肝癌轉移特征性聚糖譜改變及相應糖基轉移酶基因表達差異研究摘要肝細胞肝癌（humanhepatocellularcarcinoma，HCC）在我國位居惡性腫瘤死亡率第二位，其復發和轉移一直是影響肝癌治療效果的重要因素。所有細胞都帶有致密而復雜的共價鍵結合的糖鏈（又叫做聚糖或寡糖）。聚糖結構隨腫瘤進程不同會出現特征性的改變。尋找特征性改變的聚糖，弄清其改變的意義對于腫瘤的監測、診治及預后判斷都具有重要價值。凝集素芯片是2005年新出現的糖分析技術，可以高通量的解析樣本的聚糖信息。本研究首次采用凝集素芯片比較了3株肝細胞：L02（正常肝細胞系）、Hep3B（不轉移肝癌細胞系）、HCCLM3（高轉移潛能肝癌細胞系）的細胞膜蛋白糖譜，篩選出Hep3B和HCCLM3細胞表面一系列和肝癌侵襲及轉移相關特征性聚糖結構，并且建立了糖基轉移酶基因芯片比較了Hep3B和HCCLM3的糖基轉移酶基因表達譜，一方面用以解釋HCCLM3細胞表面特征性聚糖結構的發生，另一方面探討差異表達的糖基轉移酶所涉及的細胞功能及與HCCLM3細胞系轉移潛能的相關性。最后我們對其中一個差異表達的糖基轉移酶β3GALT5進行基因沉默，分析了這一基因的改變對高轉移肝癌細胞系HCCLM3的體外細胞行為學影響。關鍵詞肝細胞肝癌；腫瘤轉移；凝集素芯片；聚糖譜改變；糖基轉移酶；基因表達；細胞侵襲；RNA干擾一、引言肝細胞肝癌（HCC）是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，在我國其發病率和死亡率均居高不下，嚴重威脅著人類的健康。肝癌的復發和轉移是導致患者預后不良的主要原因，盡管在肝癌的診斷和治療方面取得了一定進展，但對于肝癌轉移機制的深入理解仍有待加強。細胞表面的聚糖在細胞間識別、信號傳導、細胞黏附等多種生物學過程中發揮著關鍵作用。在腫瘤發生發展過程中，聚糖結構會發生顯著改變，這些改變與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移以及免疫逃逸等密切相關。因此，研究肝癌轉移過程中特征性聚糖譜的改變以及相應糖基轉移酶基因表達的差異，有望為肝癌的早期診斷、治療靶點的尋找以及預后評估提供新的思路和方法。二、材料與方法2.1細胞系選用正常肝細胞系L02、不轉移肝癌細胞系Hep3B以及高轉移潛能肝癌細胞系HCCLM3作為研究對象。這些細胞系均購自國內知名細胞庫，并在實驗室條件下按照標準操作規程進行培養和傳代。2.2凝集素芯片技術檢測細胞膜蛋白聚糖譜采用Cy3標記完整細胞膜，液氮速凍終止標記后，使用Merck天然膜蛋白提取試劑盒提取細胞膜蛋白。通過免疫印跡法鑒定膜蛋白提取的純度，蛋白定量后每格凝集素芯片圍欄上樣10μg。經芯片孵育、清洗、掃描及統計分析后獲得細胞膜蛋白和凝集素結合譜，根據不同凝集素對聚糖的結合特異性，推斷膜蛋白聚糖譜，并比較不同細胞聚糖譜表達差異。為驗證芯片系統的重現性，進行了不同樣本及同一批樣本重復上樣檢測。2.3糖基轉移酶基因芯片的制備與應用從功能糖組學網站（）數據庫篩選參與腫瘤相關聚糖合成的基因115個，其中包含90個糖基轉移酶、10個糖苷水解酶和5個糖核苷酸轉運子，合成探針點制糖基轉移酶基因芯片。芯片上同時設置陽性對照、陰性對照、點樣陽性對照以及外標作為芯片質控。選取人肝癌細胞系Hep3B和HCCLM3，用Trizol法提取RNA，逆轉錄獲得cDNA，經熒光標記后進行芯片雜交。篩選出表達差異倍數≥2或是≤0.5的基因，統計學方法分析差異顯著性，并經生物信息學分析差異基因可能涉及的聚糖結構合成通路及功能網絡。選取其中5個基因通過Real-timePCR方法驗證芯片結果。2.4β3GALT5基因沉默及細胞行為學分析針對差異表達的糖基轉移酶β3GALT5設計并合成特異性的siRNA，采用脂質體轉染法將其導入高轉移肝癌細胞系HCCLM3中，實現β3GALT5基因的沉默。通過實時熒光定量PCR和Westernblot檢測基因沉默效率。利用Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力的變化，CCK-8法檢測細胞增殖能力的改變，流式細胞術分析細胞凋亡情況。三、實驗結果3.1基于凝集素芯片的不同轉移潛能肝癌細胞系膜蛋白聚糖譜比較凝集素芯片技術成功捕捉到細胞系CHO和Lec1的膜蛋白特征性寡糖表達差異，即Lec1由于缺少N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶I，雜合型和復雜型聚糖表達減少，高甘露糖型聚糖代償性合成增多。