SETD5在非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的角色與機(jī)制研究一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌在癌癥相關(guān)死亡原因中占據(jù)首位，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。在肺癌的眾多病理類型中，非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）是最為常見(jiàn)的類型，約占所有肺癌病例的85%。這一比例意味著，絕大多數(shù)肺癌患者被診斷為非小細(xì)胞肺癌，其治療和研究的重要性不言而喻。非小細(xì)胞肺癌包含多種亞型，如腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌等。不同亞型的非小細(xì)胞肺癌在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面存在顯著差異。例如，腺癌在女性和不吸煙人群中更為常見(jiàn)，且與某些特定的基因突變密切相關(guān)；鱗狀細(xì)胞癌則多與吸煙史相關(guān)，其生物學(xué)行為和治療策略也有別于腺癌。然而，無(wú)論何種亞型，非小細(xì)胞肺癌的總體預(yù)后仍然不容樂(lè)觀，5年生存率相對(duì)較低。盡管近年來(lái)在肺癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的優(yōu)化、靶向治療和免疫治療的出現(xiàn)，但肺癌患者的生存狀況仍有待進(jìn)一步改善。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良的主要原因之一。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，逐漸失去上皮細(xì)胞的特性，如細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，同時(shí)獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力的過(guò)程。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，EMT是一個(gè)正常且重要的生物學(xué)過(guò)程，它參與了胚胎的形態(tài)發(fā)生和器官形成。例如，在原腸胚形成過(guò)程中，上皮細(xì)胞通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，從而使細(xì)胞能夠遷移到特定的位置，形成不同的組織和器官。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，EMT的異常激活卻為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了條件。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后，其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，從規(guī)則的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴笮位蚶w維樣外觀的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。這種形態(tài)變化使得腫瘤細(xì)胞能夠突破上皮組織的基底膜，進(jìn)入周圍的間質(zhì)組織。同時(shí)，EMT還會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間連接減弱，使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)腫瘤灶，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)系統(tǒng)。一旦進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，腫瘤細(xì)胞就有可能隨著血流或淋巴流到達(dá)遠(yuǎn)處的組織和器官，形成轉(zhuǎn)移灶。此外，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞還具有更強(qiáng)的抗凋亡能力和耐藥性，這使得它們能夠在轉(zhuǎn)移過(guò)程中逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和治療干預(yù)，從而增加了腫瘤治療的難度。SETD5作為一種重要的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中可能扮演著關(guān)鍵角色。研究SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，具有重要的理論和臨床意義。從理論角度來(lái)看，深入了解SETD5在EMT過(guò)程中的作用機(jī)制，有助于揭示非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富我們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)。這不僅可以為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向，還可能發(fā)現(xiàn)新的分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究腫瘤的生物學(xué)行為提供理論支持。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，明確SETD5與非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系，有可能為非小細(xì)胞肺癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。例如，如果能夠證實(shí)SETD5在非小細(xì)胞肺癌EMT過(guò)程中起關(guān)鍵作用，那么可以通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織或患者體液中SETD5的表達(dá)水平，來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和患者的預(yù)后。此外，針對(duì)SETD5開(kāi)發(fā)特異性的抑制劑或治療方法，有可能阻斷EMT過(guò)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。這對(duì)于改善非小細(xì)胞肺癌患者的治療效果和預(yù)后具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，有望為臨床治療提供新的策略和手段。1.2研究目的本研究旨在深入探究SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的具體影響及分子機(jī)制。具體而言，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)方法，明確SETD5在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系和組織樣本中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)水平與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物以及患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。運(yùn)用基因編輯技術(shù)，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中敲低或過(guò)表達(dá)SETD5，觀察其對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響，包括細(xì)胞形態(tài)變化、遷移和侵襲能力的改變等。從分子層面入手，研究SETD5調(diào)控非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路和相關(guān)分子機(jī)制，尋找潛在的作用靶點(diǎn)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證SETD5在體內(nèi)對(duì)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的影響，進(jìn)一步明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用。本研究期望為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為改善患者的預(yù)后提供新的思路和策略。1.3研究意義本研究聚焦于SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，具有多方面的重要意義。在理論層面，能夠加深我們對(duì)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的理解。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)通路的異常調(diào)控。目前，雖然已經(jīng)對(duì)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用有了一定的認(rèn)識(shí)，但其中的分子機(jī)制尚未完全明確。通過(guò)研究SETD5在非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，有望揭示新的調(diào)控機(jī)制和信號(hào)通路，填補(bǔ)該領(lǐng)域在基礎(chǔ)研究方面的部分空白，為進(jìn)一步深入研究腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過(guò)程提供理論依據(jù)。這不僅有助于豐富腫瘤學(xué)的基礎(chǔ)理論知識(shí)，還可能為其他腫瘤的轉(zhuǎn)移研究提供借鑒和思路，推動(dòng)整個(gè)腫瘤學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，本研究具有更為直接和重要的意義。首先，有望為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。當(dāng)前，非小細(xì)胞肺癌的治療手段雖然多樣，但對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，治療效果仍然不盡人意。如果能夠確定SETD5在非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用，那么就可以將其作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)針對(duì)SETD5的特異性藥物或治療方法。這些藥物或方法可以通過(guò)抑制SETD5的功能，阻斷上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為非小細(xì)胞肺癌患者提供更有效的治療選擇，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。這對(duì)于改善非小細(xì)胞肺癌的臨床治療現(xiàn)狀具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，可能會(huì)為肺癌治療帶來(lái)新的突破。其次，本研究結(jié)果還有可能為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后評(píng)估提供新的指標(biāo)。目前，臨床上評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)相對(duì)有限，且存在一定的局限性。通過(guò)檢測(cè)SETD5在腫瘤組織中的表達(dá)水平，結(jié)合上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后情況。這有助于醫(yī)生制定更個(gè)性化的治療方案，對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)患者，可以采取更積極的治療措施，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和干預(yù)；對(duì)于低風(fēng)險(xiǎn)患者，則可以避免過(guò)度治療，減少患者的痛苦和醫(yī)療資源的浪費(fèi)。