試驗一顯微鏡的使用及微生物大小測定的措施

一、試驗目的

1、學習并掌握油鏡的原理和使用措施。

2、復習一般光學顯微鏡的構造、各部分的功能和使用措施。

3、學習并掌握用測微尺測定微生物大小的措施。

4、增強微生物細胞大小的感性認識。

二、基本原理

現代一般光學顯微鏡運用目鏡和物鏡兩組透鏡系統來放大成像，它們由機械裝置

和光學系統兩大部分構成。物鏡的性能最為關鍵，它直接影響著顯微鏡的辨別率。其

中油鏡的放大倍數最大，對微生物學最為重要。

微生物細胞的大小是微生物基本的形態特性,也是分類鑒定的根據之一。'微生物

大小的測定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的潮量工具一測微尺，包括目鏡測微尺和

鏡臺測微尺。其中鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞大小，而是用于校正目鏡測微尺

每格的相對長度。目鏡測微尺每小格所代表的實際長度因顯微鏡的不一樣放大倍數而

異，因此用目鏡測微尺測量微生物大小時，必須先用鏡臺測微尺進行校正，以求出該

顯微鏡在一定放大倍數下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度，然后根據微生物細

胞相稱于目鏡測微格數，即可計算出細胞的實際大小。

三、試驗器材及藥物

大腸桿菌、金黃葡萄球菌、放線菌、曲霉等微生物染色標本；

香柏油，二甲苯，目鏡測微尺，鏡臺測微尺，顯微鏡，擦鏡紙等。

四、操作環節與措施

（一）顯微鏡的使用（參見P17）

1、觀測前的準備（婚）

2、顯微觀測

一般地，進行顯微觀測時應遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀測程序，由于低

倍鏡視野相對大，易發現目的及確定檢查的位置。

1）低倍鏡觀測

2）高倍鏡觀測

3）油鏡觀測

（二）微生物大小的測定

1、裝目鏡測微尺（由教師操作并演示）

2、校正目鏡測微尺

1）放鏡臺測微尺將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。

2）校正先用低倍鏡觀測，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央，調整焦距，

當清晰地看到鏡臺測微的刻度后，轉動目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。

運用移動器移動鏡臺測微尺，使兩尺在某一區域內兩線完全重疊，然后數出兩重疊線

之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數。

用同樣的措施換成高恬鏡和油鏡進行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡卜:兩重疊

線之間兩尺分別所占的格數。

3）計算根據下列公式可計算出在不一樣放大倍數下，目鏡測微尺每格所代表的長

度

兩重疊線間鏡臺測微尺格數義10

目鏡測微尺每格長度二--------------------------------

兩重疊線間目鏡測微尺格數

3、菌體大小測定

取下鏡臺測微尺，換上細菌染色制片，先用低倍鏡和高倍鏡找到標本后，換油鏡

測定金黃葡萄球菌的直徑和大腸桿菌的寬度和長度各占目鏡測微尺的格數，最終再乘

上該放大倍數下目鏡測微尺每格所代表的長度，即為該菌的實際大小。

4、測量完畢取出目鏡測微尺后，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測

微尺分別用擦鏡紙擦拭潔凈，放回盒內保留。

五、原始數據記錄與數據處理

1、原始數據記錄：包括微生物形態觀測和微生物個體的大小測定兩部分。

每位同學觀測3種微生物染色標本,其中大腸桿菌和金黃葡萄球菌染色標本必

看,其他一種在青霉、曲霉、放線菌和酵母菌中任意選擇。

每位同學均測定大腸桿菌和金黃葡萄球菌2種染色標本中的微生物個體大小。

記錄你所選擇的哪3種微生物染色標本進行形態觀測的和大小測定的。

2、數據處理：

1）形態觀測：要按從搜物鏡一低倍鏡一高倍鏡一油鏡的次序畫圖描述（注意比例）

觀測到的微生物群體或個體形態。

2）大小測定:

A、將目鏡測微尺校正成果埴入下表

接物鏡接物鏡倍數目鏡測微尺格數鏡臺測微尺格數目鏡測微尺每格代表的長度ium

低倍鏡10X

高倍鏡40X

油鏡100X

接目鏡放大倍數:

