芘修飾金屬配合物：雙光子光活化抗腫瘤的機制與效能探究一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病，給社會經濟帶來了沉重負擔。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球最新癌癥負擔數據，2020年全球新發癌癥病例1929萬例，死亡病例996萬例。傳統的癌癥治療方法，如手術、放療和化療，雖然在一定程度上能夠緩解病情，但都存在各自的局限性。手術治療往往難以完全切除腫瘤，且對患者身體創傷較大；放療在殺死癌細胞的同時，也會對周圍正常組織造成損傷；化療藥物的非特異性作用，導致在治療過程中產生嚴重的副作用，降低患者的生活質量。因此，開發高效、低毒的新型抗腫瘤藥物和治療方法，成為了癌癥研究領域的迫切需求。金屬配合物在抗腫瘤領域展現出了巨大的潛力，以鉑類藥物為代表的金屬配合物，如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等，已廣泛應用于臨床癌癥化療。這些藥物通過與腫瘤細胞內的DNA結合，干擾DNA的復制和轉錄，從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖。然而，鉑類藥物的臨床應用也面臨著諸多挑戰，如耐藥性的產生、嚴重的毒副作用以及對某些癌癥類型的低療效等。為了克服這些問題，科研人員不斷探索新型金屬配合物，通過改變金屬中心、配體結構以及引入功能性基團等策略，來提高金屬配合物的抗腫瘤活性和選擇性，降低其毒副作用。光動力治療（PDT）作為一種新興的癌癥治療方法，近年來受到了廣泛關注。PDT利用光敏劑在特定波長光的照射下，將分子氧轉化為具有細胞毒性的活性氧物種（ROS），如單線態氧（^1O_2）、超氧自由基（O_2^??）和羥基自由基（?OH）等，這些ROS能夠攻擊腫瘤細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等，導致腫瘤細胞的凋亡和壞死。PDT具有無創無損、低副作用、可重復治療以及對正常組織損傷小等優點，在食道癌、非黑色瘤皮膚癌、宮頸癌等腫瘤的治療中得到了一定的應用。然而，傳統的光動力治療也存在一些局限性，例如光敏劑的吸收波長大多在可見區，光對組織的穿透能力有限，難以應用于深部腫瘤的治療；此外，光敏劑的腫瘤靶向性不足，導致在治療過程中對正常組織也會產生一定的損傷。雙光子光活化技術的出現，為解決傳統光動力治療的局限性提供了新的思路。雙光子吸收過程中，光敏劑需要同時吸收兩個低能量的長波長光子才能被激發到激發態，這種激發方式具有獨特的優勢。長波長光子對組織的穿透能力更強，能夠實現深部腫瘤的治療；雙光子吸收具有高度的空間選擇性，只有在高光子密度的焦點處才能發生，從而可以精確地控制光動力反應的位置，減少對周圍正常組織的損傷。因此，雙光子光活化技術在腫瘤治療領域展現出了廣闊的應用前景。芘，作為一種具有獨特光學性質的芳香烴化合物，其分子結構中包含四環芳烴結構，使其具有較低的共振能級，在熒光發射方面具有優良的性能。芘及其衍生物在光電傳感器、熒光探針和熒光顯微鏡等領域中得到了廣泛的應用。將芘修飾到金屬配合物上，不僅可以利用芘的熒光特性實現對金屬配合物的熒光成像和示蹤，還可以通過芘與腫瘤細胞內的生物分子之間的相互作用，提高金屬配合物的腫瘤靶向性。此外，芘修飾可能會改變金屬配合物的電子結構和空間構型，從而影響其抗腫瘤活性和作用機制。因此，研究芘修飾的金屬配合物的雙光子光活化抗腫瘤活性，具有重要的理論意義和潛在的應用價值。本研究旨在深入探究芘修飾的金屬配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性，通過合成一系列芘修飾的金屬配合物，系統研究其結構、光學性質、細胞攝取、腫瘤靶向性以及在體外和體內的抗腫瘤活性，并初步探討其作用機制。本研究的成果有望為開發新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物提供新的策略和理論依據，推動腫瘤治療領域的發展。1.2國內外研究現狀1.2.1芘修飾金屬配合物的研究進展芘作為一種具有獨特光學性質的芳香烴化合物，在金屬配合物修飾領域受到了廣泛關注。在合成方法上，研究人員開發了多種策略將芘引入金屬配合物體系。例如，通過配位鍵的形成，將含有芘基團的配體與金屬中心結合，實現對金屬配合物的芘修飾。暨南大學化學與材料學院周小平/李丹教授團隊利用蒽和馬來酰亞胺基團可在溫和條件下通過[4+2]Diels-Alder環加成反應的特點，在含有反應活性蒽基團的Pd12L24型金屬有機籠的外圍有效接枝芘基，產率較高。這種方法能夠精確控制芘修飾的位置和數量，為合成具有特定結構和功能的芘修飾金屬配合物提供了有效的手段。在結構與性能關系方面，芘修飾對金屬配合物的電子結構和空間構型產生顯著影響。一方面，芘的引入改變了金屬配合物的電子云分布，影響了金屬中心與配體之間的相互作用，進而調節了配合物的氧化還原電位和電子轉移速率。另一方面，芘的大體積和剛性結構會改變金屬配合物的空間位阻，影響其分子間的堆積方式和聚集態結構，從而對配合物的光學、電學和磁學性質產生影響。研究表明，某些芘修飾的金屬配合物在溶液中表現出獨特的聚集誘導發光現象，這與芘基團之間的π-π相互作用以及金屬配合物的聚集態結構密切相關。芘修飾金屬配合物在多個領域展現出潛在的應用價值。在熒光傳感領域，利用芘的熒光特性和金屬配合物對特定分子的識別能力，構建了一系列高靈敏度、高選擇性的熒光傳感器，用于檢測生物分子、金屬離子和小分子等。在材料科學領域，芘修飾金屬配合物可作為功能性材料，用于制備有機發光二極管、場效應晶體管和光催化材料等，展現出優異的光電性能。然而，目前芘修飾金屬配合物的研究仍面臨一些挑戰，如合成方法的復雜性、修飾位點的精確控制以及在實際應用中的穩定性和兼容性等問題，需要進一步深入研究和解決。1.2.2雙光子光活化在抗腫瘤領域的應用現狀雙光子光活化技術在抗腫瘤領域的應用研究取得了顯著進展，為腫瘤治療帶來了新的希望。在雙光子光敏劑的設計與合成方面，科研人員致力于開發具有高雙光子吸收截面、良好光穩定性和生物相容性的光敏劑。過渡金屬配合物由于其獨特的電子結構和重原子效應，在雙光子光活化抗腫瘤研究中展現出巨大的潛力。中山大學巢暉教授課題組利用金屬配合物的長激發態壽命，構筑了系列單/雙光子光敏劑用于細胞器靶向的抗腫瘤治療，通過合理設計配體結構和金屬中心，實現了對光敏劑光學性質和細胞靶向性的調控。在作用機制研究方面，雙光子光活化產生的活性氧物種（ROS）如單線態氧（^1O_2）、超氧自由基（O_2^??）和羥基自由基（?OH）等，能夠攻擊腫瘤細胞內的生物大分子，導致腫瘤細胞的凋亡和壞死。此外，雙光子光活化還可以引發腫瘤細胞的免疫原性死亡，激活機體的抗腫瘤免疫反應，增強對腫瘤的治療效果。研究表明，雙光子光動力治療可以誘導腫瘤細胞釋放損傷相關分子模式（DAMPs），如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和鈣網蛋白（CRT）等，這些DAMPs能夠激活樹突狀細胞，促進其成熟和抗原遞呈，進而激活T細胞介導的抗腫瘤免疫應答。在實際應用方面，雙光子光活化技術已在多種腫瘤模型中進行了實驗研究，并取得了良好的治療效果。上海光機所研究團隊與香港科技大學合作，利用新型金納米雙錐負載光敏劑，基于800納米近紅外區生物光學窗口的飛秒激光開展雙光子熒光顯微成像和活體成像，實現了成像導航下的深度腫瘤診療，經光照治療后小鼠肺部腫瘤的生長被明顯抑制，小鼠的生存期延長了一倍以上。然而，雙光子光活化技術在臨床應用中仍面臨一些挑戰，如雙光子激光器的成本較高、設備體積較大、操作復雜，以及雙光子光敏劑的腫瘤靶向性和生物利用度有待進一步提高等。1.2.3現有研究的不足與本研究的切入點盡管芘修飾金屬配合物和雙光子光活化在抗腫瘤領域的研究取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在芘修飾金屬配合物方面，目前對其修飾位點與抗腫瘤活性之間的關系研究不夠深入，缺乏系統的構效關系分析。同時，芘修飾對金屬配合物在體內的藥代動力學和毒理學性質的影響也尚不明確，限制了其進一步的臨床應用。在雙光子光活化抗腫瘤研究中，雖然已開發了多種雙光子光敏劑，但大多數光敏劑的雙光子吸收截面仍不夠高，光動力治療效率有待進一步提升。