因此，本研究在臨床實(shí)踐中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠?yàn)榉切〖?xì)胞肺癌的精準(zhǔn)治療和預(yù)后評(píng)估提供有力的支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1非小細(xì)胞肺癌概述2.1.1定義與分類非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最為常見(jiàn)的一大類，約占肺癌病例總數(shù)的85%。它并非單一的疾病類型，而是包含了多種不同病理特征的腫瘤。從組織學(xué)角度來(lái)看，非小細(xì)胞肺癌主要包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌這三種主要類型。腺癌在非小細(xì)胞肺癌中所占比例較高，近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，尤其在女性和不吸煙人群中更為常見(jiàn)。腺癌的癌細(xì)胞通常起源于支氣管黏液腺，可發(fā)生于細(xì)小支氣管或中央氣道。在形態(tài)上，腺癌的癌細(xì)胞大小和形狀各異，常形成腺樣結(jié)構(gòu)或乳頭樣結(jié)構(gòu)。根據(jù)腺癌的生長(zhǎng)方式和病理特征，又可進(jìn)一步細(xì)分為原位腺癌、微浸潤(rùn)性腺癌、浸潤(rùn)性腺癌以及浸潤(rùn)性腺癌變異型等多個(gè)亞型。原位腺癌直徑通常≤3cm，舊稱細(xì)支氣管肺泡癌，腫瘤細(xì)胞沿肺泡壁呈鱗屑樣生長(zhǎng)，無(wú)間質(zhì)、血管或胸膜侵犯；微浸潤(rùn)性腺癌直徑也≤3cm，但浸潤(rùn)間質(zhì)最大直徑≤5mm，且無(wú)脈管和胸膜侵犯；浸潤(rùn)性腺癌則浸潤(rùn)間質(zhì)最大直徑＞5mm，包括貼壁樣生長(zhǎng)為主型、腺泡為主型、乳頭狀為主型、微乳頭為主型和實(shí)性癌伴黏液形成型等多種生長(zhǎng)方式；浸潤(rùn)性腺癌變異型如黏液型、膠樣型、胎兒型和腸型腺癌等，具有獨(dú)特的病理表現(xiàn)。鱗癌，即鱗狀上皮細(xì)胞癌，在非小細(xì)胞肺癌中也占有一定比例。它多起源于段或亞段的支氣管黏膜，有向管腔內(nèi)生長(zhǎng)的傾向，早期常導(dǎo)致支氣管狹窄，引發(fā)肺不張或阻塞性肺炎。鱗癌可分為角化型、非角化型和基底細(xì)胞樣型鱗狀上皮細(xì)胞癌。典型的角化型鱗癌顯示來(lái)源于支氣管上皮的鱗狀上皮細(xì)胞化生，常有細(xì)胞角化和（或）細(xì)胞間橋；非角化型鱗癌因缺乏細(xì)胞角化和（或）細(xì)胞間橋，常需借助免疫組化來(lái)證實(shí)存在鱗狀分化；基底細(xì)胞樣型鱗癌的基底細(xì)胞樣癌細(xì)胞成分至少＞50%，免疫組化染色癌細(xì)胞CK5/6、p40和p63呈陽(yáng)性。在大體形態(tài)上，中央型鱗狀細(xì)胞癌肉眼可見(jiàn)灰白色腫塊環(huán)繞大支氣管；腔內(nèi)型腫物主要沿支氣管表面向腔內(nèi)生長(zhǎng)，呈息肉狀或乳頭狀凸起于支氣管腔內(nèi)，向管壁浸潤(rùn)輕微；管壁浸潤(rùn)型腫物則向支氣管壁深部浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，受累支氣管的管壁明顯增厚，管腔狹窄僵硬，腫物可穿透支氣管軟骨環(huán)，直至外膜，腫物較大時(shí)常?？梢?jiàn)中央壞死，空洞形成。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞癌，相對(duì)少見(jiàn)，占肺癌的10％以下。其癌細(xì)胞在細(xì)胞學(xué)和組織結(jié)構(gòu)及免疫表型等方面缺乏小細(xì)胞癌、腺癌或鱗癌的特征，癌細(xì)胞體積較大，核異形明顯，胞漿豐富。大細(xì)胞癌多位于肺臟外周區(qū)域，有時(shí)在腫瘤組織內(nèi)會(huì)出現(xiàn)幾種其他的細(xì)胞類型混合的情況，這使得其診斷存在一定難度。除了上述三種主要類型外，非小細(xì)胞肺癌還包括腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌、NUT癌、唾液腺型癌等其他少見(jiàn)類型，這些類型各自具有獨(dú)特的病理特征和臨床特點(diǎn)，但在非小細(xì)胞肺癌中所占比例相對(duì)較小。2.1.2流行病學(xué)特征非小細(xì)胞肺癌在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌是全球發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌約占肺癌病例的85%。在不同地區(qū)，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率和死亡率存在顯著差異。一般來(lái)說(shuō)，發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率相對(duì)較高，如美國(guó)、歐洲部分國(guó)家等。在美國(guó)，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率在男性中約為57.7/10萬(wàn)，在女性中也達(dá)到了一定的比例。這可能與這些國(guó)家的工業(yè)化程度較高、環(huán)境污染以及吸煙率相對(duì)較高等因素有關(guān)。而在一些發(fā)展中國(guó)家，隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快和生活方式的改變，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。在不同人群中，非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病情況也有所不同。從性別來(lái)看，男性的發(fā)病率普遍高于女性，但近年來(lái)女性患者的比例逐漸增加，尤其是在腺癌患者中，女性的比例相對(duì)較高。這可能與女性對(duì)煙草中有害物質(zhì)的敏感性較高、被動(dòng)吸煙以及女性激素水平等因素有關(guān)。從年齡分布上看，非小細(xì)胞肺癌主要發(fā)生在中老年人，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率逐漸升高。但值得注意的是，近年來(lái)年輕患者的數(shù)量也在逐漸增加，這可能與環(huán)境污染、遺傳因素以及生活壓力等多種因素有關(guān)。例如，一些研究表明，年輕的非小細(xì)胞肺癌患者中，腺癌的比例較高，且EGFR和ALK等基因突變的發(fā)生率也相對(duì)較高。在種族方面，不同種族之間的非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率和死亡率也存在差異。如美國(guó)白種人的非小細(xì)胞肺癌美國(guó)人口標(biāo)化發(fā)病率為57.7/10萬(wàn)，而亞裔為29.8/10萬(wàn)。這種差異可能與遺傳因素、生活習(xí)慣以及環(huán)境暴露等多種因素有關(guān)。2.1.3臨床治療現(xiàn)狀目前，非小細(xì)胞肺癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，臨床通常會(huì)根據(jù)患者的機(jī)體狀況、病理學(xué)類型、臨床分期等因素采取多學(xué)科綜合治療模式。手術(shù)是早期非小細(xì)胞肺癌的主要治療方法，其目的是徹底切除肺部原發(fā)癌腫病灶和局部淋巴組織，并盡可能保留最大量的健康肺組織。對(duì)于IA和IB期的非小細(xì)胞肺癌患者，手術(shù)主張采用肺葉切除，次肺葉切除（楔形切除、肺段切除）一般適用于肺功能不全患者。電視輔助胸腔鏡手術(shù)治療可使術(shù)后疼痛減輕，但目前尚缺乏其完全替代常規(guī)手術(shù)治療的充分證據(jù)。對(duì)于II期非小細(xì)胞肺癌患者，N1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可采用袖式肺葉切除或全肺切除術(shù)式，更推薦袖式肺葉切除。ⅢA期非小細(xì)胞肺癌患者，開(kāi)胸術(shù)中若發(fā)現(xiàn)單一區(qū)域縱隔淋巴結(jié)存在轉(zhuǎn)移性病變，且技術(shù)上能夠?qū)⒘馨徒Y(jié)和原發(fā)腫瘤完全切除，則按計(jì)劃行肺切除以及縱隔淋巴結(jié)切除，每例接受肺切除術(shù)的肺癌患者均應(yīng)行系統(tǒng)縱隔淋巴結(jié)取樣或縱隔淋巴結(jié)清掃術(shù)。然而，ⅢB期和IV期的非小細(xì)胞肺癌患者，由于病情較為嚴(yán)重，手術(shù)效果往往不佳，一般不適宜手術(shù)治療。盡管手術(shù)治療在早期非小細(xì)胞肺癌中取得了一定的療效，但許多接受手術(shù)治療的患者仍可能出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)，因此術(shù)后常需要輔助其他治療方法?；熓峭ㄟ^(guò)使用化學(xué)藥物抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和增殖，從而達(dá)到摧毀癌細(xì)胞的目的。對(duì)于非小細(xì)胞肺癌患者來(lái)說(shuō)，化療是常見(jiàn)的治療方式之一，包括術(shù)前輔助化療、術(shù)后輔助化療等，可以通過(guò)靜脈注射、肌肉注射或口服給藥。常用的化療藥物有長(zhǎng)春瑞濱、順鉑、紫杉醇等。化療能夠在一定程度上延長(zhǎng)患者的壽命并改善生活質(zhì)量，但由于化療藥物不僅會(huì)對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生作用，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害，因此常伴有一系列的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。此外，化療的總體生存率仍然較低，尤其是對(duì)于晚期患者，化療的效果往往有限。放療是利用高能光束破壞癌細(xì)胞的DNA，從而殺死癌細(xì)胞的一種局部治療方法。它可以用于術(shù)后輔助殺死殘留的癌細(xì)胞，也可適用于不能手術(shù)的患者。對(duì)于手術(shù)或化療不敏感的非小細(xì)胞肺癌患者，放療可作為姑息治療的一部分以改善其生活質(zhì)量。對(duì)于僅有肺部單個(gè)小結(jié)節(jié)而無(wú)任何轉(zhuǎn)移的早期非小細(xì)胞肺癌患者，立體定向放射治療是一種有效的治療方法，具有低成本、高便利性以及高生存率等優(yōu)點(diǎn)。然而，放療也會(huì)帶來(lái)一些副作用，如放射性肺炎、放射性食管炎等，對(duì)患者的身體造成一定的負(fù)擔(dān)。靶向治療是針對(duì)腫瘤細(xì)胞中特定的基因突變或蛋白質(zhì)異常，使用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療，能夠精準(zhǔn)作用于癌細(xì)胞，起到抑制其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。常見(jiàn)的靶向治療靶點(diǎn)包括表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）突變、間變性淋巴瘤激酶（ALK）突變、ROS1融合、KRASG12C突變、NTRK融合、BRAFV600突變、MET14外顯子跳躍突變及RET融合等。例如，在NSCLC中，美國(guó)約10%-15%的肺癌患者的EGFR突變檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而亞洲患者的腫瘤中EGFR突變頻率更高（總體達(dá)51.4%）。針對(duì)EGFR突變的NSCLC患者，已經(jīng)有一代、二代和三代EGFR-TKI藥物獲批用于治療，如?？颂婺帷⒍蚵逄婺帷⒓翘婺?、阿法替尼、達(dá)可替尼、奧希替尼、伏美替尼、阿美替尼、貝福替尼、瑞齊替尼、瑞厄替尼等。靶向治療具有特異性強(qiáng)、副作用相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)，但并非所有患者都適用，且部分患者在治療過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果下降。免疫治療是通過(guò)激活自身免疫功能來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，其原理是利用免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）抑制免疫檢查點(diǎn)介導(dǎo)的免疫耐受，增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性，激活機(jī)體自身的免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。