B、將各菌測定成果填入下表（單位：/Um）

寬長

微生物目鏡測微尺每格菌體大小

目鏡測微目鏡測微

名稱代表的長度/um寬度/um長度/um范圍/um

尺格數尺格數

大腸桿

菌

金黃色葡萄球菌

六、思索題

1、用油鏡觀測時應注意哪些問題？在我玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作

用？

2、影響顯微鏡辨別率的原因有哪些？

3、為何要換不一樣放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測微

尺進行校正？

4、在不變化目鏡和目鏡測微尺，而改用不一樣放大倍數的物鏡來測定同一微生物

的大小時，其測定的成果與否相似？為何？

試驗二顯微鏡直接計數法

一、目的規定

1、明確血細胞計數的原理。

2、掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的措施。

二、基本原理

顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種尤其的具有確定面積和容

積的載玻片上（又稱訂菌器），其長處是直觀、迅速、操作簡樸。目前國內外常用的

計菌器有:血細胞計數板、Peteroff-Hauser計菌器及Hawksley計菌器等。運用血細

胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數措施。此法是將單細胞微生物

的懸液或泡子懸液，注入血球計數板載玻片與蓋玻片之間的計數室中。在顯微鏡下進

行計數的，由于加蓋蓋玻片之后的血球計數板的計數室的容積是一定的（O.lmn?,萬

分之一毫升），因此可根據在顯微鏡下觀測到的微生物數目來計算單位體積內的微生

物總數目，包括死菌和活菌。

三、試驗器材

1、菌種：釀酒酵母菌懸液

2、儀器或其他用品：血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。

四、操作環節

1、菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度合適的菌懸液。

2、鏡檢計數室

在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進

行計數。

3、加樣品

將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母

懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用進入計數室，一般計數室

均能充斥菌液。

取樣時要小心搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生。

4、顯微鏡計數

加樣后靜止5min,然后將血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計

數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數。

調整顯微鏡光線的強弱合適。一般地,在使用低倍物鏡時,應盡量調弱光線,使

視野變暗;使用高倍物鏡時,再將光線調亮些,但也應盡量保證能看清視野中計數板

上的縱、橫格線。

在計數前若發現菌液太濃或太稀，則需重新調整稀釋度后再計數，一般樣品稀釋

度規定每小格內約有5?10個菌體為宜。每個計數室選5個中格（可選4個角和中央

的一種中格）中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。如

遇酵母出芽，芽體大小到達母細胞的二分之一時，即作為兩個菌體計數。計數一種樣

品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣品的含菌量。

5、清洗血細胞計數板

使用完畢后，將血細胞計數板在水龍頭上用水沖洗潔凈，切勿用硬物洗刷，洗完

后自行涼干或用吹風機吹干。鏡檢，觀測每小格內與否有殘留菌體后其他沉淀物。若

不潔凈，則必須反復洗滌至潔凈為止。

五、原始數據記錄與數據處理

1、原始數據記錄；

每個班用同一濃度的酵母菌濃懸液，使用時由同學根據需要自行稀釋，并確定稀

釋倍數B值。

每個同學計二個室(即1個計數板)，每個室選4個角和中央的一種中格這5個

中格中的菌體進行計數，讀出每個中格的16個小格中的菌體數(5-10),并將原始

數據記錄下來。

2、數據處理：

將成果記錄于下表中。A表達五個中方格中的總菌數；B表達菌液稀釋倍數。

各中格中菌數二室

AB菌數/ml

12345平均值

第一室

第二室

每組同學可將各自測定的試驗成果并寫在一種表格中,最終成果則為四個室的平

均值。只需計算一次,不要分別計算二個室的平均值后再求平均值。

六、思索題

根據你的體會，闡明用血細胞計數板計數的誤差重要來自哪些方面？應怎樣盡量

減少誤差，力爭精確？

試驗三微生物學試驗室常用器皿的清洗、包裝與干熱滅菌

