第五章

植物細胞工程制藥第5章植物細胞制藥植物細胞培養與細胞工程植物器官培養和快繁莖尖培養和無毒苗生產胚胎培養和胚挽救技術(包括胚乳培養、試管受精)花藥培養和單倍體育種細胞培養和次生代謝產物的工業化生產植物突變體篩選利用和體細胞無性系變異原生質體培養和融合人工種子第5章植物細胞制藥細胞工程應用的原理和方法研究的水平研究的目的細胞生物學和分子生物學細胞整體水平或細胞器水平按照人們的意愿來改變細胞內的遺傳物質或獲得細胞產品概念分類植物細胞工程動物細胞工程理論基礎細胞的全能性第5章植物細胞制藥植物細胞工程制藥

第一節序言從植物中尋找高效、低毒、廉價的藥物，以期攻克許多危害人類的疾病、癌癥、艾滋病等。高等植物的次生代謝產物豐富多樣，在食品、醫藥、化工、農業中做為原料得到廣泛的應用。人工合成單一的植物次生代謝產物十分困難：收率低、成本高、合成工藝復雜、合成后的異構體拆分困難。植物細胞培養是獲得植物次生代謝產物的捷徑，但技術仍有待完善。有些極其昂貴的生物藥物，如抗癌首選藥物--紫杉醇等，可以用大規模培養植物細胞來直接生產。近年國內在紅豆杉組織培養中獲得生長量高達0.49gFW·d-1的細胞系，每升細胞培養物中紫杉醇的產量可達0.25mg。第5章植物細胞制藥細胞的全能性概念大小原因必要條件受精卵生殖細胞體細胞＞＞細胞離體、一定的營養物質、激素和其他外界條件基本概念植物細胞的全能性：植物體中任何一個具有完整細胞核（完整染色體組）的細胞，在一定條件下都可以重新再分化形成原來的個性。第5章植物細胞制藥植物的分化（differentiation）可以分為胚胎發生和器官發生兩個階段。前者是從精子與卵細胞結合開始，分化為幼胚進而發育為成熟胚和種子；后者是種子在適宜的條件下萌發，形成根、莖、葉、花和果實。脫分化（dedifferentiation)：已經分化的細胞、組織和器官在人工培養的條件下又變成未分化的細胞組織的過程。再分化（redifferentiation)：通過脫分化誘導形成的愈傷組織在適宜的培養條件下可再分化成為胚狀體或直接分化出器官。①由體細胞或性細胞通過脫分化形成胚狀體；②這愈傷組織直接形成胚狀體。上述兩種途徑都可進一步發育成同母體相同的植株，即植物細胞全能性。第5章植物細胞制藥外植體（explant）：是指用于植物組織（細胞）培養的器官或組織（的切段），植物的各部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花等均可作為外植體進行組織培養。無性繁殖系（clone）又叫克隆，在植物細胞工程中是指使用母體培養物反復進行繼代培養時，通過同一外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代。同一無性系分離出來的兩個或多個不同的系列，稱為無性系的變異體。第5章植物細胞制藥植物細胞工程植物組織培養植物體細胞雜交過程離體的植物器官、組織或細胞愈傷組織根、芽植物體外植體脫分化植物激素：細胞分裂素、生長素再分化第5章植物細胞制藥次級代謝作用和次級代謝產物初級代謝產物：維持細胞生長必需的代謝產物，它包括合成代謝的中間產物及終產物。次級代謝產物：由初級代謝產物衍生而來，對生物的生存、生長、繁殖無關的那類代謝產物。第5章植物細胞制藥植物細胞與組織培養第5章植物細胞制藥植物細胞的結構特征基本特征：有剛性的細胞壁和大的液泡，以及質體（如葉綠體）。主要生理活性特質：酶類、維生素、植物激素、抗生素和植物殺菌素、生物堿、糖甘類、揮發油、有機酸等。植物培養細胞的生理特性第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

一、植物材料的準備1、外植體(explant)的選擇⑴用于直接分離細胞的外植體的選擇葉片是直接分離單細胞的最好材料。選擇適當生長期健康植株，并選擇細胞之間粘連程度比較小的組織。但從外植體直接分離細胞由于受到酶或機械的作用，細胞結構會受到一定程度的損傷，獲得完整細胞的數量較少，使用受到限制。取自活體植物體、接種在培養基上的無菌細胞、組織、器官等。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