臨床研究表明，針對(duì)PD-1、CTLA-4和PD-L1的靶向治療對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者具有益處。免疫治療包括免疫治療單藥、雙免療法或是免疫聯(lián)合化療，免疫治療單藥或與化療結(jié)合被廣泛用于治療對(duì)靶向治療耐藥的晚期非小細(xì)胞肺癌患者。目前，NMPA批準(zhǔn)治療NSCLC的PD-1抑制劑有納武利尤單抗、帕博利珠單抗、特瑞普利單抗、信迪利單抗、卡瑞利珠單抗、替雷利珠單抗、西米普利單抗等；PD-L1抑制劑有度伐利尤單抗、阿替利珠單抗等。免疫治療為非小細(xì)胞肺癌的治療帶來(lái)了新的突破，但也存在一些不良反應(yīng)，如免疫相關(guān)的不良反應(yīng)，包括皮疹、腹瀉、內(nèi)分泌失調(diào)等，且并非所有患者都能從免疫治療中獲益。盡管目前非小細(xì)胞肺癌的治療取得了一定的進(jìn)展，但仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。例如，晚期患者的治療效果仍然不理想，5年生存率較低；治療過(guò)程中的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量；腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移難以有效控制；部分患者對(duì)現(xiàn)有治療方法不敏感或出現(xiàn)耐藥等問(wèn)題。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，提高治療效果，改善患者的預(yù)后，仍然是當(dāng)前非小細(xì)胞肺癌研究的重點(diǎn)和方向。2.2上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）2.2.1EMT的概念及過(guò)程上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）是一個(gè)在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的生物學(xué)過(guò)程。在這一過(guò)程中，上皮細(xì)胞經(jīng)歷了一系列顯著的變化，從而獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性。上皮細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下，具有明確的極性和緊密的細(xì)胞間連接，這些特性使得上皮細(xì)胞能夠形成連續(xù)的上皮層，起到屏障和保護(hù)作用。例如，在皮膚的表皮層，上皮細(xì)胞緊密排列，形成了抵御外界病原體和物理?yè)p傷的第一道防線；在腸道黏膜，上皮細(xì)胞構(gòu)成的屏障則有助于維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和有害物質(zhì)的排出。然而，在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞逐漸失去這些典型的上皮特性。上皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白如E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間連接減弱，細(xì)胞之間的黏附力下降。這使得上皮細(xì)胞之間的聯(lián)系變得松散，原本緊密排列的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞。與此同時(shí)，上皮細(xì)胞開(kāi)始獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性。細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，從規(guī)則的立方形或柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴笮位蚶w維樣外觀的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。這種形態(tài)變化賦予細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。細(xì)胞骨架也發(fā)生重組，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重新排列為細(xì)胞的遷移提供了動(dòng)力支持。上皮細(xì)胞還會(huì)表達(dá)一些間充質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，如N-cadherin、Vimentin等，這些標(biāo)志物的出現(xiàn)進(jìn)一步表明細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在胚胎發(fā)育的原腸胚形成階段，上皮細(xì)胞通過(guò)EMT轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，這些間充質(zhì)細(xì)胞能夠遷移到特定的位置，參與不同組織和器官的形成。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，能夠突破上皮組織的基底膜，進(jìn)入周圍的間質(zhì)組織，進(jìn)而通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的組織和器官。EMT的發(fā)生是一個(gè)受到多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。TGF-β、Wnt、Notch等信號(hào)通路在EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β信號(hào)通路可以通過(guò)激活下游的Smad蛋白，調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Wnt信號(hào)通路則通過(guò)β-catenin的穩(wěn)定和核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，促進(jìn)EMT過(guò)程。Notch信號(hào)通路與其他信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控EMT的進(jìn)程。Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子也在EMT過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們能夠直接結(jié)合到E-cadherin等上皮標(biāo)志物基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。2.2.2EMT在腫瘤中的作用機(jī)制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面，對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥以及干細(xì)胞特性的獲得等都產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面，EMT賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間連接發(fā)生改變，緊密連接蛋白E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)，使得腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱。這使得腫瘤細(xì)胞能夠脫離原發(fā)腫瘤灶，突破上皮組織的基底膜，進(jìn)入周圍的間質(zhì)組織。腫瘤細(xì)胞的形態(tài)也發(fā)生變化，從上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴笮位蚶w維樣外觀的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，這種形態(tài)改變有助于細(xì)胞的遷移。腫瘤細(xì)胞還會(huì)表達(dá)一些間充質(zhì)細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，如N-cadherin、Vimentin等，這些標(biāo)志物不僅是細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志，還參與了細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程。N-cadherin的表達(dá)增加可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之間的黏附，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供支持。腫瘤細(xì)胞在EMT過(guò)程中還會(huì)分泌一系列蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），這些酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)降解基底膜和周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，穿過(guò)乳腺組織的基底膜，進(jìn)入周圍的間質(zhì)組織，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。研究表明，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性明顯降低。這主要是因?yàn)镋MT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上會(huì)表達(dá)一些藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。EMT還會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的代謝和信號(hào)通路發(fā)生改變，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的作用靶點(diǎn)產(chǎn)生適應(yīng)性變化，進(jìn)一步增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的耐藥性。在非小細(xì)胞肺癌的治療中，部分患者在接受化療后，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，導(dǎo)致對(duì)化療藥物的耐藥性增加，治療效果不佳。此外，EMT與腫瘤干細(xì)胞特性的獲得也存在緊密聯(lián)系。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中具有自我更新和多向分化能力的一小部分細(xì)胞群體，它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞能夠獲得類似于腫瘤干細(xì)胞的特性。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)表達(dá)一些干細(xì)胞標(biāo)志物，如Oct-4、Nanog、Sox2等，這些標(biāo)志物的表達(dá)賦予腫瘤細(xì)胞自我更新和多向分化的能力。EMT還會(huì)激活一些與干細(xì)胞相關(guān)的信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等信號(hào)通路，進(jìn)一步維持和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性。具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)的治療方法具有更強(qiáng)的耐受性，能夠在治療后存活下來(lái)，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞具有更高的腫瘤干細(xì)胞特性，這些細(xì)胞能夠在體內(nèi)形成腫瘤球體，并且具有更強(qiáng)的致瘤能力。2.2.3EMT相關(guān)標(biāo)志物在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程中，細(xì)胞的分子標(biāo)志物發(fā)生明顯改變，這些標(biāo)志物不僅是判斷細(xì)胞是否發(fā)生EMT的重要依據(jù)，還在EMT的調(diào)控和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是最為典型的EMT相關(guān)標(biāo)志物。