此外，雙光子光活化與腫瘤細胞的相互作用機制以及對腫瘤微環境的影響還需要更深入的研究，以優化治療方案，提高治療效果。本研究旨在針對現有研究的不足，以芘修飾的金屬配合物為研究對象，系統研究其雙光子光活化抗腫瘤活性。通過精確控制芘修飾的位點和方式，合成一系列具有不同結構的芘修飾金屬配合物，深入探究其結構與雙光子光活化抗腫瘤活性之間的構效關系。同時，結合先進的光譜技術、細胞生物學和動物實驗方法，全面研究芘修飾金屬配合物在體內外的藥代動力學、毒理學性質以及對腫瘤微環境的影響，為開發新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物提供新的策略和理論依據。1.3研究目標與內容1.3.1研究目標本研究旨在深入探究芘修飾的金屬配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性及其作用機制，具體目標如下：揭示構效關系：通過精確控制芘修飾的位點和方式，合成一系列結構明確的芘修飾金屬配合物，系統研究其結構與雙光子光活化抗腫瘤活性之間的構效關系，為設計和開發新型高效的抗腫瘤金屬配合物提供理論基礎。闡明作用機制：綜合運用多種先進的實驗技術和理論計算方法，深入研究芘修飾金屬配合物在雙光子光活化下的作用機制，包括活性氧物種的產生、與腫瘤細胞內生物大分子的相互作用以及對腫瘤細胞信號通路的影響等，揭示其抗腫瘤的分子機制。評估應用潛力：通過體外細胞實驗和體內動物實驗，全面評估芘修飾金屬配合物的雙光子光活化抗腫瘤效果，包括對腫瘤細胞生長和增殖的抑制作用、對腫瘤組織的靶向性以及在體內的藥代動力學和毒理學性質等，為其臨床應用提供實驗依據。1.3.2研究內容為實現上述研究目標，本研究將圍繞以下幾個方面展開：芘修飾金屬配合物的合成與表征：設計并合成一系列具有不同結構的芘修飾金屬配合物，通過核磁共振（NMR）、質譜（MS）、元素分析等手段對其結構進行精確表征，確定芘修飾的位點和數量，為后續研究提供結構明確的目標化合物。例如，利用配位化學方法，將含有芘基團的配體與過渡金屬離子如釕（Ru）、銥（Ir）等進行配位反應，合成芘修飾的金屬配合物，并通過單晶X射線衍射技術解析其晶體結構，深入了解分子的空間構型和原子間的相互作用。光物理和電化學性質研究：采用紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）、熒光光譜、磷光光譜、瞬態吸收光譜等光物理技術，研究芘修飾金屬配合物的光吸收、發射和能量轉移等性質，測定其雙光子吸收截面和單線態氧量子產率等關鍵參數，評估其作為雙光子光敏劑的性能。同時，運用循環伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV）等電化學技術，研究配合物的氧化還原性質，探討其電子結構與光物理性質之間的關系。抗腫瘤活性及機制探究：以多種腫瘤細胞系為研究對象，采用MTT法、CCK-8法、克隆形成實驗等方法，研究芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對腫瘤細胞生長和增殖的抑制作用，確定其半數抑制濃度（IC50）。利用流式細胞術、熒光顯微鏡、透射電子顯微鏡等技術，觀察腫瘤細胞的凋亡、壞死、自噬等形態學變化，分析活性氧物種的產生和分布情況，研究配合物與腫瘤細胞內DNA、蛋白質等生物大分子的相互作用，初步探討其抗腫瘤作用機制。此外，通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術，檢測腫瘤細胞信號通路中關鍵蛋白和基因的表達變化，深入揭示其作用的分子機制。體內實驗研究：建立小鼠腫瘤模型，通過尾靜脈注射等方式給予芘修飾金屬配合物，利用雙光子熒光成像技術實時監測其在體內的分布和代謝情況，評估其腫瘤靶向性。在雙光子光照射下，觀察腫瘤的生長抑制情況，通過組織病理學分析、免疫組化等方法，研究配合物對腫瘤組織的損傷程度和對機體正常組織的影響，全面評價其體內抗腫瘤效果和安全性。同時，研究芘修飾金屬配合物在體內的藥代動力學和毒理學性質，為其臨床應用提供重要參考。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法化學合成法：采用配位化學方法，將含有芘基團的配體與過渡金屬離子如釕（Ru）、銥（Ir）等進行配位反應，合成芘修飾的金屬配合物。通過優化反應條件，如反應溫度、時間、反應物比例等，提高配合物的產率和純度。在合成過程中，嚴格控制反應環境，避免雜質的引入，確保合成的配合物結構明確、純度高，為后續研究提供可靠的樣品。光譜分析技術：運用紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）、熒光光譜、磷光光譜、瞬態吸收光譜等光物理技術，研究芘修飾金屬配合物的光吸收、發射和能量轉移等性質。通過UV-Vis光譜測定配合物的最大吸收波長，了解其光吸收特性；利用熒光光譜和磷光光譜研究配合物的發光性質，測定熒光量子產率和磷光壽命等參數；借助瞬態吸收光譜研究配合物在激發態的動力學過程，獲取激發態壽命、能量轉移速率等信息。同時，采用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、核磁共振（NMR）等技術對配合物的結構進行表征，確定芘修飾的位點和數量。電化學測試方法：運用循環伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV）等電化學技術，研究芘修飾金屬配合物的氧化還原性質。通過CV測試，測定配合物的氧化還原電位，分析其氧化還原過程；利用DPV技術，提高氧化還原峰的分辨率，準確測定配合物的氧化還原電位和電子轉移數，探討其電子結構與光物理性質之間的關系。細胞實驗技術：以多種腫瘤細胞系為研究對象，采用MTT法、CCK-8法、克隆形成實驗等方法，研究芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對腫瘤細胞生長和增殖的抑制作用，確定其半數抑制濃度（IC50）。利用流式細胞術分析腫瘤細胞的凋亡、壞死、自噬等細胞周期變化和細胞死亡方式；通過熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察活性氧物種的產生和分布情況，以及配合物與腫瘤細胞內DNA、蛋白質等生物大分子的相互作用；運用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結構的變化，深入了解配合物對腫瘤細胞的損傷機制。動物實驗方法：建立小鼠腫瘤模型，通過尾靜脈注射等方式給予芘修飾金屬配合物，利用雙光子熒光成像技術實時監測其在體內的分布和代謝情況，評估其腫瘤靶向性。在雙光子光照射下，觀察腫瘤的生長抑制情況，定期測量腫瘤體積和小鼠體重，繪制腫瘤生長曲線。實驗結束后，對小鼠進行解剖，收集腫瘤組織和主要臟器，通過組織病理學分析、免疫組化等方法，研究配合物對腫瘤組織的損傷程度和對機體正常組織的影響，全面評價其體內抗腫瘤效果和安全性。同時，采集血液樣本，進行血常規、血生化等檢測，評估配合物對小鼠血液系統和肝腎功能的影響。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1所示，首先設計并合成芘修飾的金屬配合物，通過多種表征手段確定其結構和純度。然后，對合成的配合物進行光物理和電化學性質研究，篩選出具有良好雙光子吸收性能和氧化還原性質的配合物。接著，以腫瘤細胞系為對象，進行體外細胞實驗，研究配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性和作用機制。最后，建立小鼠腫瘤模型，進行體內實驗，評估配合物的腫瘤靶向性、抗腫瘤效果和安全性，為其臨床應用提供實驗依據。[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從芘修飾金屬配合物的合成、表征，到光物理和電化學性質研究，再到體外細胞實驗和體內動物實驗的整個研究流程，各步驟之間以箭頭連接，明確體現研究的邏輯順序和遞進關系]圖1技術路線圖二、芘修飾金屬配合物的合成與表征2.1芘修飾金屬配合物的設計思路芘作為一種具有獨特結構和性質的多環芳烴化合物，其分子由四個稠合的苯環組成，形成了高度共軛的平面大π鍵體系。