一、植物材料的準備1、外植體(explant)的選擇⑵用于愈傷組織誘導的外植體的選擇不同植物種類對于誘導條件的反應不同；同一植物不同部位的誘導難易程度不同；基因型對愈傷組織誘導的影響；外植體生理狀態直接影響誘導；取材季節也是成功的重要條件之一；選用產生欲生產的次生代謝產物的組織器官。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

一、植物材料的準備1、外植體(explant)的選擇⑶用于分離原生質體的外植體的選擇苗齡和葉齡對于原生質體的產率影響最重要；苗齡對用子葉或下胚軸誘導原生質體培養影響明顯；使用葉片做外植體時，葉片中部原生質體得率最高；第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

一、植物材料的準備2、外植體的預處理⑴外植體的滅菌消毒處理①莖尖、莖段及葉片的處理：自來水充分沖洗，用粘肥皂粉或洗潔精的軟毛刷刷洗，吸干水分；75％酒精浸泡10-30秒鐘，無菌水沖洗2-3次；2％-10％次氯酸鈉中10-15min，或0.1-0.2%升汞浸泡5-10min；如果材料表面不平或有茸毛，可在消毒液中加幾滴TritonX或Tween-80以強化滅菌效果；材料滅菌后立即取出，用無菌水沖洗4-5遍，用無菌濾紙擦干；第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

一、植物材料的準備2、外植體的預處理⑴外植體的滅菌消毒處理②果實及種子的消毒處理：自來水沖洗，用75％酒精迅速漂洗一次；果實：用2％次氯酸鈉浸泡10min，無菌水沖洗幾次；種子：10％次氯酸鈉浸泡20-30min，甚至幾小時；還可用0.1%升汞再處理5min；對于做胚或胚乳培養的種子，可先去掉種皮，4%-8%次氯酸鈉浸泡8-10min，用無菌水沖洗多次。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

一、植物材料的準備2、外植體的預處理⑴外植體的滅菌消毒處理③根及地下貯藏器官的消毒處理：用自來水沖洗干凈，用軟毛刷刷洗；用濾紙吸干后用純酒精漂洗；0.1%-0.2%升汞浸泡5-10min，或2%次氯酸鈉浸泡10-15min；無菌水洗3-4次。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

一、植物材料的準備2、外植體的預處理⑴外植體的滅菌消毒處理④花藥的消毒處理：發育適宜時期的花藥被嚴密地包裹在花萼、花瓣或穎片之中，屬自然無菌狀態；花蕾用70％酒精擦拭；將花蕾浸泡在飽和漂白粉的上請液中10min；無菌水沖洗2-3次；小麥、水稻、玉米等的幼穗去掉外層苞片，70％簡單消毒后即可接種。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基碳源：以蔗糖為主，具有葉綠體的細胞可以利用CO2；氮源：硝態氮對植物細胞生長有利；無機鹽：在各種培養基中的大量元素和微量元素，以磷酸鹽、硫酸鹽和硝酸鹽的形式提供；生長因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素、生長激素第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基來源：不含或少含某些離子的重蒸水（雙蒸水）或去離子水。目的：保持培養基成分完全人為控制。作用：起媒介作用

組成作物體（占75—80%）

提供O、H元素

運輸物質、調節滲透壓1、水：培養基大部分是水第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基大量元素：每升培養基含0.5mM以上

微量元素：每升培養基含0.5mM以下

大量元素：O、H、N、C、P、K、Mg、S、Ca2、無機鹽、大量元素、微量元素第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基來源：硝態或氨態氮，或兩者混用。作用：N吸收轉化—氨基酸—蛋白質蛋白質主要組分是N；核酸含N；酶本身是蛋白質；細胞生長分化需N；2、無機鹽、大量元素、微量元素N第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基2、無機鹽、大量元素、微量元素來源：NaH2PO4或KH2PO4

作用：是植物體必需元素之一；

與蛋白質合成有關，缺磷蛋白質含量降；

高能磷酸鍵的化合物，供能ATP；

形成核蛋白、含P化合物、核酸組分；

碳水化合物、蛋白質、脂肪合成、相互轉化需磷。P第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基2、無機鹽、大量元素、微量元素Mg、S來源：MgSO4.7H2O滿足硫鎂的需要。作用：鎂是葉綠素組分；

S是蛋白質、氨基酸、酶的組分，缺S影響蛋白質合成、影響葉綠素形成。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基2、無機鹽、大量元素、微量元素K、CaK：

