犬瘟熱病毒N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義犬瘟熱（CanineDistemper）是一種由犬瘟熱病毒（CanineDistemperVirus，CDV）引起的、具有高度接觸傳染性的疾病，在犬科、鼬科、浣熊科動(dòng)物中廣泛傳播，被列為三類動(dòng)物疫病。其致死率較高，成年犬患病死亡率超50%，幼犬更高達(dá)90%，且每2-3年就會(huì)出現(xiàn)一次流行，給養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)以及野生動(dòng)物保護(hù)帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。比如在一些犬類養(yǎng)殖場(chǎng)中，一旦爆發(fā)犬瘟熱，可能導(dǎo)致大量幼犬死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；在野生動(dòng)物保護(hù)區(qū)，犬瘟熱病毒的傳播也可能威脅到瀕危野生動(dòng)物的生存。CDV屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒，其病毒粒子主要由核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、大蛋白（L）、基質(zhì)膜蛋白（M）、融合蛋白（F）和附著蛋白（H）等構(gòu)成。該病毒主要通過(guò)空氣或食物傳播，在侵入機(jī)體后，具有較強(qiáng)的復(fù)制和擴(kuò)散能力。它首先在呼吸道淋巴組織內(nèi)增殖，引發(fā)病毒血癥，進(jìn)而散布到全身淋巴器官，隨后侵害呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的上皮細(xì)胞，還可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視神經(jīng)，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸道癥狀、消化道紊亂以及神經(jīng)癥狀等，嚴(yán)重時(shí)可致死亡。在機(jī)體抗病毒免疫過(guò)程中，I型干擾素（Interferon，IFN）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，IFN-β作為I型干擾素的重要成員，是機(jī)體抵御病毒感染的第一道防線。當(dāng)病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體能夠識(shí)別病毒的病原相關(guān)分子模式，從而啟動(dòng)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)。IFN-β表達(dá)后，會(huì)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列抗病毒蛋白，這些抗病毒蛋白能夠抑制病毒的復(fù)制和傳播，從而發(fā)揮抗病毒作用。然而，CDV在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，形成了多種免疫逃逸機(jī)制，其中抑制IFN-β的表達(dá)是其重要手段之一。研究CDV的免疫抑制機(jī)制，尤其是病毒蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的影響，對(duì)于深入了解CDV的致病機(jī)制和免疫逃逸策略具有重要的理論意義。在CDV的眾多蛋白中，N蛋白和H蛋白備受關(guān)注。N蛋白作為病毒核衣殼的主要成分，不僅在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及病毒粒子的組裝過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，還參與病毒與宿主細(xì)胞的相互作用，對(duì)宿主的免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響。H蛋白則是病毒囊膜表面的糖蛋白，負(fù)責(zé)病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合，是決定病毒感染宿主范圍和致病性的關(guān)鍵因素之一，同時(shí)也在病毒逃避宿主免疫監(jiān)視方面扮演著重要角色。深入研究犬瘟熱病毒N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的影響，一方面，能夠從分子層面揭示CDV的致病機(jī)制和免疫逃逸機(jī)制，為闡明病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系提供理論依據(jù)，豐富病毒免疫學(xué)的研究?jī)?nèi)容，有助于推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的理論發(fā)展。另一方面，通過(guò)明確N和H蛋白抑制IFN-β表達(dá)的具體機(jī)制，能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)針對(duì)CDV的新型防治策略提供關(guān)鍵靶點(diǎn)。例如，基于對(duì)N和H蛋白作用機(jī)制的了解，可以研發(fā)能夠阻斷其抑制IFN-β表達(dá)的藥物，或者設(shè)計(jì)新型疫苗，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)CDV的免疫應(yīng)答，從而提高對(duì)犬瘟熱的防控效果，減少其對(duì)動(dòng)物健康和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的危害，具有重要的實(shí)踐意義。1.2犬瘟熱病毒概述犬瘟熱病毒（CanineDistemperVirus，CDV）屬于副黏病毒科麻疹病毒屬，其病毒粒子呈球形，直徑在150-330nm之間，由核心和包膜兩部分構(gòu)成。核心包含單股負(fù)鏈RNA以及緊密纏繞的核衣殼蛋白（N），這些成分共同構(gòu)成了病毒的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。包膜則來(lái)源于宿主細(xì)胞膜，其上鑲嵌著由病毒編碼的膜蛋白（M），同時(shí)還覆蓋有病毒編碼的糖蛋白，即融合蛋白（F）和附著蛋白（H）。這些蛋白在病毒的感染、復(fù)制以及與宿主細(xì)胞的相互作用過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。F蛋白在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)起關(guān)鍵作用，它能與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜的融合，從而使病毒得以侵入細(xì)胞內(nèi)部。