動物細胞培養原代培養(primaryculture)細胞系(establishedcellline)細胞培養的定義和分類貼壁培養(adherent)懸浮培養(suspension)含血清培養(serum-containing)無血清培養(serum-free)器官培養(organculture)組織培養(tissueculture)細胞培養(cellculture)………..通過人工手段，將細胞從所附著的組織或器官上分離下來，在體外模擬其體內的生長環境，進行培養的過程。物理性：設備、環境等化學性：培養液、生長因子、激素、血清等一、細胞培養的條件無菌操作條件：凈化工作室，風淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌鍋細胞培養與檢測條件：純水儀，培養板，培養瓶，CO2培養箱，倒置相差顯微鏡，正置顯微鏡，電子天平，酶標儀，微孔板震蕩器，高速離心機，移液器細胞保存條件：液氮罐，凍存管實驗室安全細胞培養的設備條件凈化工作室我國藥品生產潔凈室（區）空氣潔凈度標準超凈工作臺Biosafetyhood超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環境。細胞培養箱IncubatorCO2培養箱主要控制模擬活體內環境相關的3個基本變量：穩定的CO2水平、溫度、相對濕度。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2h）。主要用于玻璃器皿消毒高壓滅菌鍋：高壓蒸汽滅菌（121℃，20-30min）過濾裝置：過濾除菌。大多數培養用液，如人工合成培養基、血清、酶液等消毒滅菌裝置顯微鏡Microscope熒光倒置顯微鏡相差顯微鏡純水系統WaterpurificationsystemFlaskanddishMultiwellplates培養器皿plasticwareandglassware細胞凍存設備-液氮罐微孔板振蕩器酶標儀微量移液器離心機濕度、溫度、酸度、滲透壓、氣體、生長表面等溫度：哺乳動物細胞通常37

C。細胞耐受低溫的能力強于高溫濕度：飽和濕度酸度：通常pH7.2-7.4，主要受培養液中NaHCO3和培養箱中CO2影響，細胞可耐受范圍6.5-7.8滲透壓：通常290-310mOsm。影響因素包括培養液中鹽、糖、氨基酸等細胞培養的環境條件氣體：通常5％CO2，

90-95％air（18%O2）培養基/培養液(culturemedium)培養基（培養液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養基和合成培養基。天然培養基：如血清、血漿和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。營養成分豐富，培養效果好。來源受限；成分復雜，影響某些實驗產物的提取和結果的分析；易發生支原體污染合成培養基：根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成。如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分是必需氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它輔助物質。標準化生產，組分和含量相對固定；成本低。缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。各種培養基成分有較大差異，適用細胞種類不同儲存時間：1-2monthat2-10

CpH：7.2-7.4緩沖成分：NaHCO3,HepesGlucose：highorlow抗生素添加與否過濾除菌：0.22μm水的質量控制（去離子水或三蒸水）酚紅等指示劑的選用培養液配置人工合成培養基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和增殖，還需補充一定量的天然培養基（如血清）。血清（serum）的應用含有許多營養物質如：蛋白、激素、生長因子、細胞因子、維生素等是很好的緩沖系統含轉鐵蛋白、銅藍蛋白等，具抗氧化活性含有貼壁因子或粘附蛋白可以幫助細胞貼壁對于重金屬有解毒的作用成分復雜，其中的一些物質能干擾受體的檢測和各種因子作用機制的研究能促使成纖維細胞過量生長，故對上皮細胞培養不利每批血清中所含貼壁因子的濃度不同，可以影響貼壁實驗的結果血清種類胎牛血清（FCS）、犢牛血清（FBS）、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以FCS質量最好。血清的滅活目的：使血清中的補體成分失活方法：56

