ICS65.020B16DB46備案號：33827-2012海南省地方標準DB46/T220—2012檳榔苗黃化病植原體PCR檢測技術規范TechnicalspecificationforPCRdetectionofarecanutyellowleafphytoplasmaofseedling海南省質量技術監督局發布DB46/T220—2012前言本標準按照GB/T1.1-2009給出的規則起草。本標準的附錄A為規范性附錄，附錄B為資料性附錄。本標準由海南省質量技術監督局提出。本標準起草單位：中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所。本標準主要起草人：羅大全、車海彥、溫衍生、徐雪蓮。本標準首次發布于2012年4月。IDB46/T220—2012檳榔苗黃化病植原體PCR檢測技術規范12范圍本標準規定了檳榔苗黃化病植原體的檢測技術規范。本標準適用于檳榔苗中檳榔黃化病植原體的檢測。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1Ct值檳榔苗以染色體DNA為基礎的分子生物學技術已用來檢測和鑒定植原體。根據16SrRNA基因保守序列設計通用引物，應用巢式PCR（nested–PCR）技術檢測。根據16SrRNA基因序列設計翠菊黃化組（16SrⅠ組）植原體特異性引物/探針組合，進行實時熒光PCR的檢測。臺式高速冷凍離心機（最高轉速在12000rpm以上）、全自動數碼凝膠圖像分析系統、PCR儀、全自動熒光定量PCR系統、全自動滅菌器、電子分析天平（萬分之一）、旋渦混合器、水平電泳裝置，微量可調移液器（0.1-1000μL)。1DB46/T220—2012用于巢式PCR和實時熒光PCR檢測的試劑和緩沖液配制，參見附錄A。7檢測方法7.1檳榔心葉總DNA提取稱取抽樣的檳榔植株剛抽出的心葉0.5g，加入適量液氮研磨呈粉狀，再加入1mLDNA提取緩沖液充分研磨，然后加入80μL10%十二烷基肌氨酸鈉，混勻，在55℃溫育1~2h，4℃6000rpm離心10min，取上清液；加入2/3體積異丙醇到上清液中，輕輕混勻，-20℃保持至少30min，4℃8000rpm離心15min，棄上清；加入600μLTE緩沖液、30μL10%十二烷基硫酸鈉和12μL蛋白酶K（5mg/ml），輕輕徹底懸浮沉淀，37℃溫育30-60min；加100μL5MNaCl混勻，再加入84μLCTAB/NaCl溶液混勻，65℃溫育10min；加入等體積氯仿：異戊醇（24：1）混勻，4℃6000rpm離心5min，重復直至無中間白色層；取上清液，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），混勻，4℃6000rpm離心5min；取上清液，加入2/3體積異丙醇，混勻，-20℃保持至少30min，4℃12000rpm離心10min，棄上清液；加入500μL70%乙醇洗滌，4℃12000rpm離心10min，洗滌兩次；取沉淀，加入50μLTE混勻溶解。加入5μLRNaseA(10μg/μl)，37℃30min,除去RNA。7.2巢式PCR檢測下述反應均需同時設植原體16SrDNA質粒作為陽性對照，設經確認的健康檳榔植株葉片作為陰性對照，設滅菌雙蒸水作為空白對照。7.2.1引物序列引物采用植原體16SrDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列見表1。表1巢式PCR檢測的引物序列PCR反應條件為：94℃，預變性2min；94℃變性1min；45℃退火45s，72℃延伸1min；共進行30個循環，最后72℃延伸10min。以R16mF2/R16mR1作為第一引物對，R16F2n/R16R2作為第二引物對，進行巢式PCR(nested-PCR)擴增，直接PCR以7.1中提取的總DNA為模板，巢式PCR以直接PCR產物稀釋50倍后的樣品為模板。PCR反應體系和反應條件與直接PCR擴增相同。2DB46/T220—2012表2（續）組分加樣量（μL）10mmol/LdNTPs2.51.010μmol/L上游引物10μmol/L下游引物TaqDNA聚合酶（5U/μL）模板DNA1.00.21.0補滅菌雙蒸水至最終反應體系25μL取5μLPCR產物在1％瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）中電泳。利用MarkerDL2000作為分子量標準，在120V電場強度下電泳約20min，最后用全自動數碼凝膠圖像分析系統照相。