E-cadherin是一種重要的上皮標(biāo)志物，屬于鈣黏蛋白家族，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞表面。它通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間連接的完整性。在正常上皮組織中，E-cadherin的表達(dá)水平較高，使得上皮細(xì)胞緊密相連，形成穩(wěn)定的上皮結(jié)構(gòu)。在皮膚的表皮層，E-cadherin的高表達(dá)確保了表皮細(xì)胞之間的緊密黏附，從而有效地抵御外界環(huán)境的侵害。然而，在EMT過(guò)程中，E-cadherin的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子的抑制，如Snail、Slug、ZEB1/2等。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致E-cadherin的表達(dá)水平顯著下降。E-cadherin表達(dá)的降低使得上皮細(xì)胞之間的黏附力減弱，細(xì)胞間連接被破壞，上皮細(xì)胞的極性喪失，這是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志之一。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中E-cadherin表達(dá)的下調(diào)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，E-cadherin表達(dá)越低，腫瘤細(xì)胞的侵襲性越強(qiáng)。N-cadherin是間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，主要表達(dá)于神經(jīng)組織、心肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等。在EMT過(guò)程中，隨著E-cadherin表達(dá)的下調(diào)，N-cadherin的表達(dá)則會(huì)顯著上調(diào)。這種現(xiàn)象被稱為“cadherin轉(zhuǎn)換”，即上皮細(xì)胞從表達(dá)E-cadherin轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)N-cadherin。N-cadherin的上調(diào)使得腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。與E-cadherin相比，N-cadherin能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞之間的黏附，并且與一些促進(jìn)細(xì)胞遷移的信號(hào)通路相互作用，從而為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供支持。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中，N-cadherin的高表達(dá)與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。通過(guò)上調(diào)N-cadherin的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞能夠更好地穿透基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Vimentin是一種中間絲蛋白，也是間充質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)志物。在正常上皮細(xì)胞中，Vimentin的表達(dá)水平較低或幾乎不表達(dá)。然而，在EMT過(guò)程中，Vimentin的表達(dá)會(huì)被顯著誘導(dǎo)。Vimentin的表達(dá)增加與細(xì)胞骨架的重組密切相關(guān)，它參與形成細(xì)胞內(nèi)的中間絲網(wǎng)絡(luò)，為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持和穩(wěn)定性。在間充質(zhì)細(xì)胞中，Vimentin的中間絲網(wǎng)絡(luò)能夠幫助細(xì)胞維持其梭形的形態(tài)，并且在細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Vimentin還與一些信號(hào)通路相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Vimentin的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，抑制Vimentin的表達(dá)可以顯著降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。除了上述標(biāo)志物外，EMT過(guò)程中還涉及其他一些上皮標(biāo)志物和間充質(zhì)標(biāo)志物的變化。上皮標(biāo)志物如細(xì)胞角蛋白（Cytokeratins）在EMT過(guò)程中表達(dá)下調(diào)，而間充質(zhì)標(biāo)志物如纖維連接蛋白（Fibronectin）、波形蛋白（Desmin）等表達(dá)上調(diào)。這些標(biāo)志物的變化共同反映了上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，并且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著協(xié)同作用。2.3SETD5基因及蛋白2.3.1SETD5基因結(jié)構(gòu)與定位SETD5基因在人類基因組中占據(jù)著重要的位置，它定位于3號(hào)染色體短臂25.3區(qū)域，即3p25.3。這一染色體定位賦予了SETD5基因獨(dú)特的遺傳背景和調(diào)控環(huán)境，對(duì)其功能的發(fā)揮產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。在染色體的三維結(jié)構(gòu)中，3p25.3區(qū)域與其他基因區(qū)域存在著復(fù)雜的相互作用，這些相互作用參與了基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得SETD5基因能夠在特定的時(shí)空條件下精確地發(fā)揮其生物學(xué)功能。從基因結(jié)構(gòu)上看，SETD5基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，其編碼序列經(jīng)過(guò)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和剪接過(guò)程，最終形成成熟的mRNA，進(jìn)而指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。外顯子是基因中編碼蛋白質(zhì)的部分，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后被拼接在一起，形成完整的開(kāi)放閱讀框。SETD5基因的外顯子序列決定了其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，從而決定了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。而內(nèi)含子則在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起到重要的調(diào)控作用，它們可以影響基因轉(zhuǎn)錄的效率、mRNA的穩(wěn)定性以及剪接方式等。通過(guò)選擇性剪接，SETD5基因可以產(chǎn)生多種不同的轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)可能具有不同的功能或表達(dá)模式，進(jìn)一步增加了SETD5基因功能的復(fù)雜性和多樣性。研究表明，SETD5基因的表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳修飾等。一些轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性地結(jié)合到SETD5基因的啟動(dòng)子區(qū)域，激活或抑制其轉(zhuǎn)錄過(guò)程。某些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞分化、發(fā)育或應(yīng)激反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它們對(duì)SETD5基因表達(dá)的調(diào)控可能與細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能需求密切相關(guān)。表觀遺傳修飾如DNA甲基化、組蛋白修飾等也可以影響SETD5基因的表達(dá)。DNA甲基化通常發(fā)生在基因的啟動(dòng)子區(qū)域，高甲基化狀態(tài)會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而低甲基化狀態(tài)則有利于基因的表達(dá)。組蛋白修飾如甲基化、乙?；?、磷酸化等可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和可及性，從而影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控SETD5基因的表達(dá)。這些調(diào)控機(jī)制使得SETD5基因能夠在不同的細(xì)胞類型和生理病理?xiàng)l件下，精確地調(diào)節(jié)其表達(dá)水平，以滿足細(xì)胞的各種需求。2.3.2SETD5蛋白的結(jié)構(gòu)與功能SETD5蛋白是由SETD5基因編碼的一種重要蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和功能的研究對(duì)于深入理解細(xì)胞的生理和病理過(guò)程具有關(guān)鍵意義。從結(jié)構(gòu)上看，SETD5蛋白包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了SETD5蛋白獨(dú)特的生物學(xué)活性。SETD5蛋白的N端含有一個(gè)保守的SET結(jié)構(gòu)域，這是其最為關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域之一。SET結(jié)構(gòu)域在多種蛋白質(zhì)中廣泛存在，它具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，能夠催化組蛋白H3第4位賴氨酸（H3K4）的甲基化修飾。這種甲基化修飾在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，它可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。在正常細(xì)胞中，SETD5蛋白通過(guò)其SET結(jié)構(gòu)域?qū)μ囟ɑ虻膯?dòng)子區(qū)域進(jìn)行H3K4甲基化修飾，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程。當(dāng)SETD5蛋白的SET結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變或功能異常時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致H3K4甲基化水平的改變，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞功能的紊亂，甚至導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。除了SET結(jié)構(gòu)域，SETD5蛋白還包含其他一些重要的結(jié)構(gòu)域，如富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域（Proline-richdomain）和多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域可以與其他蛋白質(zhì)中的SH3結(jié)構(gòu)域相互作用，參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)節(jié)SETD5蛋白的功能。通過(guò)與不同的蛋白質(zhì)相互作用，SETD5蛋白可以被招募到特定的基因位點(diǎn)，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。