來源：KCl、KNO3、KH2PO4

作用：酶促反應活化劑。

Ca：

來源：CaCl2.H2O或Ca(NO3)2.4H2O、

作用：影響酶的活性方向。

決定新陳代謝的過程。

構造細胞壁，影響細胞分裂。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基2、無機鹽、大量元素、微量元素Fe、Cu、NaFe：來源：Na2EDTA螯合劑加FeSO4.7H2O和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）螯合鐵，pH7.6-8.0。作用：植物組織延長生長有作用。Cu：促離體根生長。Na：酶的組成成分，防葉綠素破壞。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基Mn：與植物呼吸作用、光合作用有關。

B：影響蛋白質合成。注意:不同培養基無機鹽濃度相差有的高達10倍；高濃度無機鹽保證組織生長需要的礦質營養，使生長加快；根要求無機鹽濃度低些。2、無機鹽、大量元素、微量元素Mn、B第5章植物細胞制藥無機鹽的影響NoMSsalts外植體沒有任何再生跡象MSsaltsreducedto0.47g/L

長出一些根，但芽不發育MSsaltsincreasedto9.52g/L

外植體上表面發育出芽，但沒有根和愈傷組織。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基⑴碳源來源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麥芽糖、纖維二糖或多糖類的可溶性淀粉、糊精及果膠；一般為2—3%的蔗糖。作用：維持培養基的合適滲透壓；

構造植物體；

參與新陳代謝。注意：不同濃度影響細胞的增殖分化。3、有機化合物

碳源、維生素、氨基酸、植物激素第5章植物細胞制藥蔗糖的影響1Growthmediumisoptimizedforregenerationofplantlets外植體上表面完全被綠色芽覆蓋，下表面發育出根。Nosucrose(0%)外植體發育出稀少的芽，但沒有生出根和愈傷組織。第5章植物細胞制藥蔗糖的影響2Sucrosereducedto1%外植體上表面邊際芽發育出來，也出現了一些根。Sucroseincreasedto5%外植體表面覆蓋發育的芽，同時，下表面出現根。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基3、有機化合物

碳、維生素、氨基酸、植物激素⑵維生素類：V-C（抗壞血酸）：強還原能力，防組織氧化變褐。V-B1（硫胺素）：促愈傷組織產生，與愈傷組織活力有關。V-B2（煙酸或維生素PP）：促代謝，促胚的發育，高濃度會抑制生長。V-B6（吡哆醇）：促根生長。肌醇（環己六醇）：無促進生長的作用，但有助活性物質發揮作用。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基⑶氨基酸來源：常用甘氨酸及多種氨基的混合水解酪蛋白，水解乳蛋白等。作用：是蛋白質的組分；促進器官增殖；可作有機氮源。

3、有機化合物

碳、維生素、氨基酸、植物激素第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基3、有機化合物

碳、維生素、氨基酸、植物激素⑷植物激素①：生長素

吲哚乙酸（IAA）：特性：天然生長素作用：促離體組織生長、促進愈傷組織形成。

萘乙酸（NAA）：特性：人工合成的化學物質。作用：利發根，但根較細弱，IAA+IBA(吲哚丁酸)處理使根生長健壯。

2,4-D（二氯苯氧乙酸）：作用：促愈傷組織形成，誘導作用比IAA高10倍。抑制器官、綠芽、根形成，特別是高濃度時抑制作用更強。第5章植物細胞制藥激素的影響NAANoNAA少量芽發育，根不發育大量愈傷組織出現，少量芽發育，根不發育。NAAreducedto0.1mg/L外植體上、下面發育大量根，芽很少，也有一些愈傷組織出現。NAAincreasedto5.0mg/L第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基3、有機化合物

碳、維生素、氨基酸、植物激素⑷植物激素②：細胞分裂素6-呋喃甲基腺嘌呤(激動素、KT)：化學合成物質。作用：廣泛誘導芽的形成，誘導愈傷組織時，適量加KT能改善器官發生狀況。6-芐基氨基嘌呤(6-BA)：人工合成作用：廣泛誘導芽的形成，BA效力比KT大。玉米素(ZT)：天然產物作用：對某些植物有特效。腺嘌呤(AD)：作用：誘導植物細胞分裂，對芽形成有促進作用。第5章植物細胞制藥激素的影響BAPNoBAP