C，30min血清的批間差異來源：動物飼養方式、季節、血清處理步驟質量穩定性控制：檢測小樣品質量，選擇最佳者，大批購買，分裝后-20

C或-80

C儲存激素和生長因子（growthfactors)外源添加用于特殊細胞功能的維持、無血清培養體系的營養供給等。包括激素、生長因子、細胞因子、維生素、促神經因子等。名稱使用濃度EGF0.1-10ng/mlaFGF1-10ng/mlbFGF1-10ng/mlPDGF1-50ng/mlTGFb0.1-10ng/mlactivin1-100ng/mlinhibin1-100ng/mlNGF1-10ng/mlTNF0.1-100ng/mlGM-CSF0.01-1

g/mlErythopoietin(EPO)0.01-1

g/mlinterleukins1-100ng/mltransferrin1-5

g/mlBSA1-25

g/ml名稱使用濃度hydrocortison10-8Mtestosterone10-9-10-7Mestrodial10-9-10-8Mprogesterone10-9-10-7MFSH1ng-1

g/mlLH1ng-1

g/mlGnRH1-10ng/mlPGE110-100ng/mlPGE2a10-100ng/mlfibronectin10

g/mllaminin10

g/mlRetinoidacid10-50ng/mlinsulin0.1-10

g/mlVitaminD10-2000ng/ml無血清細胞培養基的使用保證了實驗結果的準確性、可重復性和穩定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產物的程序。無血清培養基的主要研制策略：在基礎培養基中補充各種必需因子，如激素、生長因子、結合蛋白、貼壁和擴展因子等。無血清培養基由基礎培養基和替代血清的補充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養基培養了垂體細胞株。無血清培養液（Serum-freemedium）培養液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用，分別作用于G+和G-菌。有時也用慶大霉素（100IU/ml）：方便、廣譜、穩定。基礎培養基80-95％血清5-20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100IU／ml完全培養液組成無菌操作要點細胞原代培養(primaryculture)細胞傳代培養(passage/subculture)細胞凍存和復蘇(freezeandthaw)細胞克隆(cloning)二、細胞培養的基本技術培養前準備在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品。玻璃用品需清洗、泡酸、沖洗，與槍頭、epp管等高壓滅菌后烘干；生理鹽水、PBS等高壓滅菌。少量多次！將各種物品放置操作場所(培養室、超凈臺)內，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面一次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。操作野消毒在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經過燒灼進行。操作時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。火焰消毒與無菌操作洗手和著裝原則上和外科手術相同。應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液擦手。Whydoprimaryculture?沒有現成的細胞系模型有些細胞不增殖，如神經元、肌細胞、T細胞等有些細胞系未能很好地模擬體內細胞的分化狀態特殊病理狀態的標本DrawbackoftheprimarycultureTimeconsumingUsingofliveanimalsorfreshtissuesVariationfromonepreparationtoanotherDurationofcellmaintenanceUsuallycontainingmixedcelltypesContaminationThinkbeforeprimaryculture細胞純度、活力及產量的平衡用什么標志分子來鑒定所需的細胞確定所選用動物種類、性別、年齡、處理方式所需細胞所在的器官或組織，其豐度如何多種細胞混和培養或純化單一細胞基本方法獲取無菌組織并漂洗，剔除多余血塊和雜質，組織剪碎蛋白酶消化（胰酶37

C消化0.5h左右）或機械分離（尼龍網或銅網過濾）接種培養（培養瓶蓋擰緊后松半圈）蛋白酶消化分離細胞消化酶的選擇胰蛋白酶Trypsin:終濃度0.25%，作用強，能有效去除成纖維細胞，對上皮細胞有損害，需要無Ca2+、Mg2+的緩沖液膠原酶Collagenase：去除組織周圍的基質成分以分散細胞，需要Ca2+協助作用分散酶Dispase：通常與collagenase聯用，作用較緩和DNase：有效去除消化過程中破裂細胞釋放的DNA消化溫度的選擇37