SETD5蛋白的多個(gè)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域使其能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑復(fù)合物等相互結(jié)合，協(xié)同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這些相互作用不僅豐富了SETD5蛋白的功能多樣性，還使得它能夠在復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在細(xì)胞功能方面，SETD5蛋白參與了細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程。在細(xì)胞周期調(diào)控中，SETD5蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性，從而控制細(xì)胞的增殖和分裂。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)部信號(hào)的調(diào)控時(shí)，SETD5蛋白能夠通過(guò)其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用，促使細(xì)胞進(jìn)入不同的細(xì)胞周期階段，保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和發(fā)育。在基因表達(dá)調(diào)控方面，SETD5蛋白不僅可以通過(guò)其SET結(jié)構(gòu)域?qū)M蛋白進(jìn)行甲基化修飾，還可以與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用，形成復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄起始、延伸和終止等過(guò)程。SETD5蛋白可以與RNA聚合酶Ⅱ相互作用，影響其在基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)控基因的表達(dá)水平。SETD5蛋白還在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育的早期階段，SETD5蛋白的表達(dá)水平較高，它參與了細(xì)胞的分化和組織器官的形成。在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，SETD5蛋白對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化具有重要的調(diào)控作用。通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，SETD5蛋白可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化，確保神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在心臟發(fā)育過(guò)程中，SETD5蛋白也參與了心肌細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控，對(duì)心臟的正常形態(tài)發(fā)生和功能建立起著關(guān)鍵作用。這些研究結(jié)果表明，SETD5蛋白在胚胎發(fā)育過(guò)程中是不可或缺的，其功能的異?？赡軙?huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常和先天性疾病的發(fā)生。2.3.3SETD5在腫瘤中的研究現(xiàn)狀近年來(lái)，SETD5在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸成為熱點(diǎn)，眾多研究成果揭示了其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要作用。在多種腫瘤中，SETD5的表達(dá)水平和功能狀態(tài)與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SETD5的表達(dá)水平與乳腺癌的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。高表達(dá)的SETD5與乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)有關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，SETD5可以通過(guò)調(diào)控一些關(guān)鍵基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。SETD5還可以與一些乳腺癌相關(guān)的信號(hào)通路相互作用，如PI3K-AKT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。通過(guò)抑制SETD5的表達(dá)或功能，可以顯著降低乳腺癌細(xì)胞的惡性表型，為乳腺癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。在肝癌的研究中，SETD5同樣被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。SETD5在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，且其高表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。機(jī)制研究表明，SETD5可以通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性等途徑，推動(dòng)肝癌的進(jìn)展。SETD5還可以調(diào)控肝癌細(xì)胞的代謝重編程，使其適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的需求，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。針對(duì)SETD5的干預(yù)措施，如使用小分子抑制劑或RNA干擾技術(shù)抑制其表達(dá)，能夠有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，為肝癌的治療提供了新的策略。在結(jié)直腸癌的研究中，SETD5的作用也不容忽視。研究發(fā)現(xiàn)，SETD5在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)異常，其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。SETD5可以通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。SETD5還可以與結(jié)直腸癌中的一些關(guān)鍵信號(hào)通路如Wnt/β-catenin信號(hào)通路相互作用，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。通過(guò)抑制SETD5的表達(dá)或功能，可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提高結(jié)直腸癌患者的生存率。除了上述腫瘤，SETD5在肺癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)具有重要作用。這些研究表明，SETD5在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，其異常表達(dá)或功能失調(diào)可能是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。深入研究SETD5在腫瘤中的作用機(jī)制，不僅有助于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制，還為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。未來(lái)，針對(duì)SETD5的研究有望為腫瘤的精準(zhǔn)治療帶來(lái)新的突破，為腫瘤患者的治療和康復(fù)提供更多的希望。三、SETD5與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)性研究3.1SETD5在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況3.1.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本實(shí)驗(yàn)選取[醫(yī)院名稱]20[開(kāi)始年份]年1月至20[結(jié)束年份]年12月期間，經(jīng)手術(shù)切除并病理確診為非小細(xì)胞肺癌的患者組織樣本[X]例，同時(shí)獲取對(duì)應(yīng)的癌旁組織（距離腫瘤邊緣≥5cm）作為對(duì)照樣本。所有患者在手術(shù)前均未接受過(guò)放療、化療或其他針對(duì)腫瘤的治療，以確保樣本的原始性和可靠性。患者的基本臨床病理資料，如年齡、性別、腫瘤大小、病理分型、分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等，均詳細(xì)記錄在案，以便后續(xù)分析SETD5表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。為檢測(cè)SETD5在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）。首先，使用TRIzol試劑從組織樣本中提取總RNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取后的RNA經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含RNA模板、隨機(jī)引物、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶以及相應(yīng)的緩沖液，反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃加熱15分鐘終止反應(yīng)。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物根據(jù)SETD5基因序列設(shè)計(jì)，上游引物序列為[上游引物具體序列]，下游引物序列為[下游引物具體序列]，內(nèi)參基因選擇GAPDH，其上游引物序列為[GAPDH上游引物序列]，下游引物序列為[GAPDH下游引物序列]。qRT-PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix以及ddH?O，反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，延伸階段收集熒光信號(hào)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算SETD5mRNA的相對(duì)表達(dá)量。為檢測(cè)SETD5在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，采用免疫組化（IHC）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)。免疫組化實(shí)驗(yàn)中，將手術(shù)切除的組織樣本常規(guī)固定、石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片經(jīng)脫蠟、水化處理后，采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。用3%過(guò)氧化氫溶液孵育切片以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，隨后用正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入兔抗人SETD5多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS沖洗切片后，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30分鐘。再加入鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC），37℃孵育30分鐘。最后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)SETD5蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度分為0（無(wú)染色）、1（弱染色）、2（中等染色）、3（強(qiáng)染色）四個(gè)等級(jí)，陽(yáng)性細(xì)胞百分比分為0（<5%）、1（5%-25%）、2（26%-50%）、3（51%-75%）、4（>75%）五個(gè)等級(jí)，將兩者得分相加，總得分0-1分為陰性表達(dá)，2-3分為低表達(dá)，4-6分為高表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，將組織樣本在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液中冰上裂解30分鐘，然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入兔抗人SETD5多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。