大量根發育，少量芽生長；外植體邊緣出現未分化的愈傷組織。BAPreducedto0.1mg/L

根與芽的發育更加平衡，外植體邊緣正在發育未分化的愈傷組織。第5章植物細胞制藥植物組織和細胞培養物的生長過程主要取決于生長素和分裂素的比例。高濃度生長素和低濃度分裂素刺激細胞分裂；而低濃度生長素和高濃度分裂素則刺激細胞生長。極個別植物組織含有合成足夠和量內源植物激素的能力；絕大多數植物組織和細胞培養基加入一定量的植物生長調節劑。少數培養物在經歷了多次繼代培養后也可能自發成長為激素自養型（不穩定表型），此類組織的優點是其生長率高和費用低。第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基3、有機化合物

碳、維生素、氨基酸、植物激素第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基來源：從紅藻等海藻中提取的高分子化合物。特性：90℃熔解，40℃以下凝固；過酸、過堿或加高溫會發生水解喪失凝固力，存放過久會變褐喪失凝固力。用量：瓊脂

0.6-1.0%，卡拉膠

0.4-0.8%。作用：凝固劑，固體培養時使液體培養基凝固。4、瓊脂第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基培養基母液的配制1、大量元素10倍母液：分別稱取10倍量的硝酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣，分別溶解，按上述順序混合，定容至1000ml；配制1000ml培養基取100ml。2、微量元素100倍母液：分別稱取1000倍量的硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、碘化鉀、硫酸銅、氯化鈷、鉬酸鈉，分別溶解，按上述順序混合，定容至100ml；配制1000ml培養基取1ml。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基3、鐵鹽100倍母液分別稱取100倍的FeSO3和Na2EDTA，分別溶解，然后混合，定容至100ml，配制1000ml培養基取10ml。4、維生素與氨基酸母液培養基母液的配制每種單獨配制成1mg/ml的100ml母液；氨基酸用量一般較高，可直接稱取加入培養基；肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也無需配制母液，直接稱取加入培養基即可。第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基培養基母液的配制5、植物激素母液單獨稱量，單獨配制成0.1～2.0mg/ml的母液；生長素類先用少量0.1MNaOH溶解，細胞分裂素需用1MHCl少許先行溶解，再稀釋到所需濃度；赤霉素(GA3)在水中不穩定，需用95％酒精配制母液；脫落酸(ABA)需先少量丙酮助溶，然后加水溶解；一般生長素濃度的使用為0.05-5mg／L，細胞分裂素0.05—10mg／L。

第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

二、培養基激素的配比模式無激素的培養基被稱為基本培養基。植物組織和細胞培養物的生長過程主要取決于生長素和細胞分裂素的比例：形成愈傷組織、長根還是長芽。高有利于根和愈傷組織的形成生長素/細胞分裂素適中有利于根芽的分化低有利于芽的形成第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

三、培養方法植物細胞/組織培養方法很多，其分類也不盡相同。第5章植物細胞制藥1.固體培養包括利用瓊脂作為支技物的固體培養和固定化細胞培養。特點：簡便易行、培養所占空間小缺點：培養條件不均一，易堆積有害代謝物，難以控制和檢測常用固化劑：瓊脂、藻酸鹽、角叉藻聚糖、明膠、羥乙基纖維素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅膠等。第四節植物細胞培養基本技術

三、培養方法第5章植物細胞制藥第四節植物細胞培養基本技術

三、培養方法固體培養：用瓊脂(0.6%-1.0%)、明膠(10%)等做支持物的固體培養因簡便易行而被普遍使用。液體培養：無凝固劑支持物的懸浮培養?？販兀?5±1℃控光：有些植物材料在誘導愈傷組織階段需要避光，但生長、分化和再生都需光。用日光燈供光，16h/d。外植體在培養3周左右必須更換到新鮮培養基中(繼代培養)。第5章植物細胞制藥2.液體培養一種外植體經過一定次數的繼代培養，待愈傷組織變得較為疏松時，其培養物就可用于懸浮培養。液體培養系統包括小規模的懸浮培養和大規模的成批培養、半連續和連續培養。懸浮培養可分為靜止和振蕩兩類。靜止培養簡便易行，而且不會出現營養物質濃度差的現象。振蕩液體培養，是使懸浮細胞在液體培養基中，利用磁力攪拌或搖床在不斷振（搖）動的情況下進行培養，此法可克服靜止培養的許多缺點。第四節植物細胞培養基本技術

三、培養方法第5章植物細胞