一、試驗目的

1、理解微生物學試驗室常用的器皿和工具的種類、規定和應用。

2、掌握微生物試驗室常用的玻璃器皿的清洗及包裝措施。

3、理解干熱滅菌的原理和應用范圍。

4、掌握干熱滅菌的操作技術。

二、基本原理

微生物學試驗所用的器皿，人多要進行消毒、滅菌和用來培養微生物，因此對

其質量、洗滌和包裝措施均有一定的規定。玻璃器皿的形狀和包裝措施規定能防止污

染雜菌為準；玻璃器皿的洗滌措施根據試驗目的、器皿的種類、所盛的物品、洗滌劑

的類別和沾污程度等的不一樣而有所不一樣。清洗后的玻璃器皿、經包裝后即可進行

干熱滅菌。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種（P59）。火焰燒灼滅菌合用于載

玻片、試管口、玻棒、接種工具和金屬用品如鎰子等的滅菌。一般所說的干熱滅菌是

在電烘箱內運用高溫干燥空氣使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而到達滅菌的目的。

而細胞內的蛋白質凝固性與其自身的含水量有關,在菌體受熱時,當環境和細胞內含

水量越大,則蛋白質凝固變越快,反之反之。與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高

（160-170℃）,時間長（l-2h）.但干熱滅菌溫度不能超過180℃,否則，包器皿的

紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。此法合用于玻璃器皿如吸管和培養皿等的滅菌。

培養基、橡膠制品、塑料制品、衣物等不能用干熱滅菌。

三、試驗器材

微生物試驗室常用的器皿、接種工具、電熱鼓風干燥箱等

四、操作環節

1、微生物試驗室常用的器皿簡介（P2-6）

試管、吸管、培養皿、三角燒瓶、載玻片、蓋玻片、雙層瓶、滴瓶、接種工具

等。

2、微生物試驗室常用的器皿清洗措施（P6）

1）新玻璃器皿的洗滌措施（P6）；

2）使用過的玻璃器皿的洗滌措施（P6）o

3、空玻璃器皿的包裝（P7-8）

1）培養皿的包裝；

2）吸管的包裝；

3）試管利三角燒瓶的包裝

注意：做棉塞的措施（P53-54）

4、包裝過的玻璃器皿的干熱滅菌措施（P62-63）

裝入待滅菌物品；升溫；恒溫；降溫；開箱取物；無菌檢查。

五、原始數據記錄與數據處理

1、原始數據記錄

領用了哪些玻璃器皿、清洗了哪些玻璃器皿、包裝了哪些玻璃器皿。

2、數據處理

清洗效果、老師評價；包裝效果、老師評價；干熱滅菌條件及成果。

六、思索題（P63）

1、為何在吸管的包裝時要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？

2、在干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題，為何？

3、為何干熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度高，時間長？

試驗四培養基的制備及高壓蒸汽滅菌

一、試驗目的

1、明確培養基配制原理

2、通過對基礎培養基的配制，掌握配制培養基的一般措施和環節。

3、理解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍

4、學習高壓蒸汽滅菌的操作措施

二、基本原理

牛肉膏蛋白陳培養基是一種應用最廣泛和最一般的細菌基礎培養基，有時又稱

為一般培養基。其配方為：牛肉膏3g,蛋白陳10g,NaCl5g,水1000ml,pH

7.4?7.6。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素,蛋白陳重要提供氮

源,而NaCl提供無機鹽。在配制固體培養基時還要加入一定量的瓊脂作凝固劑。瓊

脂在常用濃度下96℃時溶化,一般實際應用時在沸水浴中或下面墊以石棉網煮沸溶

化,以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時凝固,一般不被微生物分解運用。

任何一種培養基，一經制成就應及時徹底滅菌，以備培養微生物使用，一般培

養基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌法。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一種密閉的加

壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸氣急劇地將鍋

內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于蒸汽不能逸出，

滅菌鍋內的壓力增長，使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變

性而到達滅菌的目的。

三、試驗器材

牛肉膏,蛋白陳,NaCl,瓊脂；Imol/LNaOH,Imol/LHCI;