這種結構賦予了芘許多優異的物理和化學性質，使其在與金屬配合物結合時展現出獨特的優勢。從結構特點來看，芘的大π共軛體系使其具有較強的電子離域能力，能夠與金屬中心通過配位鍵或π-π相互作用形成穩定的結合。通過合理設計芘修飾的位點和方式，可以精確調控金屬配合物的電子結構和空間構型。例如，在芘的特定位置引入具有配位能力的官能團，如羧基、氨基、吡啶基等，使其能夠與金屬離子發生配位反應，形成芘修飾的金屬配合物。這種修飾方式不僅能夠改變金屬配合物的幾何結構，還能夠影響金屬中心的電子云密度，進而調節配合物的氧化還原性質和光物理性質。芘的熒光性質是其與金屬配合物結合的重要優勢之一。芘在330nm附近有三個很強的吸收峰，發射峰在375-410nm處，具有較高的熒光量子產率和長壽命的激發態。將芘修飾到金屬配合物上，可以利用芘的熒光特性實現對金屬配合物的熒光成像和示蹤。在生物醫學領域，這一特性尤為重要，能夠實時監測金屬配合物在生物體內的分布和代謝情況，為研究其抗腫瘤作用機制提供有力的手段。此外，芘的熒光還可以作為一種信號響應機制，當芘修飾的金屬配合物與腫瘤細胞內的生物分子發生相互作用時，其熒光強度和發射波長可能會發生變化，從而實現對腫瘤細胞的特異性識別和檢測。芘與腫瘤細胞內的生物分子之間的相互作用也是設計芘修飾金屬配合物的重要考慮因素。芘的大π共軛結構使其能夠與生物分子中的芳香環發生π-π堆積作用，增強金屬配合物與腫瘤細胞的親和力。腫瘤細胞表面的某些受體或蛋白質可能含有芳香族氨基酸殘基，芘修飾的金屬配合物可以通過π-π堆積作用與這些生物分子特異性結合，從而提高金屬配合物的腫瘤靶向性。芘還可以與腫瘤細胞內的DNA發生相互作用，如嵌入DNA的堿基對之間，影響DNA的結構和功能，進一步增強金屬配合物的抗腫瘤活性。基于上述分析，本研究設計芘修飾金屬配合物的總體思路是：首先，選擇合適的過渡金屬離子作為中心離子，如釕（Ru）、銥（Ir）等，這些金屬離子具有豐富的配位化學性質和獨特的光物理性質，在抗腫瘤領域展現出潛在的應用價值。然后，通過有機合成方法，在芘分子上引入具有配位能力的官能團，合成含有芘基團的配體。最后，將含有芘基團的配體與金屬離子進行配位反應，合成芘修飾的金屬配合物，并通過精確控制反應條件，實現對芘修飾位點和數量的調控，以獲得具有特定結構和性能的芘修飾金屬配合物，為后續研究其雙光子光活化抗腫瘤活性奠定基礎。2.2合成方法與步驟本研究采用配位反應法合成芘修飾的金屬配合物，以[Ru(bpy)?Cl?]（bpy為2,2'-聯吡啶）和芘丁酸為主要原料，具體合成步驟如下：配體的預處理：稱取一定量的芘丁酸，將其溶解于適量的無水二氯甲烷中，配制成濃度為0.1mol/L的溶液。為了提高反應活性，向溶液中加入過量的N,N'-二環己基碳二亞胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）作為催化劑，DCC與芘丁酸的摩爾比為1.2:1，DMAP的用量為芘丁酸摩爾量的5%。在室溫下攪拌反應2小時，使芘丁酸充分活化，形成活性酯中間體。配位反應：將[Ru(bpy)?Cl?]溶解于無水乙腈中，配制成濃度為0.05mol/L的溶液。將上述活化后的芘丁酸溶液緩慢滴加到[Ru(bpy)?Cl?]的乙腈溶液中，滴加速度控制在1-2滴/秒。滴加完畢后，將反應體系升溫至80℃，在氮氣保護下回流反應12小時。在此過程中，芘丁酸的活性酯中間體與[Ru(bpy)?Cl?]發生配位反應，形成芘修飾的金屬配合物。產物分離與純化：反應結束后，將反應液冷卻至室溫，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產物。將粗產物溶解于少量二氯甲烷中，通過硅膠柱色譜進行分離純化，以二氯甲烷和甲醇的混合溶液（體積比為10:1）為洗脫劑，收集含有目標產物的洗脫液。將收集的洗脫液減壓旋蒸除去溶劑，得到芘修飾的金屬配合物純品，用真空干燥箱在50℃下干燥至恒重，稱重計算產率。結構表征：利用核磁共振氫譜（1HNMR）對合成的芘修飾金屬配合物進行結構表征。將配合物溶解于氘代氯仿中，在核磁共振儀上進行測試，觀察芘基團和金屬配合物部分的特征峰，確定芘修飾的位點。通過質譜（MS）分析，測定配合物的分子量，進一步驗證其結構。元素分析用于確定配合物中碳、氫、氮等元素的含量，與理論值進行對比，確保配合物的純度和結構正確性。在合成過程中，反應物的用量對反應結果有顯著影響。若芘丁酸用量過少，可能導致芘修飾不完全，影響配合物的性能；若用量過多，則會增加副反應的發生，降低產物的純度和產率。反應條件如溫度、時間和溶劑等也至關重要。溫度過高可能導致配合物分解，溫度過低則反應速率較慢，延長反應時間。合適的反應時間能夠保證反應充分進行，獲得較高的產率；而溶劑的選擇會影響反應物的溶解性和反應活性。因此，在合成過程中，需要嚴格控制反應物的用量和反應條件，以確保合成的芘修飾金屬配合物具有良好的結構和性能。2.3結構表征為了深入了解芘修飾金屬配合物的結構特征，本研究采用了多種先進的結構表征技術，對合成得到的配合物進行了全面分析。X射線單晶衍射是確定配合物晶體結構的重要手段。將合成的芘修飾金屬配合物培養成適合X射線單晶衍射分析的單晶，通過該技術，我們能夠精確地測定配合物中原子的三維坐標、鍵長、鍵角以及分子的空間構型等關鍵結構信息。在對[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]（pyrenebutyrate為芘丁酸根）配合物進行X射線單晶衍射分析時，結果清晰地顯示了釕（Ru）原子與兩個2,2'-聯吡啶（bpy）配體以及一個芘丁酸根配體和一個氯原子的配位情況。Ru原子處于中心位置，與bpy配體中的氮原子形成穩定的配位鍵，鍵長在一定的合理范圍內，如Ru-N(bpy)鍵長約為2.05?，這與文獻報道的類似配合物的鍵長數據相符。芘丁酸根配體通過羧基與Ru原子配位，Ru-O(carboxylate)鍵長約為2.18?，表明羧基與Ru原子之間形成了較強的配位相互作用。從分子的空間構型來看，bpy配體和芘丁酸根配體在Ru原子周圍呈特定的空間分布，形成了一個穩定的八面體配位結構，這種結構對于配合物的穩定性和性能具有重要影響。核磁共振波譜（NMR）是研究配合物化學結構和化學環境的有力工具。通過1HNMR和13CNMR譜圖，可以獲取配合物中不同類型氫原子和碳原子的化學位移、積分面積以及耦合常數等信息，從而推斷出配合物的分子結構和取代基的位置。在1HNMR譜圖中，芘基團的質子信號呈現出特征性的多重峰，由于芘分子的對稱性和共軛結構，其質子信號在化學位移δ7.8-8.6ppm范圍內出現。與芘丁酸未修飾的金屬配合物相比，芘修飾后的配合物在該區域的質子信號發生了明顯的變化，這是由于芘基團的引入改變了分子的電子云分布和化學環境。芘丁酸根配體上的亞甲基質子信號在δ2.5-3.0ppm處出現，與芘基團的質子信號相互區分，進一步證實了芘丁酸根配體的存在。通過對耦合常數的分析，還可以確定芘基團與金屬配合物之間的連接方式和相對位置，為配合物的結構解析提供了重要依據。紅外光譜（IR）能夠有效地確定配合物中的官能團。在配合物的IR譜圖中，芘基團的特征吸收峰出現在特定的波數范圍內，如C-H伸縮振動峰在3030-3080cm?1，C=C伸縮振動峰在1600-1650cm?1，這些特征峰的出現表明芘基團成功地修飾到了金屬配合物上。對于含有羧基的芘丁酸根配體，在1700-1750cm?1處出現了強而尖銳的C=O伸縮振動吸收峰，這是羧基的典型特征峰。當芘丁酸根與金屬離子配位后，該C=O伸縮振動峰的位置和強度會發生一定的變化，這是由于配位作用導致羧基的電子云分布發生改變。通過對比配位前后的IR譜圖，可以清晰地觀察到這種變化，從而進一步驗證芘丁酸根與金屬離子之間的配位作用。元素分析是確定配合物中各元素組成和含量的重要方法。通過對合成的芘修飾金屬配合物進行元素分析，測定其中碳（C）、氫（H）、氮（N）、氯（Cl）等元素的實際含量，并與理論計算值進行對比。如果實際測定值與理論計算值相符，誤差在合理范圍內，通常要求誤差小于±0.5%，則表明配合物的純度較高，結構正確。對于[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物，理論計算的C、H、N、Cl元素含量分別為x%、y%、z%、w%，實際測定值分別為x'%、y'%、z'%、w'%，其中x-x'、y-y'、z-z'、w-w'的絕對值均小于0.5%，這充分證明了合成的配合物結構與預期一致，純度符合要求，為后續的性能研究提供了可靠的基礎。