用化學(xué)發(fā)光底物孵育PVDF膜，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析SETD5蛋白條帶的灰度值，計(jì)算SETD5蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)SETD5在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌組織中SETD5mRNA的相對(duì)表達(dá)量為[X1]±[X2]，顯著高于癌旁組織的[Y1]±[Y2]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.001），這表明SETD5在非小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。免疫組化和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SETD5在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，免疫組化結(jié)果顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中SETD5蛋白高表達(dá)的樣本數(shù)為[高表達(dá)樣本數(shù)]例，占總樣本數(shù)的[高表達(dá)樣本百分比]%，低表達(dá)和陰性表達(dá)的樣本數(shù)分別為[低表達(dá)樣本數(shù)]例和[陰性表達(dá)樣本數(shù)]例；而癌旁組織中SETD5蛋白高表達(dá)的樣本數(shù)僅為[癌旁高表達(dá)樣本數(shù)]例，占癌旁組織樣本數(shù)的[癌旁高表達(dá)樣本百分比]%，低表達(dá)和陰性表達(dá)的樣本數(shù)分別為[癌旁低表達(dá)樣本數(shù)]例和[癌旁陰性表達(dá)樣本數(shù)]例。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，非小細(xì)胞肺癌組織中SETD5蛋白的相對(duì)表達(dá)量為[Z1]±[Z2]，明顯高于癌旁組織的[W1]±[W2]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=[t值]，P<0.001）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SETD5在非小細(xì)胞肺癌組織中的蛋白表達(dá)水平顯著升高。將SETD5的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SETD5的表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及分化程度密切相關(guān)。在TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的非小細(xì)胞肺癌患者中，SETD5高表達(dá)的比例明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[χ2值]，P<0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，SETD5高表達(dá)的比例顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[χ2值]，P<0.05）；低分化的非小細(xì)胞肺癌組織中，SETD5高表達(dá)的比例明顯高于中高分化組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=[χ2值]，P<0.05）。然而，SETD5的表達(dá)水平與患者的年齡、性別以及腫瘤大小等因素之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（P>0.05）。這表明SETD5的高表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，提示SETD5在非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展過(guò)程中可能起到促進(jìn)作用，有望作為評(píng)估非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。3.2SETD5表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系3.2.1臨床病例資料收集為深入探究SETD5表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，本研究收集了[醫(yī)院名稱]20[開(kāi)始年份]年1月至20[結(jié)束年份]年12月期間，經(jīng)手術(shù)治療且病理確診為非小細(xì)胞肺癌的患者臨床病例資料共[X]例。這些患者的基本信息涵蓋年齡、性別、吸煙史等方面。其中，年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡為[平均年齡]歲；男性患者[男性人數(shù)]例，女性患者[女性人數(shù)]例；有吸煙史的患者[吸煙人數(shù)]例，無(wú)吸煙史的患者[非吸煙人數(shù)]例。在治療情況方面，詳細(xì)記錄了患者的手術(shù)方式、病理類型、TNM分期、是否接受輔助化療以及化療方案等信息。手術(shù)方式包括肺葉切除術(shù)[肺葉切除例數(shù)]例、肺段切除術(shù)[肺段切除例數(shù)]例等；病理類型中，腺癌[腺癌例數(shù)]例，鱗癌[鱗癌例數(shù)]例，其他類型[其他類型例數(shù)]例；TNM分期為Ⅰ期的患者[Ⅰ期例數(shù)]例，Ⅱ期[Ⅱ期例數(shù)]例，Ⅲ期[Ⅲ期例數(shù)]例，Ⅳ期[Ⅳ期例數(shù)]例；接受輔助化療的患者[化療例數(shù)]例，化療方案主要包括含鉑雙藥化療方案[具體化療方案及例數(shù)]等。隨訪數(shù)據(jù)的收集至關(guān)重要，隨訪時(shí)間從手術(shù)日期開(kāi)始計(jì)算，截止至20[截止年份]年12月或患者死亡、失訪。隨訪方式包括門(mén)診隨訪、電話隨訪以及查閱患者的住院病歷等。隨訪過(guò)程中，詳細(xì)記錄患者的生存狀態(tài)（存活或死亡）、復(fù)發(fā)情況（復(fù)發(fā)或未復(fù)發(fā)）以及復(fù)發(fā)時(shí)間、轉(zhuǎn)移情況（轉(zhuǎn)移或未轉(zhuǎn)移）以及轉(zhuǎn)移時(shí)間等信息。最終，成功隨訪到[隨訪例數(shù)]例患者，隨訪率為[隨訪率]%，中位隨訪時(shí)間為[中位隨訪時(shí)間]個(gè)月。這些全面且詳細(xì)的臨床病例資料，為后續(xù)分析SETD5表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。3.2.2生存分析方法與結(jié)果運(yùn)用Kaplan-Meier法對(duì)SETD5表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者總生存期（OverallSurvival，OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（Progression-FreeSurvival，PFS）的關(guān)系進(jìn)行分析。根據(jù)SETD5蛋白表達(dá)水平的高低，將患者分為SETD5高表達(dá)組和低表達(dá)組。生存曲線顯示，SETD5高表達(dá)組患者的總生存期明顯短于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rank檢驗(yàn)，P<0.05）。在無(wú)進(jìn)展生存期方面，SETD5高表達(dá)組同樣顯著短于低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rank檢驗(yàn)，P<0.05）。這初步表明，SETD5表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)SETD5可能預(yù)示著患者更差的生存結(jié)局。為進(jìn)一步明確影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，采用Cox回歸分析。將患者的年齡、性別、吸煙史、病理類型、TNM分期、SETD5表達(dá)水平等因素納入多因素分析模型。結(jié)果顯示，TNM分期（HR=[TNM分期的HR值]，95%CI：[TNM分期的置信區(qū)間]，P<0.05）和SETD5表達(dá)水平（HR=[SETD5的HR值]，95%CI：[SETD5的置信區(qū)間]，P<0.05）是影響患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在無(wú)進(jìn)展生存期的多因素分析中，同樣發(fā)現(xiàn)TNM分期（HR=[TNM分期的HR值]，95%CI：[TNM分期的置信區(qū)間]，P<0.05）和SETD5表達(dá)水平（HR=[SETD5的HR值]，95%CI：[SETD5的置信區(qū)間]，P<0.05）是獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這意味著，在考慮了其他可能影響預(yù)后的因素后，SETD5表達(dá)水平仍然是預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)，其高表達(dá)與患者更短的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期顯著相關(guān)，為臨床評(píng)估患者預(yù)后和制定治療策略提供了重要參考依據(jù)。四、SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響研究4.1體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞系選擇與培養(yǎng)本研究選用了兩種具有代表性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，分別為A549細(xì)胞系和H1299細(xì)胞系。A549細(xì)胞系源自人肺腺癌，是一種貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，具有上皮細(xì)胞的形態(tài)特征，在肺癌研究中被廣泛應(yīng)用。H1299細(xì)胞系則來(lái)源于人非小細(xì)胞肺癌，同樣為貼壁細(xì)胞，其在細(xì)胞生物學(xué)特性和基因表達(dá)譜等方面與A549細(xì)胞系存在一定差異，有助于從不同角度探究SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還添加了1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)保持95%的相對(duì)濕度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。每隔2-3天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除細(xì)胞表面的殘留培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將細(xì)胞消化至大部分變圓并開(kāi)始脫落，迅速加入含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其完全脫落后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm條件下離心5-8分鐘，棄去上清液。加入適量的新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免細(xì)胞受到污染。定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，確保細(xì)胞的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。4.1.2SETD5過(guò)表達(dá)與敲低模型構(gòu)建為了深入研究SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，我們采用慢病毒感染的方法構(gòu)建SETD5過(guò)表達(dá)和敲低細(xì)胞模型。