試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH

試紙(pH5.5?9.0)培養基分裝器，棉花，紗布，棉繩，牛皮紙，報紙，記號筆，試管

架，剪刀等。

四、操作環節

1、稱量

按培養基配方比例依次精確地稱取牛肉膏、蛋白月東、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常

用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。蛋白膝很易吸

潮，在稱取時動作要迅速。稱藥物用的牛角匙不要混用，稱完藥物應及時蓋緊瓶蓋。

2、溶化

在上述燒杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻后在石棉網上加熱溶解。

將稱好的瓊脂放入已溶化的藥物中，再加熱溶化，且不停攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯

破裂。最終補足水分到所需的總體積。

3、調pH值

在未調前，先用精密pH試紙測量培養基的原始pH值，如偏酸加適量NaOH,偏堿

加適量HC1,直至到達規定。注意pH值不要調過頭，以免回調而影響培養基內各離

子的濃度。

4、分裝

按規定可將配制的培養基分裝入試管內或二角瓶內。

5、加塞

在試管口或三角燒瓶=1塞上棉塞，以制止外界微生物進入培養基內而導致污染，

并保證有良好的通氣性。

6、包扎

加塞后，將所有試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙或二層報紙，以防

止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。注明培養基名稱、組別、配制日

期。

7、滅菌

（1）加水：打開滅菌鍋蓋，取出內桶，再向外層鍋內加入適量的水，使水位與三

角擱架相平為宜。

（2）裝入待滅菌物品：放回滅菌桶，并裝入上述培養基，注意不要裝得太緊，以

免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。關閉滅菌鍋蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺

旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。

（3）排氣：打開排氣口（放氣閥）。用電加熱，待水煮沸后排除鍋內的冷空氣，

當有大量蒸汽排出時，維持5分鐘，使鍋內冷空氣完全排凈，關上排氣閥。

（4）升壓、保壓和降壓：關閉排所閥后，鍋內壓力開始上升。當壓力升到所需壓

力（一般培養基和器皿滅菌控制在121C20分鐘）時，控制熱源，維持壓力到所需時

間后，停止加熱，待壓力降至靠近“0"時，打開排氣閥排氣。注意不能過急地排氣，

否則會由于鍋內壓力忽然下降而導致鍋內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口

或試管口，和使棉塞沾染培養基而發生污染。

（5）無菌檢查：將滅菌的培養基放入37℃的溫室中培養24?48小時，經檢查無菌

生長，可保留備用。

五、原始數據記錄與數據處理

1、原始數據記錄

記錄本試驗配制培養基的名稱、配方及數量。

記錄多種不一樣物品所用的滅菌措施及滅菌條件（溫度、壓力等）。

2、數據處理

記錄無菌檢查成果。

六、思索題

1、培養微生物的培養基應具有哪些條件？為何？

2、在配制培養基的操作過程中應注意些什么問即？

3、培養基配制完后，為何要及時滅菌？若不能及時滅菌，應怎樣處理？

4、高壓蒸汽滅菌中為何要把冷空氣排凈，為何在滅菌后不能驟然迅速降壓？

試驗五微生物的無菌接種技術及培養特性

一、試驗目的

1、學習掌握微生物的幾種接種技術。

2、學習掌握倒平板的措施。

3、建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環節。

4、理解不一樣的微生物在斜面上平板上的生長特性。

二、基本原理

將微生物的培養物或具有微生物的樣品移植到培養基上的操作技術稱為接種。

接種是微生物試驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。無論微生物的分離、培

養、純化或鑒定經及有關微生物的形態觀測及生理研究都必須進行接種。接種的關鍵

是要嚴格的進行無菌操作，如操作不慎引起污染，則試驗成果就不可靠。影響下一步

工作的進行。

微生物的培養特性是指微生物在固體、半固體和液體培養基中生長后所體現出的

群體生長特性。不一樣的微生物有其固有的培養特性，這些特性可以作為不一樣種類

微生物的鑒別特性之一，并能為識別純培養與否被污染作為參照。理解它們的培養特

性、掌握其生長規律對識別、控制和運用微生物具有重要價值。

固體培養基又分平板和斜面兩種形式。在平板上重要觀測菌落表面構造、形態及

邊緣狀況（如P75圖C）斜面上重要觀測菌苔的形態。

三、試驗器材

1、菌種和培養基

菌種：大腸桿菌和金黃葡萄球菌平板培養物

培養基：牛肉膏蛋白腺培養基（已滅菌）

2、儀器或其他用品

酒精燈（芯）、火柴、標簽紙、工業乙醇、無菌培養皿、接種環（針）、記號

筆、微波爐或加熱裝置（電爐、石棉網和升降臺）、生化培養箱。

四、操作環節

1、寫標簽（Pio）

任何一種試驗，在動手操作前均需首先將器皿（培養皿或試管）用記號筆做上記

號，寫上班級、姓名、日期、樣品類別及來源，字盡量小些。寫在皿底的一邊，不要

寫在當中，以免影響觀測成果。

注意:培養皿的記號一般寫在皿底上。假如寫在皿蓋上,同步觀測兩個以上培

養皿的成果,打開皿蓋時輕易混淆。

2、倒平板（P70）

將牛肉膏蛋白陳瓊脂涪養基用微波爐或電爐加熱融溶，混合均勻后分別倒平板，

每位同學倒2皿。

倒平板的措施：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊用左手將試管賽或瓶

賽輕輕地撥出，試管或瓶口保持對著火焰，然后用右手手撐邊緣或小指夾住管（瓶）

塞（若試管內或三角瓶內的培養基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在于中）。左手拿

培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養基約15mL,加蓋后輕輕搖動培

養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即為平板。

3、接種

1）斜面接種法（參見P76）

2）平板接種法（參見P72）

A、點燃酒精燈。

B、挑菌落：右手持接種針柄，將接種環垂直放在火焰上灼燒滅菌后，用左手

將菌種平板培養基（簡稱菌種板）將皿蓋在火焰附近打開一縫，以殺滅也許玷污

的微生物。將灼燒的滅菌的接種針伸入菌種板內，先接觸無菌苔生長的培養基

上，待冷卻后再從平板上刮取少許菌苔取出。

C、接種：

1）接種平板：左手迅速放下菌種板，在火焰附近迅速拿起待接種的新鮮平板

培養基（簡稱接種板）。右手中接種環不能通過火焰，應在火焰旁迅速插入接種

板。用接種針在平板上自平板底部向上端輕輕地作“之”字劃線：先在平板培養

基的1/2的一邊做第一次劃線，再轉動培養皿，在1/4的一邊做第二次劃線，再轉

動培養皿，在剩余的1/4的一邊做第三次劃線。（或每次作“平行”劃線3或4

條,再轉動培養皿約70度,并將接種環上剩余物燒掉,待冷卻后通過第一次劃

線部分做第二次平等劃線,再用同樣的措施通過第二次劃線部分做第三次平等劃

線和通過第三次劃線部分做第四次平等劃線（見P73圖6）,此法在實際操作上不

易把握,易出現接種不到微生物的也許,故推薦同學統一劃"之〃字形）

接種完畢，接種針應通過火焰抽出平板，非迅速蓋上皿蓋。再重新仔細灼燒

接種針后，放回原處，將接種板放入培養箱中置于37c培養24-48小時。

注意：①為了盡量多地得到單個菌落，在挑菌落時一定要盡量少挑，同步在

劃線時要盡量劃得長些、多些。

②每次轉動培養皿時都要在火焰附近，且不要將接種針拿出培養皿

外。

2）接種斜面：左手迅速放下菌種板，在火焰附近迅速拿起待接種的新鮮斜面

培養基（簡稱接種管）并松開管帽或拔下棉塞，注意保持斜面向上并使管口略向

下傾斜。右手中接種環不能通過火焰，應在火焰旁迅速插入接種管中。用環在斜

面上自試管底部向上端輕輕地劃一直線。接種完畢，接種環應通過火焰抽出管

口，并迅速塞上棉塞（或蓋上管帽）。再重新仔細灼燒接種環后，放回原處。將

接種管放入試管架后置于37℃培養箱中培養。

注意：所劃直線盡量的直，切莫劃幾條線或蛇形，不要將培養基劃破，也不

要使接種環接觸管壁或管口。

3）液體接種法（略講,學生不做）

4）穿刺接種法（略講,學生不做）

4、培養與觀測

將上述已接種的平板和斜面放置于37℃培養箱內培養l-2d后取出對照P75細

菌的培養特性圖進行觀測。

五、原始數據記錄與數據處理

1、原始數據記錄：

所接種的兩種微生物：大腸桿菌和金黃葡萄球菌的平板培養物。

每位學生的接種規定：兩種微生物各接種一皿。

2、數據處理:

