第六章基因組基因組：生物細胞中單套染色體的所含DNA序列的全部組成。人類基因組：22條常染色體和X，Y染色體的DNA組成。

第6章基因組基因組大小

種類Mb大腸桿菌4.64啤酒酵母12.1線蟲100果蠅140蝗蟲5000小鼠3300豌豆4800玉米5000小麥17000人3000

第6章基因組C值悖論生物體單倍體DNA總量稱為C值。高等生物具有比低等生物更復雜的生命活動，所以，理論上應該是它們的C值也應該更高。但是事實上C值沒有體現(xiàn)出與物種進化程度相關的趨勢。高等生物的C值不一定就意味著它的C值高于比它低等的生物。這種生物學上的DNA總量的比較和矛盾，稱為C值悖論。第6章基因組分類最小基因組支原體0.58X106細菌2.8X106酵母3.0X107霉菌5.5X107蠕蟲1.1X108昆蟲0.5X109鳥類0.2X1010兩棲類0.1X1010哺乳類2.8X1010

第6章基因組

進化地位高，結構復雜的生物的同類生物最小基因組比較，符合進化程度越高，生物基因組越大的規(guī)律。

第6章基因組DNA序列的分類基因序列和非基因序列基因序列：以起始密碼子開始，終止密碼子結束的一段DNA序列，稱為開放閱讀框（openreadingframe,ORF）非基因序列：基因序列以外的DNA序列。編碼序列和非編碼序編碼序列：編碼RNA和蛋白質的DNA序列。非編碼序：內含子和基因的間隔序列。第6章基因組單一序列和重復序列單一序列：基因組中只有一份的DNA序列。重復序列：基因組中重復出現(xiàn)的序列。例如，STR，SNP，微衛(wèi)星DNA等。第6章基因組模式生物

在某一類生物中選取一種或幾種生物作為代表進行重點研究,以了解這一類生物的共性和特征常用模式生物:線蟲,果蠅,斑馬魚,小鼠,擬南芥,煙草,水稻,第6章基因組

什么是基因？基因在哪里？第6章基因組尋找基因的思路：基因定位基因克隆基因分離將基因定位于染色體上有大到小，由粗到細，精細定位克隆目的基因片段第6章基因組功能克隆克隆（致病）基因的一種策略。收集所要克隆的基因的蛋白質產物及其功能的信息，用以分離基因，并對基因進行定位。性狀（疾病）蛋白質產物（生物學功能）從氨基酸序列出發(fā)設計DNA引物，從文庫調取基因得到基因序列染色體定位疾病功能基因第6章基因組

分析異常基因的產物（蛋白質）：純化蛋白質，弄清它是如何引起臨床癥狀的有兩條不同的路線：1.進行氨基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選對應的編碼基因；將異常蛋白質制成相應的抗體，從cDNA表達文庫中篩選相應克隆。得到克隆后，就可以通過DNA序列分析確定導致疾病的分子缺陷。

絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷（酶）病如白化病（albinism）、苯丙酮尿癥（phenylkeonuria，PKU）和鐮刀形細胞貧血病（sickle-celldisease）等，都是采取的這一策略。第6章基因組血紅蛋白病——鐮刀形細胞貧血癥正常HbA四條多肽鏈（2條鏈，兩條鏈）第6章基因組

定位克隆又稱為“逆向遺傳學”，始于20世紀80年代后期利用遺傳連鎖或細胞學定位技術將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標記在染色體上的位置。克隆：從定位的染色體區(qū)段內分離克隆所要的基因，并進一步研究其功能。疾病遺傳標記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質產物生物學功能

疾病

基因功能第6章基因組定位克隆：通過遺傳標記，先獲得某一表型基因在染色體上的定位，再在候選區(qū)域內選擇已知基因，進行致病突變的篩選，并獲得cDNA及全基因。

基本思路是通過連鎖分析原理進行基因定位。

若多態(tài)標記與待定基因距離較遠，則它們在向子代傳遞時會發(fā)生自由分離，呈“連鎖平衡”；反之，則不發(fā)生自由分離，而呈現(xiàn)“共分離”現(xiàn)象，即“連鎖不平衡”。據(jù)此可在染色體上定位與某一DNA標記相連鎖的基因。第6章基因組將基因定位于染色體特定區(qū)段2.候選基因篩選鑒定第6章基因組

定位克隆的主要目的之一是將目標基因定位于特定染色體上。

主要方法：家系調查法體細胞雜交法核酸雜交技術等等第6章基因組

A-1型短指（趾）癥法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學醫(yī)學院博士畢業(yè)論文中首先報道了，即世界上第一例孟德爾常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學的經典例子被全世界的生物學和遺傳學教材廣泛引用。第6章基因組