在SETD5過(guò)表達(dá)模型構(gòu)建中，首先設(shè)計(jì)并合成SETD5的編碼序列，將其克隆至慢病毒表達(dá)載體pLVX-IRES-ZsGreen1中。通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證插入序列的正確性。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pLVX-SETD5與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)收集含有慢病毒顆粒的上清液，通過(guò)超速離心法濃縮病毒液。將濃縮后的慢病毒液感染A549和H1299細(xì)胞，感染時(shí)加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺（Polybrene）以提高感染效率。感染24小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選出綠色熒光蛋白（ZsGreen1）陽(yáng)性的細(xì)胞，即成功感染慢病毒并過(guò)表達(dá)SETD5的細(xì)胞。使用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SETD5在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效果。在SETD5敲低模型構(gòu)建中，設(shè)計(jì)針對(duì)SETD5基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆至慢病毒載體pLKO.1中。同樣通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。將重組質(zhì)粒pLKO.1-SETD5-shRNA與包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，利用Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后收集慢病毒上清液并濃縮，感染A549和H1299細(xì)胞。感染過(guò)程中加入聚凝胺以促進(jìn)病毒感染。感染24小時(shí)后更換培養(yǎng)基。使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，濃度為1-2μg/mL，篩選時(shí)間為7-10天，以獲得穩(wěn)定敲低SETD5的細(xì)胞株。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SETD5在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，評(píng)估敲低效果。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性對(duì)照，即感染空載體慢病毒的細(xì)胞，以排除慢病毒載體本身對(duì)細(xì)胞的影響。通過(guò)以上方法成功構(gòu)建了SETD5過(guò)表達(dá)和敲低細(xì)胞模型，為后續(xù)研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。4.1.3EMT相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和免疫熒光（Immunofluorescence，IF）等方法檢測(cè)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志物及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，以探究SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。在蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，收集對(duì)照組、SETD5過(guò)表達(dá)組和SETD5敲低組的細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30分鐘。然后在4℃下12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，確保各組蛋白上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。分別加入兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、p-Smad2/3、Smad2/3等抗體（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜后，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。用化學(xué)發(fā)光底物孵育PVDF膜，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影。以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行相應(yīng)處理。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，然后用0.2%TritonX-100通透細(xì)胞10分鐘。用5%BSA封閉細(xì)胞1小時(shí)，以減少非特異性染色。分別加入兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等抗體（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS沖洗細(xì)胞后，加入AlexaFluor488或AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:500稀釋），室溫孵育1小時(shí)。用DAPI染細(xì)胞核5分鐘。將蓋玻片取出，用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析EMT標(biāo)志物的表達(dá)和定位情況。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們能夠準(zhǔn)確檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物及信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化，為揭示SETD5調(diào)控非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制提供有力證據(jù)。4.1.4細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，以評(píng)估SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。Transwell實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，加入Transwell小室的上室，37℃孵育4-6小時(shí)，使Matrigel基質(zhì)膠凝固形成一層人工基底膜。收集對(duì)照組、SETD5過(guò)表達(dá)組和SETD5敲低組的細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定下室膜上的細(xì)胞15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量，以評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至90%-100%融合時(shí)，用無(wú)菌的200μL移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃一道直線劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞。加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在劃痕后0小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)在顯微鏡下拍照記錄劃痕寬度。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率=（0小時(shí)劃痕寬度-24小時(shí)或48小時(shí)劃痕寬度）/0小時(shí)劃痕寬度×100%。通過(guò)以上兩種細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，能夠直觀地觀察到SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，為深入研究SETD5在非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型建立選用4-6周齡的雌性BALB/c裸鼠，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為50%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)采用皮下接種和尾靜脈注射兩種方法構(gòu)建非小細(xì)胞肺癌小鼠模型。皮下接種模型構(gòu)建時(shí)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，即5×10?個(gè)細(xì)胞。注射后密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。尾靜脈注射模型構(gòu)建時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1299細(xì)胞，同樣用胰蛋白酶消化后，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個(gè)/mL。將裸鼠置于固定器中，用75%酒精消毒尾靜脈，使用1mL注射器連接26G針頭，緩慢將0.1mL細(xì)胞懸液（即2×10?個(gè)細(xì)胞）注入尾靜脈。注射過(guò)程中注意避免空氣進(jìn)入血管，同時(shí)觀察小鼠的反應(yīng)，如出現(xiàn)異常情況及時(shí)處理。注射后繼續(xù)飼養(yǎng)小鼠，定期觀察小鼠的體重變化、行為狀態(tài)等。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理和福利準(zhǔn)則，盡量減少小鼠的痛苦。4.2.2SETD5干預(yù)處理將構(gòu)建好皮下接種模型的裸鼠隨機(jī)分為3組，每組[每組小鼠數(shù)量]只，分別為對(duì)照組、SETD5過(guò)表達(dá)組和SETD5敲低組。對(duì)于SETD5過(guò)表達(dá)組，將攜帶SETD5基因的慢病毒（LV-SETD5）用生理鹽水稀釋至合適濃度，通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式，每3天注射1次，每次注射1×10?TU（TransducingUnit），共注射[注射次數(shù)]次。對(duì)照組注射等體積的空載慢病毒（LV-NC）。對(duì)于SETD5敲低組，將攜帶SETD5shRNA的慢病毒（LV-SETD5-shRNA）用生理鹽水稀釋后，同樣通過(guò)瘤內(nèi)注射的方式，每3天注射1次，每次注射1×10?TU，共注射[注射次數(shù)]次。在注射過(guò)程中，嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則，避免感染。對(duì)于尾靜脈注射模型的裸鼠，也隨機(jī)分為3組，每組[每組小鼠數(shù)量]只，分別為對(duì)照組、SETD5過(guò)表達(dá)組和SETD5敲低組。SETD5過(guò)表達(dá)組通過(guò)尾靜脈注射LV-SETD5，劑量為1×10?TU/只，每周注射1次，共注射[注射次數(shù)]次。對(duì)照組注射等體積的LV-NC。SETD5敲低組通過(guò)尾靜脈注射LV-SETD5-shRNA，劑量為1×10?TU/只，每周注射1次，共注射[注射次數(shù)]次。注射時(shí)注意控制注射速度，避免對(duì)小鼠造成損傷。在干預(yù)處理過(guò)程中，密切觀察小鼠的體重、精神狀態(tài)、飲食情況等，記錄小鼠的不良反應(yīng)。4.2.3腫瘤轉(zhuǎn)移情況觀察與檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將小鼠用過(guò)量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，進(jìn)行解剖。首先，觀察小鼠肺部表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和大小。將肺組織取出后，用4%多聚甲醛固定，然后進(jìn)行石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，在顯微鏡下觀察肺組織的病理變化，進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)移灶的位置和形態(tài)。