平板上

特征描寫

樣品名稱菌落

大小形態干濕高度透明度顏色邊緣

1

人腸桿菌

2

金黃色葡1

萄球菌2

在斜面上

特征描寫

樣品名稱菌苔

形態透明度顏色

1

大腸桿菌

2

金黃色葡1

萄球菌2

六、思索題

1＞用斜面檢測微生物的培養特性接種時，為何不要劃多條線或蛇形，而只要劃一

條直線？

2、接種環（針）接種前后灼燒的目的是什么？為何在接種前一定要將其冷卻？怎樣

判斷燒過的接種環已冷卻？

3、試述怎樣在操作中貫徹無菌操作的原則？

試驗六革蘭氏染色法

一、目的規定

1、學習并初步掌握革蘭氏染色法。

2、理解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。

二、基本原理

革蘭氏染色將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的構造

和構成不一樣決定的，革蘭氏陽性細菌細胞域重要由肽聚糖形成的網狀構造構成、壁

厚、類脂質量低，用乙靜脫色時細胞壁脫水，使肽聚糖層的網狀構造孔徑縮小，透性

減少，從而使結晶紫一一碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染后仍

保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性不一樣，由于細胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高。

因此當脫色處理時，類脂質被乙醇溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫一一碘的復合物

比較輕易被洗脫，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。

革蘭氏染色反應是細菌重要的鑒別特性,為保證染色成果的對的性,采用規范的

染色措施是十分重要的。

三、試驗器材

1、菌種：大腸桿菌約24h營養瓊脂斜面培養物，金黃色葡萄球菌約24h營養瓊

脂斜面培養物。

2、試劑：革蘭氏染色液，95%的乙醇，滅菌蒸儲水（生理鹽水）

3、儀器或其他用品

酒精燈（芯）、火柴、接種環（針）、圓頭鏡子、滴管、記號筆、載玻片、吸水

紙、洗瓶、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、小標簽

四、操作環節

1、制片

（1）涂片

取兩片載玻片，各滴一小滴生理鹽水于玻片中央，用接環以無菌操作分別從枯草

桿菌和大腸桿菌的斜面上挑取少許菌苔于水滴中混勻并涂成薄膜。若用菌懸液涂片，

可用接種環挑取2?3環直接涂于載玻片上。

要用活躍生長期的幼培養物作革蘭氏染色;涂片不適宜過厚,以免脫色不完全導

致假陽性

（2）干燥

室溫下自然干燥

（3）固定

涂面朝上，通過火焰2?3次。

此操作過程稱熱固定，其目的是使細胞質凝固，以固定細胞形態，病使之牢固附

著在載玻片上。

熱固定溫度不適宜過高（以玻片背面不燙手為宜），否則會變化甚至破壞細胞形

態O

2、初染

滴加結晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色1?2min,水洗。

3、媒染

用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約Imin,水洗。

4、脫色

用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇

脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。

革蘭氏染色成果與否對的，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關鍵環節，脫色局限

性，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時間一般約

20?30so

5、復染

用番紅液復染約2min,水洗

6、鏡檢

干燥后，用油鏡觀測。

菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的是革蘭氏陰性菌。

7、混合涂片染色

按上述措施，在同一載被片上，以大腸桿菌和蠟樣芽泡桿菌或大腸桿菌和金黃色

葡萄菌作混合涂片、染色、鏡檢進行比較。

五、原始數據記錄與數據處理

1、原始數據記錄：

進行革蘭氏染色的微生物菌種：大腸桿菌和金黃葡萄球菌的新鮮斜面培養物。

每組同學的染色規定：單一微生物染色和混合微生物染色各一片，在油鏡下觀

測，繪圖并記錄微生物的形態和顏色。

2、數據處理：

根據所觀測到的染色成果，闡明兩種微生物分另J是何種革蘭氏染色反應。

六、思索題

1、你認為哪些環節會影響革蘭氏染色成果的對的性？其中最關鍵的環節是什么？

2、你的染色成果與否對的？假如不對的，請闡明原因。

3、革蘭氏染色時，初染前加碘液嗎？乙醇脫色后復染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭

氏陰性菌應分別是什么顏色？

試驗七用菌落計數法測水中細菌總數

一、目的規定

1、學習水樣的采用措施和水樣細菌總數測定的措施。

2、理解源水的平板菌落計數的原則。

二、基本原理

平板菌落計數法是將待測樣品經合適稀釋后，其中的微生物充足分散成單個細

胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，通過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉

眼可見的菌落，即一種菌落應代表原樣品中的一種單細胞。記錄菌落數，根據其稀釋

倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。（平板菌落計數法雖然操作較繁,成

果需要培養一段時間才能獲得,并且測定成果易受多種原因的影響,不過,由于其最

大的長處是可以獲得活菌的信息,因此廣泛應用于生物制品檢測,食品、飲料和水等

的含菌指數或污染程度的檢測）

本試驗是用源水的平板菌落計數技術測定水中細菌總數。由于水中細菌種類繁

多，它們對營養和其他生長條件的規定差異很大，不也許找到一種培養基在一種條件

下，使水中所有的細菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養基平板上生長出來的菌

落，計算出來的水中細菌總數僅是一種近似值。目前一般是采用一般肉膏蛋白陳瓊脂

培養基。

三、試驗器材

1、水源水（河水），滅菌蒸儲水，工業酒精。

2、培養基牛肉膏蛋白陳瓊脂培養基。

3、儀器或其他用品：酒精燈（芯）、火柴、滅菌的帶玻璃塞的三角瓶，滅菌培

養皿，滅菌吸管,滅菌試管、試管架、生化培養箱等。

四、操作環節

1、水樣的采用

水源為鹽城工學院化工樓西側河水，采用措施：應去距水面10?15cm的深層水

樣，先將滅菌的帶塞三角燒瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉過來，除去玻璃塞，水即

流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出，最佳立即檢查，否則需放入冰箱中

保留。

2、細菌總數測定

①寫標簽：每組同學取6套滅菌培養皿和4個滅菌試管分別寫標簽Q試管為1

組,分別編號為10",-1-培養皿分2組,分別對應編號為I8"1廳,

IQr4）

②水樣的稀釋與接種取4個滅菌試管，分別用10ml的滅菌吸管加入9ml滅菌

水。用1號1ml滅菌吸管取1ml水樣注入第一管9ml滅菌水內、搖勻，再用2號1ml

滅菌吸管自第一管取1ml至下一管滅菌水內，搖勻，并立即取1ml稀釋水加入空的對

應編號的滅菌培養皿中，每一稀釋度做兩個培養皿。如此稀釋到第三管、第四管（稀

釋度分別到0.1、0.01.0.001,0.0001）,并接種到對應編號的滅菌培養皿中，每一稀

釋度做兩個培養皿。

稀釋倍數看水樣渾濁程度而定，以培養后平板的菌落數在30?300個之間的稀釋

度最為合適，若三個稀釋度的菌數均多到無法計算或少到無法計算，則需繼續稀釋或

減少稀釋倍數。一般中等污穢水樣，取0.1、0.01、0.001三個持續稀釋度，污穢嚴重

的取0.01、0.001、0.0001三個持續稀釋度（根據試做試驗,本試驗取01、0.0八

0.001這三個稀釋度為宜）。

③向每個培養皿中各傾約15ml已溶化并冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白陳瓊脂培

養基，立即放在桌子上搖勻。

④凝固后倒置于37℃培養箱中培養48ho

3、菌落計數措施

（1）先計算相似稀釋度的平均菌落數。若其中一種平板有較大片狀菌苔生長時，

則不應采用，而應以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數。若片狀菌苔

的大小不到平板的二分之一，而其他的二分之一菌落分布又很均勻時，則可將此二分

之一的菌落數乘2以代表全平板的菌落數，然后再計算該稀釋度的平均菌落數，

（2）首先選擇平均菌落數在30?300之間的，當只有一種稀釋度的平均菌落數符

合此范圍時，則以該平均菌落數乘其稀釋倍數即為該水樣的細菌總數。

（3）若有兩個稀釋度的平均菌落數均在30?300之間，則兩者菌落總數之比值來

決定。若其比值不不小于2,應采用兩者的平均數；若不小于2,則去其中較小的菌

落總數。

」（4）若所有稀釋度的平均菌落數均不小于300,則按稀釋度最高的平均菌落數乘

以稀釋倍數。

（5）若所有稀釋度的平均菌落數均不不小于30,則按稀釋度最低的平均菌落數乘

以稀釋倍數。

（6）若所有稀釋度的平均菌落數均不在30?300之間，則以最靠近300或30的

平均菌落數乘以稀釋倍數。

不一樣稀釋度的平均菌落數兩個稀釋

例次度菌落數菌落總數（個/ml）備注

0.10.010.001

之比

1136516420—16400或1.6X104兩位后

22760295466.429500或3.0XI。4來的數

32890271604.52710