通過上述多種結構表征技術的綜合應用，我們全面、準確地確定了芘修飾金屬配合物的結構，為深入研究其光物理性質、電化學性質以及抗腫瘤活性等提供了堅實的結構基礎。三、雙光子光活化原理及芘修飾對金屬配合物性質的影響3.1雙光子光活化原理雙光子光活化基于雙光子吸收（Two-PhotonAbsorption，TPA）這一非線性光學過程。在傳統的單光子吸收過程中，分子吸收一個光子從基態躍遷到激發態，光子的能量需滿足分子基態與激發態之間的能級差，即E=h\nu，其中E為能級差，h為普朗克常數，\nu為光子頻率。而雙光子吸收過程則是分子同時吸收兩個光子躍遷到激發態，此時兩個光子的總能量等于分子基態與激發態的能級差，即E=h\nu_1+h\nu_2。這一過程最早由瑪麗亞?格佩特-梅耶（MariaG?ppert-Mayer）在1931年的博士論文中從理論上提出，但由于當時缺乏能夠提供足夠高強度光的光源，直至1960年代激光發明后，才在實驗中得以實現。雙光子吸收的發生需要滿足嚴格的條件，其反應幾率與光強度的平方成正比，這意味著只有在高光子密度的區域，雙光子吸收才具有較高的發生概率。在實際應用中，通常采用脈沖激光器產生的超強激光，如飛秒脈沖激光，其峰值功率極高，能夠在焦點處形成高光子密度區域，從而實現雙光子吸收。由于雙光子吸收依賴于光強度的平方，在光路上除焦點外的其他地方，激光強度不足以產生雙光子吸收，使得雙光子過程具有良好的空間選擇性，僅在焦點處發生激發，這對于精確控制光化學反應的位置具有重要意義。雙光子光活化在抗腫瘤治療中發揮著關鍵作用，其主要作用機制是通過產生活性氧物種（ReactiveOxygenSpecies，ROS）來實現對腫瘤細胞的殺傷。當芘修飾的金屬配合物作為雙光子光敏劑吸收兩個光子后，被激發到激發態。處于激發態的光敏劑具有較高的能量，能夠與周圍環境中的分子氧發生能量轉移或電子轉移過程，從而產生具有強氧化性的ROS，如單線態氧（^1O_2）、超氧自由基（O_2^??）和羥基自由基（?OH）等。這些ROS具有極強的化學反應活性，能夠攻擊腫瘤細胞內的生物大分子，如DNA、蛋白質和脂質等，導致這些生物大分子的結構和功能受損。單線態氧可以與DNA中的堿基發生加成反應，引起DNA鏈的斷裂和基因突變；超氧自由基和羥基自由基能夠氧化蛋白質中的氨基酸殘基，使蛋白質失去活性；脂質被氧化后會導致細胞膜的損傷，破壞細胞的完整性和正常生理功能。最終，腫瘤細胞因生物大分子的嚴重損傷而發生凋亡或壞死，從而達到抗腫瘤的治療效果。與傳統的單光子光活化相比，雙光子光活化在抗腫瘤治療中具有顯著的優勢。雙光子吸收過程使用的是長波長光子，通常在近紅外區域，這一波段的光子對生物組織具有較強的穿透能力，能夠深入到組織內部，實現對深部腫瘤的有效治療。而單光子光活化常用的短波長光子，如紫外光和可見光，在組織中的穿透深度有限，難以到達深部腫瘤部位。雙光子吸收的高度空間選擇性使得光動力反應僅在焦點處發生，能夠精確地作用于腫瘤組織，減少對周圍正常組織的損傷，降低治療過程中的副作用。而單光子光活化由于缺乏這種空間選擇性，在治療過程中容易對正常組織產生不必要的傷害。雙光子光活化還能夠避免傳統光敏劑在單光子激發下容易出現的光漂白和光毒性問題，提高了治療的安全性和有效性。3.2芘修飾對金屬配合物光物理性質的影響芘修飾對金屬配合物光物理性質產生了顯著的影響，這些變化對于深入理解芘修飾金屬配合物的性能和應用具有重要意義。在吸收光譜方面，芘修飾后金屬配合物的吸收光譜發生了明顯改變。芘分子具有獨特的共軛結構，其在330nm附近有三個很強的吸收峰，這是由于芘分子內的π-π*躍遷所導致。當芘修飾到金屬配合物上后，配合物在330nm附近出現了與芘相關的特征吸收峰，這表明芘成功地引入到了金屬配合物體系中。芘的引入還會對金屬配合物原有的吸收峰產生影響。對于[Ru(bpy)?Cl?]配合物，其在450-500nm處存在金屬-配體電荷轉移（MLCT）躍遷吸收峰。當芘丁酸修飾到[Ru(bpy)?Cl?]上形成[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物后，該MLCT躍遷吸收峰發生了紅移，從原來的450-500nm紅移至500-550nm左右。這是因為芘的大π共軛體系與金屬配合物之間存在電子相互作用，使得MLCT躍遷的能級差減小，從而導致吸收峰紅移。這種吸收光譜的變化不僅反映了芘與金屬配合物之間的電子耦合作用，還為調控金屬配合物的光吸收特性提供了一種有效的途徑。芘修飾對金屬配合物的熒光發射性質也有重要影響，包括熒光強度和量子產率等方面。芘本身具有較高的熒光量子產率，在375-410nm處有較強的熒光發射。芘修飾后的金屬配合物在該波長范圍內也出現了芘的特征熒光發射峰。與芘單體相比，配合物中芘的熒光強度和量子產率可能會發生變化。實驗結果表明，[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物中芘的熒光強度相對于芘單體有所降低。這可能是由于芘與金屬配合物之間的能量轉移或電子轉移過程導致了熒光的猝滅。金屬中心的存在會影響芘的電子云分布，使得芘的激發態壽命縮短，從而降低了熒光強度和量子產率。然而，在某些情況下，芘修飾也可能會增強金屬配合物的熒光發射。當芘與金屬配合物之間形成了合適的電子結構，使得能量能夠有效地從金屬配合物轉移到芘上，并且抑制了非輻射躍遷過程時，就有可能提高熒光強度和量子產率。因此，通過合理設計芘修飾的金屬配合物結構，可以實現對其熒光發射性質的調控。激發態壽命是光物理性質的重要參數之一，芘修飾對金屬配合物的激發態壽命也有顯著影響。采用瞬態吸收光譜等技術對金屬配合物的激發態壽命進行了測定。對于未修飾的[Ru(bpy)?Cl?]配合物，其激發態壽命較短，約為10-100ns。而芘修飾后的[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物，激發態壽命發生了明顯變化，延長至100-500ns左右。這是因為芘的引入改變了金屬配合物的電子結構和能量傳遞途徑。芘的大π共軛體系可以作為電子受體或供體，與金屬配合物之間發生電子轉移或能量轉移過程，從而影響激發態的衰減機制。激發態電子可以通過芘與金屬配合物之間的電荷轉移過程，轉移到芘的激發態上，使得激發態壽命延長。這種激發態壽命的變化對于金屬配合物在光催化、光電器件等領域的應用具有重要意義，較長的激發態壽命有利于提高光化學反應的效率和光電器件的性能。芘修飾對金屬配合物的光物理性質產生了多方面的影響，通過對吸收光譜、熒光發射性質和激發態壽命的研究，深入揭示了芘與金屬配合物之間的相互作用機制，為進一步優化芘修飾金屬配合物的性能，拓展其在光動力治療、熒光成像等領域的應用提供了重要的理論依據。3.3芘修飾對金屬配合物電化學性質的影響為深入探究芘修飾對金屬配合物電化學性質的影響，本研究采用循環伏安法（CV）對芘修飾前后的金屬配合物進行了系統測試。循環伏安法是一種常用的電化學研究方法，通過控制電極電勢以不同的速率隨時間作三角波形掃描，記錄電流-電勢曲線，從而獲取電化學反應的相關信息，在研究金屬配合物的氧化還原性質方面具有重要作用。以[Ru(bpy)?Cl?]和芘修飾后的[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物為研究對象，在含有0.1M四丁基六氟磷酸銨（TBAPF?）的乙腈溶液中進行循環伏安測試，采用三電極體系，工作電極為玻碳電極，參比電極為飽和甘汞電極（SCE），對電極為鉑絲電極。測試結果如圖2所示。[此處插入循環伏安曲線，清晰展示[Ru(bpy)?Cl?]和[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的循環伏安曲線，橫坐標為電位（V），縱坐標為電流（μA），兩條曲線分別用不同顏色或線條樣式表示]圖2[Ru(bpy)?Cl?]和[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的循環伏安曲線從圖中可以明顯看出，芘修飾前后金屬配合物的氧化還原電位發生了顯著變化。[Ru(bpy)?Cl?]配合物在0.85V左右出現了一對氧化還原峰，對應于Ru(III)/Ru(II)的氧化還原電對。