為了更準(zhǔn)確地檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移情況，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)肺組織中腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物。使用兔抗人細(xì)胞角蛋白（CK）抗體，以識(shí)別肺組織中的腫瘤細(xì)胞。染色過(guò)程中，切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉后，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，然后加入生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30分鐘，再加入鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）孵育30分鐘，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和分布情況評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移程度。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織中SETD5、EMT相關(guān)標(biāo)志物（如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等）以及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（如MMP2、MMP9等）的mRNA表達(dá)水平。提取肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)以上多種方法，全面、準(zhǔn)確地觀察和檢測(cè)小鼠體內(nèi)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，為研究SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的體內(nèi)影響提供有力證據(jù)。五、SETD5影響非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制探討5.1基于信號(hào)通路的機(jī)制研究5.1.1相關(guān)信號(hào)通路的篩選與驗(yàn)證通過(guò)廣泛的文獻(xiàn)調(diào)研和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出多條可能參與SETD5調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的信號(hào)通路，其中ERK、PI3K-AKT等信號(hào)通路備受關(guān)注。在文獻(xiàn)研究中發(fā)現(xiàn)，ERK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，在多種腫瘤中，ERK信號(hào)通路的異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在乳腺癌細(xì)胞中，激活ERK信號(hào)通路可上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT。PI3K-AKT信號(hào)通路同樣在細(xì)胞的生存、增殖、代謝和遷移等過(guò)程中扮演重要角色。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K-AKT信號(hào)通路的激活可通過(guò)多種途徑促進(jìn)EMT，如調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性、影響細(xì)胞骨架的重組等。在肝癌細(xì)胞中，PI3K-AKT信號(hào)通路的激活可通過(guò)磷酸化Smad2/3，促進(jìn)TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程。為了驗(yàn)證這些信號(hào)通路是否參與SETD5對(duì)非小細(xì)胞肺癌EMT的調(diào)控，我們進(jìn)行了一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。首先，利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)在SETD5過(guò)表達(dá)和敲低的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SETD5過(guò)表達(dá)組中ERK和AKT的磷酸化水平顯著升高，而在SETD5敲低組中，ERK和AKT的磷酸化水平明顯降低。這初步表明，SETD5可能通過(guò)調(diào)控ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路來(lái)影響非小細(xì)胞肺癌的EMT過(guò)程。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè)，我們使用了針對(duì)ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路的特異性抑制劑，分別處理SETD5過(guò)表達(dá)和敲低的細(xì)胞，觀察細(xì)胞的EMT相關(guān)表型變化。當(dāng)使用ERK抑制劑U0126處理SETD5過(guò)表達(dá)細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下調(diào)。同樣，使用PI3K抑制劑LY294002處理SETD5過(guò)表達(dá)細(xì)胞，也得到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路在SETD5調(diào)控非小細(xì)胞肺癌EMT過(guò)程中的重要作用。5.1.2信號(hào)通路關(guān)鍵分子檢測(cè)運(yùn)用Westernblot等方法對(duì)ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵分子進(jìn)行檢測(cè)，以深入探究SETD5調(diào)控非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。在ERK信號(hào)通路中，我們重點(diǎn)檢測(cè)了ERK1/2的磷酸化水平和總蛋白表達(dá)量。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要成員，其磷酸化是ERK信號(hào)通路激活的關(guān)鍵標(biāo)志。在細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，上游激酶Raf被激活，進(jìn)而磷酸化并激活MEK1/2，MEK1/2再磷酸化ERK1/2，使其從無(wú)活性的單體形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘亩垠w形式，激活的ERK1/2可以磷酸化下游的多種底物，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。我們收集了對(duì)照組、SETD5過(guò)表達(dá)組和SETD5敲低組的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，提取總蛋白，通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SETD5過(guò)表達(dá)組中p-ERK1/2（磷酸化的ERK1/2）的蛋白條帶明顯增強(qiáng)，而總ERK1/2的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。這表明SETD5過(guò)表達(dá)促進(jìn)了ERK1/2的磷酸化，從而激活了ERK信號(hào)通路。相反，在SETD5敲低組中，p-ERK1/2的蛋白條帶顯著減弱，說(shuō)明SETD5敲低抑制了ERK1/2的磷酸化，導(dǎo)致ERK信號(hào)通路失活。對(duì)于PI3K-AKT信號(hào)通路，我們檢測(cè)了AKT的磷酸化水平和總蛋白表達(dá)量。AKT是PI3K-AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，在細(xì)胞的生存、增殖、代謝和遷移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子、胰島素等刺激時(shí)，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募AKT到細(xì)胞膜上，并在PDK1和mTORC2等激酶的作用下，使AKT的Thr308和Ser473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)KT。激活的AKT可以磷酸化下游的多種底物，如GSK-3β、mTOR、BAD等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SETD5過(guò)表達(dá)組中p-AKT（磷酸化的AKT）的蛋白條帶明顯增強(qiáng)，而總AKT的蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。這表明SETD5過(guò)表達(dá)促進(jìn)了AKT的磷酸化，激活了PI3K-AKT信號(hào)通路。在SETD5敲低組中，p-AKT的蛋白條帶顯著減弱，說(shuō)明SETD5敲低抑制了AKT的磷酸化，導(dǎo)致PI3K-AKT信號(hào)通路失活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果的可靠性，我們還進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)，觀察ERK1/2和AKT在細(xì)胞內(nèi)的定位和磷酸化情況。免疫熒光結(jié)果與Westernblot結(jié)果一致，在SETD5過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，p-ERK1/2和p-AKT在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而在SETD5敲低細(xì)胞中，p-ERK1/2和p-AKT的熒光強(qiáng)度顯著減弱。這些結(jié)果表明，SETD5通過(guò)調(diào)控ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平，影響信號(hào)通路的激活狀態(tài)，進(jìn)而參與非小細(xì)胞肺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控。5.1.3信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)利用抑制劑阻斷ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路，深入觀察對(duì)SETD5調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。對(duì)于ERK信號(hào)通路，選用特異性抑制劑U0126進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)。U0126是一種選擇性的MEK1/2抑制劑，能夠特異性地抑制MEK1/2的活性，從而阻斷ERK信號(hào)通路的傳導(dǎo)。將SETD5過(guò)表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞分為兩組，一組加入U(xiǎn)0126處理，另一組作為對(duì)照組加入等量的溶劑處理。處理24小時(shí)后，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示，加入U(xiǎn)0126處理的細(xì)胞穿過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯少于對(duì)照組，表明阻斷ERK信號(hào)通路顯著抑制了SETD5過(guò)表達(dá)細(xì)胞的侵襲能力。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，發(fā)現(xiàn)加入U(xiǎn)0126處理的細(xì)胞劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明阻斷ERK信號(hào)通路也顯著抑制了SETD5過(guò)表達(dá)細(xì)胞的遷移能力。在蛋白水平上，使用Western