7.2.3PCR產物序列RFLP圖譜分析將第二輪PCR產物進行序列測定，序列結果利用植原體分類鑒定的在線專用數據庫-iPhyClassifier（http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi）進行RFLP圖譜分析。7.2.4結果判定巢式PCR檢測結果判定見表3。表3巢式PCR檢測結果判定簡表判定條件第二輪PCR產物在1.2kb處是否有條帶出現（見圖B.1）譜分析結果與檳榔黃化病檢測樣品含黃化病植原體檢測樣品不含黃化病植原體檢測結果無效，重新進行巢式PCR檢測。下述反應均需同時設植原體16SrDNA質粒作為陽性對照，設經確認的健康檳榔植株葉片作為陰性對照，設滅菌雙蒸水作為為空白對照。7.3.1檳榔黃化病植原體引物/探針引物和探針序列見表4。3DB46/T220—2012表4實時熒光PCR檢測用引物/探針序列引物/探針名稱PbLF引物/探針序列5’-3’GCGAAGGCGGCTTGCTTTTGCTCCCCACGCTTTCPbLRbFprobeFAM-CTTTACTGACGCTGAGGCA-MGBNFQ（FAM指熒光報告基團，MGB指小溝結合物，NFQ指非熒光淬滅基團）7.3.2實時熒光PCR反應體系、反應條件實時熒光PCR反應體系見表5。表5實時熒光PCR的反應體系組分終濃度或體積12.5μL650nM650nM230nM1μLTaqMan○RUniversalRCRMasterMix上游引物PbLF下游引物PbLR熒光探針bFprobe模板DNA補滅菌雙蒸水至最終反應體系25μL實時熒光PCR反應條件：50℃2min；95℃10min；94℃15s，60℃1min，40個循環。實時熒光PCR檢測結果的判定見表6。表6實時熒光PCR檢測結果的判定簡表檢測樣品含黃化病植原體。重新進行檢測，若Ct值仍介于35和40之間，檢測樣品含黃化病植原體。檢測樣品不含黃化病植原體。檢測結果無效，重新進行實時熒光PCR檢測。4DB46/T220—2012AA附錄A（規范性附錄）巢式PCR和實時熒光PCR檢測試劑和緩沖液配制除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑。實驗室用水均為去離子水，按GB/T6682-2008的有關規定。A.1化學試劑十六烷基三甲基溴化銨、三羥基氨基甲烷、十二烷基肌氨酸鈉、二水乙二胺四乙酸二鈉、苯酚、氯仿、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、溴化乙錠。A.2分子生物學試劑TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTP液（2.5mmol/LdATP,dTTP,dCTP,dGTP)、TaqManR○UniversalRCRMasterMix、DNA分子量標記。A.3緩沖液稱量121.1gTris置于1L燒杯中，加入約800ml的去離子水，充分攪拌溶解，用鹽酸調節PH值至8.0，將溶液定容至1L,高溫高壓滅菌后，室溫保存。稱取186.1gNa2?EDTA?2H2O，置于1L燒杯中，加入約800ml的去離子水，充分攪拌，用NaOH調節A.3.3DNA抽提緩沖液量取1MTris-HCl（pH8.0）10ml，0.5MEDTA20ml，置于100ml燒杯中，充分混勻，再加入1.461gNaCl，充分攪拌，用去離子水將溶液定容至100ml，高溫高壓滅菌后，室溫保存。使用前每毫升提取緩沖液中加入100μg蛋白酶K。稱取4.1gNaCl置于100ml燒杯中，加入約80ml的去離子水，充分攪拌，然后緩慢加入10gCTAB，同時加熱并攪拌，用去離子水將溶液定容至100ml，高溫高壓滅菌，室溫保存。量取1MTris·Cl（pH8.0）1ml和0.5MEDTA（pH8.0）200μl依次加入100ml燒杯中，向燒杯中加入約80ml的去離子水，均勻混合，將溶液定容至100ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存。A.3.6TAE電泳緩沖液（50×）（pH約8.5）5DB46/T220—2012稱取Tris242g和Na2EDTA·2H2O37.2g置于1L燒杯中，向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分攪拌溶解，再向燒杯中加入57.1ml的CH3COOH，充分攪拌，加去離子水將溶液定容至1L，室溫保存。6DB46/T220—2012BB附錄B（資料性附錄）檳榔黃化病植原體巢式PCR電泳圖、16SrDNA序列指紋圖譜和實時熒光