比較L02、Hep3B的細胞膜糖譜，發現Hep3B對凝集素ConA、AAL、PHA-L、MPL的親和增強，對WGA親和減弱，提示細胞表面甘露糖、末端巖藻糖、β1-6分支聚糖及粘蛋白T抗原聚糖結構增多而N-乙酰葡糖胺結構和（或）多價唾液酸結構的減少。比較Hep3B和HCCLM3的細胞膜聚糖譜，發現HCCLM3對凝集素LCA、PHA-E、MAL-I、MAL-II、WGA的親和增強，對Lac-A-I親和減弱，提示細胞表面可能出現核心巖藻糖、平分型GlcNAc、α2,3連接唾液酸和（或）N-乙酰葡糖胺結構表達增高以及末端β1-4連接半乳糖結構表達減少。細胞表面凝集素組織化學技術驗證的結果和芯片結果一致，證明芯片結果可靠。3.2不同轉移潛能肝癌細胞系糖基轉移酶基因表達譜比較及其與細胞膜聚糖譜的關系人肝癌細胞系Hep3B和HCCLM3比較，18個基因在HCCLM3中表達上調，11個基因表達下調。表達改變的基因主要涉及N-聚糖、O-聚糖粘蛋白sialylTn抗原、血型糖脂、紅細胞糖苷脂、sialylLewisa（sLea）、sialylLewisx（sLex）等聚糖結構的合成。比對這兩株細胞的凝集素芯片親和譜與糖基轉移酶基因表達譜，發現糖基轉移酶基因FUT8、MGAT3、ST3Gal的上調分別對應凝集素芯片上LCA、PHA-E、MAL-I、II親和信號增強。結合IPA工具分析差異基因涉及的功能網絡圖，發現MGAT3、ST3Gals、β3GalT5、β3Gn-Ts、FUT等基因通過改變對黏附分子或其受體的修飾和表達量來影響細胞的黏附；MGAT5等通過協同或獨立刺激血管生長因子分泌促進血管生成；MGAT5等基因也可以通過調節功能網絡中重要節點分子如TGFβ受體的表達，影響其后續的多種信號通路，參與細胞的凋亡增殖等。3.3β3GALT5基因沉默對HCCLM3細胞體外行為學的影響成功將針對β3GALT5的siRNA導入HCCLM3細胞，實時熒光定量PCR和Westernblot結果顯示β3GALT5基因的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，表明基因沉默成功。Transwell小室實驗結果表明，β3GALT5基因沉默后，HCCLM3細胞的侵襲能力明顯減弱；CCK-8法檢測結果顯示細胞增殖能力受到抑制；流式細胞術分析結果顯示細胞凋亡率顯著增加。四、分析與討論4.1肝癌轉移相關特征性聚糖譜的意義本研究通過凝集素芯片技術篩選出了與肝癌侵襲及轉移相關的特征性聚糖譜。這些聚糖結構的改變可能在肝癌細胞的轉移過程中發揮著重要作用。例如，核心巖藻糖、平分型GlcNAc等結構的增加可能影響細胞表面受體與配體的相互作用，從而促進肝癌細胞與細胞外基質或其他細胞的黏附、遷移。末端β1-4連接半乳糖結構表達減少可能影響細胞間的識別和信號傳導，有利于肝癌細胞突破原發部位的限制發生轉移。這些特征性聚糖譜的發現為肝癌轉移機制的研究提供了新的線索，也有望作為潛在的生物標志物用于肝癌轉移的早期診斷。4.2糖基轉移酶基因表達差異與聚糖譜改變及肝癌轉移的關系糖基轉移酶基因表達譜的改變很好地解釋了細胞膜聚糖譜的差異。例如，FUT8基因表達上調導致核心巖藻糖結構增加，這與凝集素芯片上LCA親和信號增強一致。差異表達的糖基轉移酶基因通過調節細胞黏附、血管生成、細胞凋亡增殖等多種生物學過程參與肝癌轉移。如MGAT5等基因通過調節TGFβ受體的表達影響信號通路，進而影響肝癌細胞的生物學行為。深入研究這些糖基轉移酶基因的功能及相互作用網絡，有助于進一步闡明肝癌轉移的分子機制，為尋找新的治療靶點提供理論依據。4.3β3GALT5基因在肝癌轉移中的作用β3GALT5基因沉默后，HCCLM3細胞的侵襲、增殖能力受到抑制，凋亡率增加，表明β3GALT5基因在肝癌轉移過程中發揮著促進作用。β3GALT5可能通過參與合成特定的聚糖結構，影響細胞表面分子的功能，進而調節肝癌細胞的生物學行為。進一步研究β3GALT5的作用機制以及其上下游調控關系，對于開發針對肝癌轉移的靶向治療策略具有重要意義。五、結論本研究通過凝集素芯片和糖基轉移酶基因芯片技術，系統地分析了肝癌轉移過程中特征性聚糖譜的改變以及相應糖基轉移酶基因表達的差異。篩選出了一系列與肝癌侵襲及轉移相關的特征性聚糖結構和差