賀林實驗室利用布依族、苗族和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大家系，對該病的致病基因進行了精確定位（位點定在2q35-36區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因上的三個突變位點是導致A-1型短指（趾）癥的直接原因。第6章基因組第6章基因組用遺傳標記進行基因定位

形態(tài)標記

morphologicalmarkers

細胞標記

cytologicalmarkers

生化標記

biochemicalmarkers

分子標記

molecularmarkers第6章基因組分子遺傳標記

在核酸分子水平，對具有相對差異的等位基因DNA多態(tài)性的標記，廣泛存在于高等生物編碼區(qū)和非編碼區(qū)，又稱為DNA分子標記，是DNA水平上遺傳變異的直接反映。第6章基因組特點:

1.直接以DNA形式表現(xiàn)，在生物體各發(fā)育階段,各組織均可檢測到。

2.數(shù)量多，遍及整個基因組。

3.多態(tài)性高，自然界存在許多等位突變，無需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料

4.中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然連鎖

5.許多分子標記表現(xiàn)為共顯性（codominance）,能夠鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息

第6章基因組分子遺傳標記發(fā)展

RFLP

restrictfragmentlengthpolymorphism

限制性片段長度多態(tài)性

SSLP

simplesequencelengthpolymorphism

簡單序列長度多態(tài)性

SNP

singlenucleotidepolymorphism

單核苷酸多態(tài)性

第6章基因組第6章基因組SSLP

simplesequencelengthpolymorphism

簡單序列長度多態(tài)性，又稱為VNTR

variablenumbertandemrepeat

數(shù)目可變的串聯(lián)重復多態(tài)性

指重復單位相對較小,由重復單位的序列差異和數(shù)目變化,可形成豐富的多態(tài)性。

包括:

小衛(wèi)星序列

minisatellite

微衛(wèi)星序列

microsatellite

,第6章基因組小衛(wèi)星DNA標記

minisatellite，核心序列為11－60bp，主要存在于染色體靠近端粒處，由于其拷貝數(shù)變化，在不同個體間中存在串聯(lián)數(shù)目的差異，若在重復序列兩側有限制性內切酶酶切位點，則切下來的片段會呈現(xiàn)出多態(tài)性。可用于DNA指紋，DNAFinger。

第6章基因組第6章基因組微衛(wèi)星DNA標記microsatellite，指以2－7個堿基為核心單位串聯(lián)重復而成的一類序列（微衛(wèi)星DNAmicrosatelliteDNA，又稱為STRshorttandemrepeat短串聯(lián)重復序列）,由于核心序列重復數(shù)目的變化而在群體中呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，但在同一家系內具有高度的遺傳保守性，以孟德爾方式遺傳。散布于整個基因組中。第6章基因組SNPsinglenucleotidepolymorphism

單核苷酸多態(tài)性，是指在基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1％。SNP分為兩種形式：基因編碼區(qū)的SNP，稱為cSNP

遍布于基因組內的大量單堿基變異第6章基因組SNP分析的特點：（1）SNP數(shù)量大，分步密集，平均每1000bp就有一個SNP（2）SNP比STR擴增更有效，不會產生假帶（3）由于SNP是二態(tài)的，易于自動化批量檢測，易于用計算機分析結果第6章基因組SNP與RFLP和STR等DNA標記的主要不同在于：

不再以“長度”的差異作為檢測手段而是直接以序列的差異作為標記。但SNP單個基因座的多態(tài)性很差，只有二態(tài)，為此采用多個SNP基因座進行“單倍型”分析十分重要。第6章基因組SNP是繼人類基因組計劃之后又一國際研究競爭新熱點，該項目研究是闡明基因組功能及特點的重要基礎。SNP是人類基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病的重要遺傳基礎。第6章基因組其他遺傳標記舉例AFLP

amplifiedfragmentlengthpolymorphism

擴增片段長度多態(tài)性RAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA

隨機擴增多態(tài)性SSCP

singlestrandconformationpolymorphism

單鏈構象多態(tài)性第6章基因組AFLPamplifiedfragmentlengthpolymorphism

擴增片段長度多態(tài)性

通過DNAPCR擴增基因組DNA的模板，隨后用電泳將擴增片段分離，通過DNA譜帶鑒別多態(tài)性。RAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA

隨機擴增多態(tài)性

用于擴增多態(tài)性DNA的引物是隨機的。在做多態(tài)性分析時，用一組引物（20－

40個）在基因組全序列上掃描可獲得基因組多態(tài)性的豐富信息。第6章基因組

SSCPsinglestrandconformationpolymorphism

單鏈構象多態(tài)性

是基于PCR擴增而新發(fā)展起來的DNA多態(tài)性分析，利用PCR特異的擴增出基因組的目的DNA片段，變性后形成的單鏈DNA在自然條件下能形成一定的空間構象，并且這種空間構象由DNA鏈的堿基序列決定，若堿基發(fā)生變化，將在電泳圖譜上表現(xiàn)出不同生物個體的特異性，即多態(tài)性。第6章基因組