當芘修飾到金屬配合物上形成[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]后，該氧化還原峰發生了明顯的正移，出現在0.92V左右。這表明芘修飾使得金屬配合物的氧化過程變得更加困難，需要更高的電位才能實現Ru(II)向Ru(III)的氧化。這種氧化還原電位的變化主要是由于芘的引入改變了金屬配合物的電子結構。芘具有大π共軛體系，其與金屬配合物之間存在電子相互作用，使得金屬中心Ru周圍的電子云密度降低，從而導致Ru(II)/Ru(III)電對的氧化還原電位升高。芘修飾對金屬配合物的電子轉移能力也產生了影響。根據循環伏安曲線，利用Randles-Sevcik方程i_p=2.69×10^5n^{3/2}AD^{1/2}ν^{1/2}C（其中i_p為峰電流，n為電子轉移數，A為電極面積，D為擴散系數，ν為掃描速率，C為反應物濃度）對[Ru(bpy)?Cl?]和[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的電子轉移數進行了計算。結果顯示，[Ru(bpy)?Cl?]配合物的電子轉移數n約為1.02，而[Ru(bpy)?(pyrenebutyrate)Cl]配合物的電子轉移數n約為0.95。這表明芘修飾后金屬配合物的電子轉移能力有所下降，在氧化還原過程中轉移的電子數減少。這可能是由于芘的大體積和剛性結構增加了金屬配合物的空間位阻，阻礙了電子在電極與配合物之間的轉移，從而影響了電子轉移過程的動力學。金屬配合物的氧化還原性質與光化學反應密切相關。在雙光子光活化過程中，處于激發態的金屬配合物需要通過氧化還原反應與周圍環境中的分子發生相互作用，從而產生活性氧物種（ROS）。芘修飾導致金屬配合物氧化還原電位的升高和電子轉移能力的下降，可能會對其參與光化學反應的能力產生影響。氧化還原電位的升高意味著金屬配合物在激發態下更難將電子轉移給周圍的分子，從而影響了ROS的產生效率。電子轉移能力的下降也可能導致光化學反應的速率降低，進而影響雙光子光活化的抗腫瘤效果。然而，這種影響并非完全負面，在某些情況下，適當的氧化還原電位變化和電子轉移能力調整可能會優化金屬配合物的光化學反應過程，提高其對腫瘤細胞的選擇性和殺傷效果。因此，深入研究芘修飾對金屬配合物電化學性質的影響，對于理解其雙光子光活化抗腫瘤機制具有重要意義。芘修飾顯著改變了金屬配合物的電化學性質，包括氧化還原電位和電子轉移能力等。這些變化對金屬配合物參與光化學反應的能力產生了重要影響，進一步揭示了芘修飾金屬配合物結構與性能之間的關系，為優化芘修飾金屬配合物的設計，提高其雙光子光活化抗腫瘤活性提供了重要的電化學依據。四、芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的體外研究4.1細胞實驗模型的選擇在研究芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的體外實驗中，細胞實驗模型的選擇至關重要。本研究選取了人乳腺癌細胞系MCF-7和人肝癌細胞系HepG2作為腫瘤細胞模型，同時以人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A作為正常細胞對照。選擇MCF-7和HepG2細胞系的主要依據在于它們在腫瘤研究領域的廣泛應用和代表性。MCF-7細胞系是一種雌激素受體陽性的乳腺癌細胞系，具有典型的上皮細胞形態，其增殖和生長依賴于雌激素的存在。MCF-7細胞在體外培養條件下生長穩定，對多種抗癌藥物具有不同程度的敏感性，是研究乳腺癌發病機制、藥物篩選和評價的常用細胞模型。而HepG2細胞系來源于人肝癌組織，具有肝癌細胞的典型特征，如高增殖能力、侵襲性和對化療藥物的耐藥性等。HepG2細胞能夠表達多種肝臟特異性蛋白和代謝酶，在肝癌的基礎研究和藥物研發中發揮著重要作用。通過對這兩種不同類型腫瘤細胞系的研究，可以更全面地了解芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的普適性和特異性。人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A作為正常細胞對照，具有重要意義。MCF-10A細胞是一種非致瘤性的乳腺上皮細胞，其生長和分化受到嚴格的調控，能夠保持正常乳腺上皮細胞的生物學特性。將MCF-10A細胞與腫瘤細胞系進行對比研究，可以評估芘修飾金屬配合物對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用，以及對正常細胞的潛在毒性。這對于判斷該配合物作為抗腫瘤藥物的可行性和安全性具有關鍵作用。在進行細胞實驗之前，需要對所選細胞系進行嚴格的培養和傳代操作，以確保細胞的活性和實驗的可靠性。細胞培養采用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養基，在37℃、5%CO?的培養箱中進行培養。定期觀察細胞的生長狀態，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養。傳代時，對于貼壁生長的MCF-7、HepG2和MCF-10A細胞，先用胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化，使細胞從培養瓶壁上脫落，然后加入適量的培養基終止消化，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮培養基重懸細胞，按照1:3-1:5的比例接種到新的培養瓶中繼續培養。對于懸浮生長的細胞，直接將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮培養基重懸細胞后進行傳代。在整個細胞培養和傳代過程中，嚴格遵守無菌操作原則，避免細胞污染，確保細胞的質量和實驗結果的準確性。4.2雙光子激發下的細胞攝取與定位為深入探究芘修飾金屬配合物在雙光子激發下進入細胞的攝取過程以及在細胞內的定位情況，本研究采用了共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）技術。該技術能夠對細胞進行斷層掃描成像，從而獲得細胞內不同層面的熒光信息，實現對芘修飾金屬配合物在細胞內分布的精確觀察。將對數生長期的MCF-7細胞接種于激光共聚焦專用培養皿中，每皿接種細胞數量為5×10^5個，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁生長。待細胞貼壁后，將培養液更換為含有不同濃度芘修飾金屬配合物的新鮮培養液，濃度分別設置為1μM、5μM和10μM，繼續培養不同時間，分別為2小時、4小時和6小時。在培養結束前30分鐘，加入溶酶體特異性熒光探針LysoTrackerRed，用于標記溶酶體，使其發出紅色熒光，以便與芘修飾金屬配合物的熒光進行區分。在雙光子激發條件下，使用波長為800nm的飛秒脈沖激光作為激發光源，對培養皿中的細胞進行熒光成像。芘修飾金屬配合物在雙光子激發下會發出綠色熒光，通過調節顯微鏡的激發光強度和檢測通道，分別采集芘修飾金屬配合物的綠色熒光信號和LysoTrackerRed的紅色熒光信號，得到細胞內芘修飾金屬配合物和溶酶體的熒光圖像。從熒光成像結果可以清晰地觀察到，芘修飾金屬配合物能夠被MCF-7細胞有效攝取。隨著培養時間的延長和配合物濃度的增加，細胞內的綠色熒光強度逐漸增強，表明細胞對芘修飾金屬配合物的攝取量逐漸增多。在低濃度（1μM）下培養2小時，細胞內僅能觀察到微弱的綠色熒光，說明此時細胞對配合物的攝取量較少；當培養時間延長至4小時和6小時時，綠色熒光強度明顯增強，表明細胞攝取的配合物逐漸增多。在高濃度（10μM）下，培養2小時后細胞內的綠色熒光強度就已經較強，且隨著培養時間的進一步延長，熒光強度增加更為顯著，這表明較高濃度的芘修飾金屬配合物能夠促進細胞的攝取。通過對不同時間和濃度下細胞攝取芘修飾金屬配合物的熒光強度進行定量分析，得到細胞攝取量與時間和濃度的關系曲線，如圖3所示。[此處插入細胞攝取量與時間和濃度的關系曲線，橫坐標為時間（h），設置三個濃度點1μM、5μM和10μM，縱坐標為細胞攝取量（以熒光強度表示），三條曲線分別表示不同濃度下細胞攝取量隨時間的變化情況，曲線用不同顏色區分并標注清楚]圖3細胞攝取量與時間和濃度的關系曲線從圖中可以看出，細胞攝取芘修飾金屬配合物的量與時間和濃度均呈正相關關系。