將脫氧核苷酸聚合為核