C：酶作用的最佳溫度，但對先消化下來的細胞活力損傷大，尤其是trypsin；可通過短時多次消化法來克服4-9

C：消化緩慢，但對細胞活力保持較好細胞的進一步純化方法密度梯度沉降法：Percoll、Ficoll、BSA等差異貼壁法：利用不同細胞貼壁特性的差異進行分離免疫標記法：利用細胞膜表面或細胞內特異標志分子的抗體進行分離條件培養法：采用最有利于某種細胞生長的培養條件進行細胞篩選群體倍增次數和傳代次數Populationdoubling(PD)&passage(P)Y=X·2nY最終細胞數量X開始接種的細胞數量懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000rpm）去上清，沉淀物加新鮮培養液后再混勻傳代。半懸浮生長細胞傳代呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢（如Hela細胞），可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。貼壁生長細胞傳代酶消化法傳代：常用含0.25％的胰蛋白酶的消化液。細胞傳代的方法去除培養液:用移液槍，勿傾倒，注意細胞貼壁緊密與否無Ca2+、Mg2+PBS洗一遍加入消化液（含0.25%trypsin/0.02%EDTA的無Ca2+、Mg2+PBS），室溫或37C消化約5min，鏡檢細胞是否圓縮、脫落加入含血清的培養液，中止消化反應按照一定的傳代比例接種于培養皿記錄細胞的傳代時間、PD、傳代比例等信息貼壁細胞傳代的基本方法每種細胞傳代的比例盡可能穩定接種細胞數目不可太低，以保證細胞的self-condition能力細胞的外環境不可太大培養液更換勿過于頻繁，尤其當細胞數量較少時可大量獲得的原代培養細胞：如胚胎成纖維細胞建系過程中，較早代數的細胞和隨后每3-5代的細胞細胞呈現新的特征和功能時特殊病理組織來源的細胞特殊需求或進行特殊改造的細胞構建細胞庫長途運輸……需要凍存凍融過程導致混合細胞中各種細胞的比例發生改變對大鼠或小鼠細胞，凍融有時會導致細胞核型發生改變長時間凍存導致細胞活力下降有時會發生細胞之間的交叉污染或支原體污染劣勢細胞凍存與復蘇細胞在零度以下，可以導致細胞器脫水，細胞內可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，產生大的冰晶，造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。快融復蘇的目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。凍存原則：慢凍速融，減輕冰晶對細胞的損傷冷凍保護劑的使用常用DMSO，滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，并能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。細胞凍存的基本方法細胞消化洗滌后，用凍存液懸浮，加入凍存管內冷凍凍存液現用現配：10-20％血清+10％DMSO或甘油+70-80％培養液凍存體積要小：0.5-1ml凍存細胞數目與正常傳代細胞數目要相當，避免復蘇后細胞傳代比例發生變化，一般準備凍存的細胞不需長滿，1：2凍存“緩凍”：4C，0.5-1h-20C，1-2h-80C或氣態液氮，0.5-1h-196C液氮，1-2year

完善記錄：凍存細胞名稱，PD，凍存日期，凍存人，存放位置，其它特殊信息等程序降溫儀凍存細胞的復蘇將凍存的細胞解凍并繼續培養細胞庫內的細胞每1-2年必須復蘇一次“速融”：快速將凍存細胞置于37C環境，迅速解凍培養液等要預熱至37C解凍后的細胞要認真記錄傳代次數影響復蘇效率的因素：復蘇溫度、凍存條件、細胞特性保持液氮罐內的液氮量，經常監測溫度細胞系（CellLine）：原代培養物經首次傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養物中的細胞世系（LineageofCells）所組成。細胞株（CellStrain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志物的細胞。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。有限細胞株（finitecellstrain）：不能繼續傳代或傳代數有限；連續細胞株（continuouscellstrain）：可以連續傳代。細胞克隆（Cellcloning）：分離單個細胞并以此細胞發展出特性穩定的細胞群體。應用：單克隆抗體制備、細胞基因突變或轉染、從各種細胞世系中篩選特殊特性的細胞。

有限稀釋法：

適用于懸浮培養細胞的細胞克隆方法將細胞分散成單個細胞，計數后稀釋成10-100cells/ml懸液在96孔培養板中接種細胞，50-100ul/well12-24h后，觀察細胞生長狀況，標記出只有一個細胞的培養孔通過Westernblotting或ELISA等手段篩選所需的單克隆逐漸傳代至24孔培養板、35mm平皿、25cm2培養瓶等，并經常凍存一部分細胞