用原位雜交insituhybridazation和熒光原位雜交fluorescenceinsituhybridazation,FISH進行基因定位：

將DNA探針用同位素或熒光染料標記，按照堿基互補配對原則，與固定在玻片上的中期染色體雜交后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)不同顏色的熒光。

FISH是一項十分靈敏的技術，可以檢測出非整倍體，基因擴增，微小的染色體重排或易位等染色體變異第6章基因組原位雜交基因定位第6章基因組多色FISHM-FISH技術熒光原位雜交第6章基因組FISH在腫瘤發(fā)生發(fā)展相關染色體變異方面的研究應用：比較基因組雜交技術comparativegenomichybridization，CGH

利用同一種生物異常細胞的基因組做探針，與正常細胞基因組雜交，通過對雜交信號分析，發(fā)現(xiàn)不同，尋找相關基因。第6章基因組利用染色體步移確定基因位置第6章基因組定位候選克隆該方法是定位克隆的進一步發(fā)展將疾病相關基因定位于染色體相關區(qū)域該染色體區(qū)域得到若干候選基因進一步分析得到目的cDNA蛋白質功能研究疾病染色體定位若干候選基因確定目的基因蛋白質功能第6章基因組

ｃＤＮＡ篩選染色體定位只是定位克隆的第一步。由于ｃＤＮＡ篩選、確認的困難，使其成為定位克隆策略的“瓶頸”。目前獲得基因序列的方法大致有:(1)對<500ｋｂ的關鍵部位進行直接測序；(2)比較基因組作圖和測序；(3)基因結構特征分析；(4)ｃＤＮＡ捕獲，主要有ＣｐＧ島捕捉層析法、外顯子捕捉法、直接篩選ＰＣＲ法等方法第6章基因組差異表達

原理:比較不同個體或不同細胞來源，即通常所指的樣本(tester，Ｔ)和參照(driver，Ｄ)的蛋白質或ｍRNA兩者之間的差異，如缺失或特異表達部分，從而發(fā)現(xiàn)新基因第6章基因組

1.差異性表達mRNA方法

（1）mRNA差異顯示（mRNA-DifferentialDisplay，mRNA-DD）（2）抑制性消減雜交（SuppressionSubtractiveHybridization，SSH）（3）cDNA代表性差異分析（cDNARepresentationalDifferenceAnalysis，cDNA-RDA）（4）cDNAmicroarray

2.差異性表達蛋白質第6章基因組消減雜交（subtractivehybrization）

利用目的基因在兩種組織或細胞中表達的差異，或者在不同發(fā)育階段、不同狀態(tài)下表達差異，通過其mRNA或單鏈cDNA進行雜交，除去兩者之間相同的基因成分，使表達有差異的基因得到充分富集。它的實質是對兩組基因轉錄本全面比較，去同存異，分離差異表達基因第6章基因組Subtractivecloning第6章基因組

cDNA-RDA技術cDNA-RDA（cDNA-RepresentativeDifferenceAnalysis）技術是1994年Huband和Schatz在RDA和mRNA-DD二者基礎上建立的一種基因克隆新方法

在代表性差異分析基礎上，以mRNA表達水平的差異為差減目標，因而兼有RDA和mRNA-DD的優(yōu)點,這一方法克服了mRNA-DD假陽性率高的缺點，排除與表型無關的基因，通過消減雜交驅逐同源序列，降低了后期鑒定的工作量，但操作煩瑣。特點：第6章基因組

腫瘤組織Driver正常組織TesterAAAAAAmRNAdscDNAMboI酶切連接接頭PCR擴增無接頭換新接頭雜交無擴增線性擴增指數(shù)擴增cDNA-RDA方法簡要示意圖第6章基因組

因為同一種mRNA經不同的剪接或翻譯后修飾加工可產生多種蛋白質，因此一個蛋白質組中蛋白質的數(shù)量超過相應基因組的基因數(shù)目。蛋白質組研究常用方法：二維凝膠電泳技術，蛋白質序列分析，質譜分析等等。差異性表達蛋白質第6章基因組生物信息學方法通過序列的ORF預測建立cDNA文庫差減雜交得到均質化文庫cDNA序列測定生物信息學分析，ORF預測同源性比較，功能預測第6章基因組生物信息學（bioinformatics）是生物學，計算機科學，以及應用數(shù)學等學科相互交叉而形成的一門新興學科。以計算機為主要工具，開發(fā)各種軟件，對日益增長的DNA和蛋白質的序列和