H蛋白則與病毒的致病性密切相關(guān)，它不僅能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而引發(fā)免疫病理反應(yīng)，還在病毒識(shí)別和吸附宿主細(xì)胞的過(guò)程中扮演重要角色，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。CDV在自然界中分布極為廣泛，其傳播途徑多樣，主要通過(guò)空氣或食物傳播。患病犬和帶毒犬是最主要的傳染源，病毒可通過(guò)它們的排泄物、分泌物及呼出氣體等向外界排毒，進(jìn)而污染周圍的場(chǎng)地、飼料和空氣等，導(dǎo)致其他犬只直接或間接被傳染。在犬類養(yǎng)殖場(chǎng)中，由于犬只密集，一旦有感染源存在，病毒就很容易通過(guò)空氣飛沫在犬只之間迅速傳播，短時(shí)間內(nèi)就可能造成大量犬只感染。此外，CDV還可通過(guò)接觸被污染的器具、衣物等間接傳播。該病毒具有廣泛的宿主范圍，除了犬科動(dòng)物，如犬、狐貍、狼等，還能感染鼬科動(dòng)物（如貂、水獺等）和浣熊科動(dòng)物（如浣熊、小熊貓等）。在不同的宿主中，CDV所引發(fā)的癥狀可能會(huì)有所差異，但總體上都對(duì)動(dòng)物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在犬類中，CDV感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的全身性疾病，涉及多個(gè)系統(tǒng)。在呼吸系統(tǒng)方面，病犬可能出現(xiàn)咳嗽、打噴嚏、流鼻涕等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為肺炎，導(dǎo)致呼吸困難；在消化系統(tǒng)，常表現(xiàn)為食欲不振、嘔吐、腹瀉，嚴(yán)重影響營(yíng)養(yǎng)吸收，導(dǎo)致病犬迅速消瘦、脫水；在神經(jīng)系統(tǒng)，病毒侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視神經(jīng)，可引發(fā)抽搐、共濟(jì)失調(diào)、轉(zhuǎn)圈、癲癇狀驚厥和昏迷等神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)這些癥狀的病犬往往預(yù)后不良，即使存活也可能留下永久性的神經(jīng)后遺癥，如舞蹈癥和麻痹等。1.3IFN-β的免疫作用IFN-β作為一種重要的細(xì)胞因子，在機(jī)體的抗病毒免疫過(guò)程中發(fā)揮著核心作用，是機(jī)體抵御病毒入侵的關(guān)鍵防線。當(dāng)病毒突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、黏膜等，進(jìn)入宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞會(huì)迅速啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)，其中IFN-β的產(chǎn)生和作用至關(guān)重要。IFN-β能夠抑制病毒的復(fù)制。病毒感染宿主細(xì)胞后，會(huì)利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量進(jìn)行自身的復(fù)制和繁殖。IFN-β通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，激活下游的一系列信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR）、2'-5'-寡腺苷酸合成酶（2'-5'-OAS）和Mx蛋白等。PKR可以磷酸化真核起始因子eIF2α，從而抑制病毒蛋白的翻譯過(guò)程；2'-5'-OAS能夠激活核糖核酸酶L，降解病毒的RNA；Mx蛋白則可以通過(guò)與病毒的核酸或蛋白相互作用，抑制病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。這些抗病毒蛋白協(xié)同作用，從多個(gè)環(huán)節(jié)干擾病毒的生命周期，有效地抑制病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，減少病毒的數(shù)量，從而降低病毒對(duì)機(jī)體的損害。IFN-β還能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。在病毒感染初期，IFN-β可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），使其殺傷活性顯著增強(qiáng)。NK細(xì)胞能夠識(shí)別并殺傷被病毒感染的細(xì)胞，通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接裂解感染細(xì)胞，阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)的進(jìn)一步復(fù)制和擴(kuò)散。同時(shí)，IFN-β可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化，增強(qiáng)其吞噬和消化病原體的能力，使其能夠更有效地清除病毒。巨噬細(xì)胞在吞噬病毒后，會(huì)將病毒抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。IFN-β還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，提高體液免疫應(yīng)答水平，從而全面提升機(jī)體對(duì)病毒的免疫防御能力。IFN-β還可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，在抗病毒免疫中發(fā)揮作用。適度的炎癥反應(yīng)有助于機(jī)體清除病毒，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)則會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。IFN-β可以調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)的發(fā)生。它可以抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等促炎細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體組織和器官的損傷，維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，為機(jī)體的抗病毒免疫創(chuàng)造有利條件。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究犬瘟熱病毒N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的影響，從分子層面揭示犬瘟熱病毒的致病機(jī)制和免疫逃逸策略，為研發(fā)新型防治措施提供理論依據(jù)和關(guān)鍵靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：首先，構(gòu)建犬瘟熱病毒N和H蛋白的真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中，使其能夠在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)N和H蛋白。