克隆環(cloningring)：

適用于貼壁培養細胞的細胞克隆方法將細胞分散成單個細胞，計數后稀釋成500-1000cells/ml的懸液在100mm培養皿中接種細胞，1-2ml/dish3-5天后，觀察細胞生長狀況，選擇遠離其它克隆并且含有50-100個細胞的克隆將克隆環粘在選擇克隆上形成隔離，在克隆環內進行細胞消化將消化的細胞轉移至24孔培養板培養逐漸傳代至35mm平皿、25cm2培養瓶等，并經常凍存一部分細胞三、培養細胞的基本特性體外培養細胞的類型體外培養細胞的生長曲線體外培養細胞的類型懸浮型：某些類型的癌細胞，容易大量繁殖貼壁型：大多數細胞為貼壁依賴性細胞成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規則三角形，中央有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放射狀、漩渦狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態。上皮型細胞：細胞呈扁平不規則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態。體外培養細胞的增殖特點潛伏期指數生長期穩定期培養時間細胞數細胞生長曲線潛伏期：從懸浮狀態（胞體呈圓球形）到貼壁。各種細胞貼附速度不同，與細胞種類、培養基成分和底物的理化性質等密切相關。一般傳代細胞24h內，原代細胞更長，連續細胞系或惡性細胞短。指數增生期：細胞分裂相增多，細胞數量呈指數增長，是細胞增殖最活躍、活力最旺盛的階段。判定細胞生長旺盛與否的重要標志是分裂指數。指數增生期持續3-5天后產生接觸抑制。穩定期：細胞數量達飽和密度后，停止增殖，細胞數量不再增加，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。此時需及時傳代，否則造成細胞中毒。細胞增殖活性或活力的檢測有絲分裂指數(mitoticindex)：培養物中分裂相細胞占全部細胞數的百分比。一般細胞的MI約為0.1-0.5%，原代細胞MI更低，連續細胞系和腫瘤細胞可達3-5%細胞群體倍增時間：標記核苷酸(3H-TdR)摻入：根據DNA含量變化間接反映細胞增殖活性MTT比色法：通過線粒體內特定酶活性間接反映細胞活力染色法：如臺盼藍對活細胞拒染肉眼觀察培養物顏色及混濁度倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態培養細胞的觀察四、細胞污染問題細胞污染的發現和解決肉眼觀察（初步印象）培養液顏色玫瑰紅黃環境偏堿性，pH>7.5檢查CO2培養瓶是否被擰緊環境偏酸性，pH<6.8檢查CO2未及時換液，營養缺乏細胞密度過高細菌或真菌污染培養液透明度渾濁細菌或真菌（酵母）污染細胞大量死亡，碎片增多倒置顯微鏡觀察相差顯微鏡熒光顯微鏡細胞污染(contamination)問題細胞污染的種類：細菌、酵母菌、霉菌、支原體和病毒等，細胞交叉污染。細胞污染的原因：無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清、培養液和細胞本身等。嚴格的無菌操作技術和清潔的環境、有保障的細胞來源和培養基配制是減低污染的最好方法。如何發現污染？

肉眼觀察：培養液是否渾濁、異常偏酸、有毛絮狀物質培養皿外圍是否有異物培養箱四周壁上、水盤中有無異物顯微鏡觀察：細菌：非常細小，400X以上可見，桿狀、球狀或不規則，在培養液中小范圍游動；生長迅速，可將細胞埋沒酵母：100X以上可見，念珠狀（或長或短）、珍珠項鏈樣，較細胞碎片透亮且規則，生長迅速，將培養液變渾濁霉菌：最初為白色、細絲狀，有分枝；隨后呈現中間密集，類似線團；最后肉眼可見，呈墨綠色或黑色。有時在最初污染時，可促進細胞生長支原體：Hoechst熒光染色可見為黏附在細胞膜上的小顆粒。細胞生長異常減慢，但排除培養條件的原因病毒：電鏡下可見，在細胞內或細胞表面，影響細胞功能污染細胞的拯救拯救：ALMOSTIMPOSSIBLE!!對珍貴的細胞，污染較輕時，可嘗試的手段：通過Percoll梯度沉降，使霉菌和酵母處于最下層小心挑出霉菌，用燙的針處理污染部位和周圍大量的培養液反復洗滌細胞，將污染稀釋殺菌劑：對細胞有強的毒害作用，污染物被消除后，需對細胞進行重新克隆篩選污染細胞及用具的處理原則：QUICKLY&THOROUGHLY迅速將污染細胞請出培養間，勿開蓋！10NNaOH液處理污染細胞被污染物接觸過的用具進行高壓