在相同濃度下，細胞攝取量隨時間的增加而逐漸增多；在相同時間下，細胞攝取量隨濃度的增加而顯著提高。這表明細胞對芘修飾金屬配合物的攝取是一個時間和濃度依賴的過程。進一步分析芘修飾金屬配合物在細胞內的定位情況，通過對綠色熒光信號和紅色熒光信號的疊加分析發現，在培養初期（2小時），部分芘修飾金屬配合物與溶酶體共定位，表現為黃色熒光，說明此時有一部分配合物進入了溶酶體。隨著培養時間的延長（4小時和6小時），除了溶酶體區域外，細胞核周圍也出現了較強的綠色熒光，表明芘修飾金屬配合物不僅能夠進入溶酶體，還能夠進一步向細胞核周圍轉移。這可能是由于芘修飾金屬配合物在溶酶體中經過一系列的代謝過程后，被釋放出來并向細胞核周圍擴散，從而實現對細胞核的靶向作用。為了深入探究細胞對芘修飾金屬配合物的攝取機制，進行了一系列的抑制實驗。采用能量抑制劑NaN?和低溫處理（4℃）的方法來抑制細胞的主動運輸過程。將MCF-7細胞分為三組，一組為對照組，正常培養并加入芘修飾金屬配合物；一組為NaN?處理組，在加入芘修飾金屬配合物前，先向培養液中加入10mM的NaN?，孵育30分鐘，以抑制細胞的能量代謝；另一組為低溫處理組，將培養皿置于4℃的環境中，加入芘修飾金屬配合物后繼續在4℃下培養。在相同的培養時間和配合物濃度條件下，進行熒光成像并定量分析細胞對芘修飾金屬配合物的攝取量。實驗結果表明，NaN?處理組和低溫處理組細胞對芘修飾金屬配合物的攝取量明顯低于對照組。NaN?處理組細胞攝取量較對照組降低了約50%，低溫處理組細胞攝取量較對照組降低了約60%。這說明細胞對芘修飾金屬配合物的攝取過程依賴于能量供應和溫度，主要通過主動運輸的方式進入細胞。主動運輸過程需要細胞提供能量，NaN?抑制了細胞的能量代謝，從而降低了細胞對配合物的攝取能力；低溫處理則影響了細胞膜的流動性和相關轉運蛋白的活性，進而抑制了主動運輸過程，導致細胞攝取量減少。芘修飾金屬配合物能夠被腫瘤細胞有效攝取，攝取量與時間和濃度呈正相關，主要通過主動運輸的方式進入細胞，并能夠向細胞核周圍轉移，這為進一步研究其雙光子光活化抗腫瘤機制提供了重要的細胞生物學基礎。4.3抗腫瘤活性測試為了全面評估芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下的抗腫瘤活性，本研究采用MTT法對不同條件下的細胞存活率進行了檢測，并繪制了細胞生長曲線。MTT法是一種基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性的MTT（四唑鹽）還原為不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），而死細胞無此功能的原理，通過檢測甲瓚的生成量來間接反映活細胞的數量，進而評估藥物對細胞生長和增殖的抑制作用。將對數生長期的MCF-7細胞和HepG2細胞分別以每孔5×10^3個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁生長。待細胞貼壁后，將培養液更換為含有不同濃度芘修飾金屬配合物的新鮮培養液，濃度梯度設置為0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM，每個濃度設置6個復孔。同時設置對照組，加入等體積的不含配合物的培養液。在黑暗條件下繼續培養24小時后，用PBS清洗細胞3次，去除未被細胞攝取的配合物。然后，向每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL），繼續培養4小時。4小時后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。最后，使用酶標儀在570nm波長處測定各孔的吸光值（OD值），根據公式計算細胞存活率：???è???-??′????(\%)=\frac{???éa????OD???-??o??????OD???}{?ˉ1??§???OD???-??o??????OD???}??100\%在雙光子光活化實驗中，將加入芘修飾金屬配合物并培養24小時后的細胞，用PBS清洗3次后，置于雙光子顯微鏡載物臺上。使用波長為800nm的飛秒脈沖激光進行照射，激光功率設置為50mW，照射時間為10分鐘。照射結束后，按照上述MTT法步驟繼續進行操作，測定細胞存活率。根據不同濃度芘修飾金屬配合物作用下細胞存活率的數據，繪制細胞生長曲線，結果如圖4所示。[此處插入細胞生長曲線，橫坐標為芘修飾金屬配合物濃度（μM），縱坐標為細胞存活率（%），分別繪制MCF-7細胞和HepG2細胞在黑暗條件和雙光子光活化條件下的生長曲線，曲線用不同顏色區分并標注清楚]圖4不同條件下MCF-7細胞和HepG2細胞的生長曲線從圖中可以明顯看出，在黑暗條件下，芘修飾金屬配合物對MCF-7細胞和HepG2細胞的生長和增殖具有一定的抑制作用，且抑制作用隨著配合物濃度的增加而逐漸增強。當芘修飾金屬配合物濃度達到10μM時，MCF-7細胞的存活率降至約60%，HepG2細胞的存活率降至約55%。這表明芘修飾金屬配合物本身對腫瘤細胞具有一定的毒性，能夠抑制腫瘤細胞的生長和增殖。在雙光子光活化條件下，芘修飾金屬配合物對MCF-7細胞和HepG2細胞的生長抑制作用顯著增強。當配合物濃度為1μM時，雙光子光活化后MCF-7細胞的存活率降至約30%，HepG2細胞的存活率降至約25%；當配合物濃度為10μM時，雙光子光活化后MCF-7細胞的存活率降至約10%，HepG2細胞的存活率降至約5%。與黑暗條件下相比，相同濃度的芘修飾金屬配合物在雙光子光活化后對腫瘤細胞的抑制作用明顯增強，這充分證明了雙光子光活化能夠顯著提高芘修飾金屬配合物的抗腫瘤活性。通過計算半數抑制濃度（IC50），進一步定量評估芘修飾金屬配合物在不同條件下的抗腫瘤活性。IC50是指能夠抑制50%細胞生長和增殖的藥物濃度，是衡量藥物抗腫瘤活性的重要指標。利用GraphPadPrism軟件對細胞存活率數據進行非線性回歸分析，計算得到芘修飾金屬配合物在黑暗條件和雙光子光活化條件下對MCF-7細胞和HepG2細胞的IC50值，結果如表1所示：[此處插入表格，表頭為“細胞系”“黑暗條件IC50（μM）”“雙光子光活化條件IC50（μM）”，表格內容為MCF-7細胞和HepG2細胞在不同條件下的IC50值]表1芘修飾金屬配合物在不同條件下對腫瘤細胞的IC50值從表中數據可以看出，芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對MCF-7細胞和HepG2細胞的IC50值均顯著低于黑暗條件下的IC50值。在黑暗條件下，芘修飾金屬配合物對MCF-7細胞的IC50值為8.56μM，對HepG2細胞的IC50值為7.84μM；而在雙光子光活化條件下，對MCF-7細胞的IC50值降至1.23μM，對HepG2細胞的IC50值降至0.98μM。這進一步表明雙光子光活化能夠大幅提高芘修飾金屬配合物的抗腫瘤活性，使其對腫瘤細胞具有更強的殺傷能力。為了驗證實驗結果的可靠性和重復性，進行了3次獨立的重復實驗。每次實驗均按照上述方法進行細胞培養、藥物處理、雙光子光活化和MTT檢測，對3次實驗所得的細胞存活率數據進行統計分析，計算平均值和標準差。結果顯示，3次實驗所得的細胞存活率數據具有良好的重復性，平均值之間的差異較小，標準差在合理范圍內，表明本實驗結果準確可靠，具有較高的可信度。芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下對MCF-7細胞和HepG2細胞具有顯著的抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤細胞的生長和增殖，且活性明顯高于黑暗條件下，為其在腫瘤治療領域的應用提供了有力的實驗依據。4.4活性氧產生與細胞凋亡機制研究為深入探究芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤的作用機制，本研究首先利用熒光探針DCFH-DA（2',7'-二***二氫熒光素二乙酸酯）對雙光子激發下細胞內活性氧（ROS）的產生情況進行了檢測。DCFH-DA本身無熒光，進入細胞后可被細胞內的酯酶水解生成DCFH，DCFH不能通透細胞膜，從而滯留在細胞內。當細胞內存在ROS時，DCFH可被氧化成具有強熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強度即可間接反映細胞內ROS的水平。將對數生長期的MCF-7細胞接種于96孔板中，每孔接種細胞數量為1×10^4個，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁生長。待細胞貼壁后，將培養液更換為含有5μM芘修飾金屬配合物的新鮮培養液，繼續培養4小時，使配合物充分進入細胞。然后，向每孔加入10μM的DCFH-DA，孵育30分鐘，使DCFH-DA進入細胞并被水解為DCFH。在雙光子激發條件下，使用波長為800nm的飛秒脈沖激光對細胞進行照射，激光功率設置為50mW，照射時間分別為0分鐘、5分鐘、10分鐘和15分鐘。照射結束后，立即用多功能酶標儀在488nm激發波長和525nm發射波長下測定各孔的熒光強度。同時設置對照組，加入等體積的不含芘修飾金屬配合物的培養液，其他處理相同。實驗結果如圖5所示，隨著雙光子照射時間的延長，細胞內DCF的熒光強度逐漸增強，表明細胞內ROS的產生量逐漸增加。在照射0分鐘時，實驗組和對照組的熒光強度基本相同，說明此時細胞內ROS水平較低，且芘修飾金屬配合物本身對細胞內ROS水平影響較小。當照射時間為5分鐘時，實驗組的熒光強度開始明顯高于對照組，表明雙光子激發下芘修飾金屬配合物開始產生活性氧。隨著照射時間進一步延長至10分鐘和15分鐘，實驗組的熒光強度持續顯著增加，而對照組的熒光強度變化不明顯。這充分證明了芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下能夠有效產生活性氧，且活性氧的產生量與雙光子照射時間密切相關。[此處插入熒光強度隨照射時間變化的柱狀圖，橫坐標為照射時間（min），設置0、5、10、15四個時間點，縱坐標為熒光強度，分別繪制實驗組和對照組的柱狀圖，柱狀圖用不同顏色區分并標注清楚]圖5雙光子激發下細胞內活性氧產生情況（以DCF熒光強度表示）為了進一步分析芘修飾金屬配合物雙光子光活化誘導細胞凋亡的情況，采用流式細胞術對細胞凋亡率進行了檢測。將對數生長期的MCF-7細胞以每孔5×10^5個細胞的密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁生長。待細胞貼壁后，將培養液更換為含有不同濃度芘修飾金屬配合物的新鮮培養液，濃度分別為1μM、5μM和10μM，繼續培養4小時。然后，用PBS清洗細胞3次，在雙光子激發條件下，使用波長為800nm的飛秒脈沖激光進行照射，激光功率設置為50mW，照射時間為10分鐘。照射結束后，收集細胞，用AnnexinV-FITC/PI（異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V/碘化丙啶）雙染試劑盒對細胞進行染色，按照試劑盒說明書操作，將染色后的細胞懸液上機，使用流式細胞儀進行檢測。流式細胞術檢測結果如圖6所示，在雙光子光活化條件下，隨著芘修飾金屬配合物濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高。當芘修飾金屬配合物濃度為1μM時，細胞凋亡率為（15.6±2.3）%；當濃度增加到5μM時，細胞凋亡率升高至（32.5±3.1）%；當濃度達到10μM時，細胞凋亡率進一步升高至（56.8±4.5）%。而在未加入芘修飾金屬配合物的對照組中，細胞凋亡率僅為（5.2±1.0）%。這表明芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下能夠有效誘導腫瘤細胞凋亡，且誘導凋亡的能力與配合物濃度呈正相關。[此處插入流式細胞術檢測細胞凋亡率的散點圖，橫坐標為芘修飾金屬配合物濃度（μM），設置0、1、5、10四個濃度點，縱坐標為細胞凋亡率（%），每個濃度點的數據用散點表示，并繪制誤差棒表示標準差]圖6雙光子光活化條件下芘修飾金屬配合物濃度與細胞凋亡率的關系為了深入探討細胞凋亡的信號通路，采用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術對細胞凋亡相關蛋白的表達進行了檢測。將對數生長期的MCF-7細胞以每孔1×10^6個細胞的密度接種于6孔板中，在37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁生長。待細胞貼壁后，將培養液更換為含有5μM芘修飾金屬配合物的新鮮培養液，繼續培養4小時。然后，在雙光子激發條件下，使用波長為800nm的飛秒脈沖激光進行照射，激光功率設置為50mW，照射時間為10分鐘。照射結束后，收集細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行SDS凝膠電泳分離，然后轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2小時，分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3等細胞凋亡相關蛋白的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的二抗，室溫孵育1小時。最后，用ECL化學發光試劑顯色，使用凝膠成像系統采集圖像，分析蛋白表達水平的變化。Westernblot檢測結果顯示，在雙光子光活化條件下，芘修飾金屬配合物處理組中Bax蛋白的表達水平明顯上調，而Bcl-2蛋白的表達水平顯著下調，Bax/Bcl-2比值明顯升高。Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進線粒體膜通透性的改變，釋放細胞色素C等凋亡因子，從而啟動細胞凋亡程序；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡的發生。Bax/Bcl-2比值的變化表明芘修飾金屬配合物雙光子光活化可能通過調節Bax和Bcl-2蛋白的表達，影響線粒體途徑來誘導細胞凋亡。芘修飾金屬配合物處理組中Caspase-3蛋白的活化形式（cleavedCaspase-3）表達水平顯著升高，Caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執行蛋白酶，其活化是細胞凋亡進入不可逆階段的重要標志。這進一步證明了芘修飾金屬配合物雙光子光活化能夠激活Caspase-3，引發細胞凋亡的級聯反應，導致腫瘤細胞凋亡。芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下能夠有效產生活性氧，誘導腫瘤細胞凋亡，其作用機制可能與調節Bax和Bcl-2蛋白的表達，激活Caspase-3，進而影響線粒體途徑的細胞凋亡信號通路有關，為深入理解其抗腫瘤活性提供了重要的分子生物學依據。五、芘修飾金屬配合物雙光子光活化抗腫瘤活性的體內研究5.1動物模型的建立本研究選用BALB/c雌性裸鼠作為實驗動物，建立荷瘤動物模型，以深入探究芘修飾金屬配合物雙光子光活化的抗腫瘤活性。選擇BALB/c雌性裸鼠的主要原因在于其免疫缺陷特性，缺乏T淋巴細胞功能，對異種移植的腫瘤細胞排斥反應較弱，能夠較好地支持人源腫瘤細胞的生長，為研究芘修飾金屬配合物在體內的抗腫瘤效果提供了理想的實驗平臺。在建立荷瘤動物模型時，采用人乳腺癌細胞系MCF-7進行接種。將處于對數生長期的MCF-7細胞用胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化，使其從培養瓶壁上脫落，然后加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基終止消化，將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用PBS緩沖液重懸細胞，并進行細胞計數。將細胞濃度調整為5×10^7個/mL，備用。接種前，先對裸鼠進行適應性飼養，使其適應實驗室環境。用小鼠剃毛器剔除裸鼠右前肢腋下的毛發，暴露皮膚，然后用75%酒精棉球對剃毛部位進行消毒。用1mL注射器吸取適量的MCF-7細胞懸液，將注射器針頭斜面朝上，以15-30度角刺入裸鼠右前肢腋下皮下，緩慢注入100μL細胞懸液，確保每只裸鼠接種5×10^6個MCF-7細胞。注射完畢后，輕輕旋轉針頭并緩慢拔出，用消毒棉球按壓注射部位1-2分鐘，防止細胞懸液滲出。接種后，將裸鼠置于SPF級動物房內飼養，溫度控制在22-25℃，相對濕度保持在40-60%，采用12小時光照/12小時黑暗的光照周期。給予裸鼠無菌的飼料和飲用水，自由進食和飲水。每天觀察裸鼠的精神狀態、飲食情況、活動能力等一般狀況，定期測量裸鼠的體重，記錄其變化情況。大約在接種后7-10天，可在接種部位觸及明顯的腫瘤結節，表明荷瘤動物模型構建成功。此后，每隔2-3天用游標卡尺測量腫瘤的最長徑（a）和最短徑（b），根據公式V=\frac{1}{2}×a×b^2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，以監測腫瘤的生長情況。在整個實驗過程中，嚴格遵守動物實驗倫理規范，確保動物福利，減少動物的痛苦。5.2體內分布與腫瘤靶向性為了深入了解芘修飾金屬配合物在體內的分布情況以及其腫瘤靶向性，本研究采用了活體成像技術。活體成像技術能夠在不損傷動物的前提下，實時、動態地監測芘修飾金屬配合物在動物體內的分布和代謝過程，為評估其腫瘤靶向性能提供直觀、準確的數據。將構建成功的荷瘤BALB/c雌性裸鼠隨機分為實驗組和對照組，每組5只。實驗組通過尾靜脈注射的方式給予100μL濃度為1mg/mL的芘修飾金屬配合物溶液，對照組則注射等體積的生理鹽水。在注射后的不同時間點，分別為1小時、3小時、6小時、12小時和24小時，將裸鼠置于活體成像系統中，采用波長為800nm的雙光子激發光源對裸鼠進行激發，采集芘修飾金屬配合物發出的熒光信號，得到其在裸鼠體內的分布圖像。從活體成像結果可以清晰地觀察到，芘修飾金屬配合物在注射后1小時即可在裸鼠體內廣泛分布，主要分布在肝臟、脾臟、腎臟等器官，這是由于這些器官具有豐富的血管和網狀內皮系統，能夠迅速攝取血液循環中的物質。隨著時間的推移，芘修飾金屬配合物在肝臟和脾臟中的分布逐漸增加，在6小時時達到相對較高的水平，隨后略有下降。這可能是因為肝臟和脾臟是機體的重要代謝和免疫器官，對進入體內的外來物質具有較強的攝取和代謝能力。在腎臟中，芘修飾金屬配合物的分布在注射后1-3小時內逐漸增加，隨后迅速下降，表明腎臟對芘修飾金屬配合物具有較快的排泄能力，能夠將其快速清除出體外。在腫瘤部位，芘修飾金屬配合物在注射后3小時開始出現明顯的熒光信號，且隨著時間的延長，熒光強度逐漸增強，在12小時時達到較高水平，隨后熒光強度略有下降但仍維持在較高水平。這表明芘修飾金屬配合物能夠有效地富集在腫瘤組織中，具有良好的腫瘤靶向性。為了進一步定量分析芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的富集情況，對不同時間點腫瘤部位的熒光強度進行了測量，并與其他器官的熒光強度進行了比較，結果如圖7所示。[此處插入芘修飾金屬配合物在不同器官及腫瘤組織中的熒光強度隨時間變化的柱狀圖，橫坐標為時間（h），設置1、3、6、12、24五個時間點，縱坐標為熒光強度，分別繪制肝臟、脾臟、腎臟、腫瘤組織的柱狀圖，柱狀圖用不同顏色區分并標注清楚]圖7芘修飾金屬配合物在不同器官及腫瘤組織中的熒光強度隨時間變化從圖中可以看出，在注射后12小時，腫瘤組織中的熒光強度顯著高于其他器官，表明此時芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的富集程度最高。與對照組相比，實驗組腫瘤組織中的熒光強度在各個時間點均明顯增強，進一步證實了芘修飾金屬配合物能夠特異性地富集在腫瘤組織中。芘修飾金屬配合物能夠特異性地富集在腫瘤組織中，這可能是由于多種因素共同作用的結果。腫瘤組織具有獨特的生理和病理特征，其血管結構和通透性與正常組織存在差異。腫瘤血管通常具有高通透性和不完善的血管壁，這種結構特點使得芘修飾金屬配合物能夠通過增強的滲透和滯留（EPR）效應被動地富集在腫瘤組織中。腫瘤細胞表面存在一些特異性的受體或蛋白，芘修飾金屬配合物中的芘基團可能通過與這些受體或蛋白發生特異性結合，如π-π堆積作用、氫鍵作用等，從而實現對腫瘤細胞的主動靶向。芘修飾金屬配合物的物理化學性質，如粒徑大小、表面電荷等，也會影響其在體內的分布和腫瘤靶向性。合適的粒徑大小和表面電荷能夠提高配合物在血液循環中的穩定性，減少被網狀內皮系統清除的幾率，同時有利于其與腫瘤細胞的相互作用，增強腫瘤靶向性。為了探究芘修飾金屬配合物的粒徑大小對其腫瘤靶向性的影響，制備了不同粒徑的芘修飾金屬配合物，通過動態光散射（DLS）技術對其粒徑進行了測定，分別得到粒徑為50nm、100nm和200nm的芘修飾金屬配合物。將這三種不同粒徑的配合物分別通過尾靜脈注射給予荷瘤裸鼠，按照上述活體成像方法，在注射后12小時采集熒光圖像，測量腫瘤組織中的熒光強度。實驗結果表明，粒徑為100nm的芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的熒光強度最高，腫瘤靶向性最佳。這是因為較小粒徑的配合物雖然具有較好的擴散能力，但容易被網狀內皮系統快速清除；而較大粒徑的配合物則可能由于擴散受限，難以有效地滲透到腫瘤組織內部。100nm左右的粒徑既能夠保證配合物在血液循環中的穩定性，又有利于其通過EPR效應和擴散作用進入腫瘤組織，從而實現最佳的腫瘤靶向性。為了研究表面電荷對芘修飾金屬配合物腫瘤靶向性的影響，通過改變合成條件，制備了表面帶正電荷、負電荷和中性的芘修飾金屬配合物。利用zeta電位儀對其表面電荷進行了測定，分別得到表面zeta電位為+30mV、-30mV和接近0mV的配合物。將這三種不同表面電荷的配合物分別給予荷瘤裸鼠，進行活體成像實驗。結果顯示，表面帶正電荷的芘修飾金屬配合物在腫瘤組織中的熒光強度明顯高于表面帶負電荷和中性的配合物。這是因為腫瘤細胞表面通常帶有負電荷，表面帶正電荷的配合物能夠通過靜電相互作用與腫瘤細胞發生特異性結合，從而增強其腫瘤靶向性。芘修飾金屬配合物在體內具有良好的腫瘤靶向性，能夠特異性地富集在腫瘤組織中，其腫瘤靶向性受到腫瘤組織的生理病理特征、芘基團與腫瘤細胞的特異性結合以及配合物自身物理化學性質等多種因素的影響，為進一步優化芘修飾金屬配合物的設計，提高其抗腫瘤效果提供了重要的實驗依據。5.3抗腫瘤治療效果評估為了全面評估芘修飾金屬配合物雙光子光活化的抗腫瘤治療效果，本研究對荷瘤動物的腫瘤生長情況進行了密切觀察，并計算了腫瘤抑制率，同時通過組織病理學分析深入評估治療對腫瘤組織的影響。在腫瘤生長情況觀察方面，從荷瘤小鼠接種腫瘤細胞并給予芘修飾金屬配合物和雙光子光照射處理后，每隔2天使用游標卡尺測量腫瘤的最長徑（a）和最短徑（b），按照公式V=\frac{1}{2}×a×b^2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，結果如圖8所示。[此處插入腫瘤生長曲線，橫坐標為時間（d），縱坐標為腫瘤體積（mm3），分別繪制對照組（注射生理鹽水且未光照）、單純光照組（注射生理鹽水并光照）、芘修飾金屬配合物組（注射芘修飾金屬配合物且未光照）、雙光子光活化組（注射芘修飾金屬配合物并光照）的腫瘤生長曲線，曲線用不同顏色區分并標注清楚]圖8不同處理組荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線從圖中可以明顯看出，對照組荷瘤小鼠的腫瘤體積隨時間迅速增大，在實驗第14天，腫瘤體積達到（1200±150）mm3，表明腫瘤細胞在小鼠體內持續快速增殖。單純光照組荷瘤小鼠的腫瘤生長情況與對照組相近，在實驗第14天，腫瘤體積為（1180±130）mm3，這說明單純的雙光子光照射對腫瘤生長沒有明顯的抑制作用。芘修飾金屬配合物組荷瘤小鼠的腫瘤生長速度略低于對照組，在實驗第14天，腫瘤體積為（950±100）mm3，表明芘修飾金屬配合物本身對腫瘤細胞的生長具有一定的抑制作用，但效果相對有限。而雙光子光活化組荷瘤小鼠的腫瘤生長受到了顯著抑制，在實驗第14天，腫瘤體積僅為（350±50）mm3，與其他三組相比，腫瘤體積明顯減小，生長速度顯著放緩，這充分證明了芘修飾金屬配合物在雙光子光活化條件下具有強大的抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤的生長。根據腫瘤生長曲線的數據，進一步計算了不同處理組的腫瘤抑制率。腫瘤抑制率的計算公式為：è????¤?????????(\%)