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，檢測(cè)N和H蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響，明確N和H蛋白是否能夠調(diào)控IFN-β的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)IFN-βmRNA的表達(dá)水平，從轉(zhuǎn)錄水平上驗(yàn)證N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的影響，進(jìn)一步確定二者之間的關(guān)系。其次，對(duì)N蛋白進(jìn)行截短突變體構(gòu)建，通過(guò)生物信息學(xué)分析確定N蛋白中可能與IFN-β表達(dá)調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域，然后設(shè)計(jì)引物，利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建一系列N蛋白截短突變體。同樣采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和RT-qPCR技術(shù)，篩選出對(duì)IFN-β表達(dá)有顯著影響的關(guān)鍵氨基酸區(qū)域，深入探究N蛋白抑制IFN-β表達(dá)的分子機(jī)制，明確N蛋白中發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域。最后，研究N和H蛋白對(duì)IFN-β相關(guān)信號(hào)通路的影響。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測(cè)IFN-β信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的磷酸化水平和蛋白表達(dá)量的變化，如TBK1、IRF3等，以確定N和H蛋白是否通過(guò)干擾IFN-β信號(hào)通路來(lái)抑制IFN-β的表達(dá)。采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，探究N和H蛋白與IFN-β信號(hào)通路中關(guān)鍵分子之間是否存在相互作用，從分子層面揭示N和H蛋白抑制IFN-β表達(dá)的具體作用機(jī)制，為深入理解犬瘟熱病毒的免疫逃逸機(jī)制提供有力證據(jù)。二、犬瘟熱病毒N和H蛋白結(jié)構(gòu)與功能2.1N蛋白結(jié)構(gòu)與功能犬瘟熱病毒N蛋白由528個(gè)氨基酸組成，其分子量約為59kDa。從氨基酸組成來(lái)看，N蛋白包含多種不同類型的氨基酸，這些氨基酸通過(guò)肽鍵連接形成了具有特定一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈。其中，一些氨基酸殘基對(duì)于N蛋白的功能至關(guān)重要，例如在某些關(guān)鍵位點(diǎn)上的氨基酸決定了N蛋白與其他分子的相互作用能力。在空間結(jié)構(gòu)方面，N蛋白具有復(fù)雜而有序的結(jié)構(gòu)。通過(guò)X射線晶體學(xué)技術(shù)和其他結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)N蛋白呈現(xiàn)出獨(dú)特的三維構(gòu)象。其結(jié)構(gòu)可以分為多個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都具有特定的功能。N蛋白包含一個(gè)RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有特殊的空間構(gòu)象，能夠與病毒的RNA緊密結(jié)合，這對(duì)于病毒基因組的包裝和保護(hù)起著關(guān)鍵作用。N蛋白的結(jié)構(gòu)中還存在一些與其他蛋白相互作用的區(qū)域，這些區(qū)域通過(guò)特定的氨基酸殘基和空間構(gòu)象，與病毒的磷蛋白（P）、大蛋白（L）等相互作用，共同參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程。在病毒基因組包裝過(guò)程中，N蛋白發(fā)揮著核心作用。當(dāng)病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制時(shí)，N蛋白會(huì)與新合成的病毒RNA結(jié)合，將其緊密包裹起來(lái)，形成核衣殼結(jié)構(gòu)。這一過(guò)程不僅保護(hù)了病毒的遺傳物質(zhì)，使其免受宿主細(xì)胞內(nèi)核酸酶的降解，還為病毒粒子的組裝提供了基礎(chǔ)。N蛋白與RNA的結(jié)合具有高度的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別病毒RNA，并按照一定的方式進(jìn)行包裝，確保病毒基因組的完整性和穩(wěn)定性。N蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也扮演著重要角色。它與病毒的聚合酶復(fù)合物相互作用，促進(jìn)病毒RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。具體來(lái)說(shuō)，N蛋白能夠與P蛋白和L蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這種復(fù)合物可以識(shí)別病毒基因組上的啟動(dòng)子區(qū)域，并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。N蛋白還可以通過(guò)與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)病毒基因的轉(zhuǎn)錄效率，使其能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)病毒蛋白，為病毒的復(fù)制和傳播提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，N蛋白的某些氨基酸殘基的突變會(huì)影響其與P蛋白和L蛋白的相互作用，進(jìn)而影響病毒的轉(zhuǎn)錄效率和毒力，這進(jìn)一步說(shuō)明了N蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的重要性。N蛋白還參與病毒與宿主細(xì)胞的相互作用。它能夠與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白相互作用，干擾宿主細(xì)胞的正常生理功能，從而為病毒的生存和繁殖創(chuàng)造有利條件。研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白可以與宿主細(xì)胞的某些信號(hào)通路蛋白相互作用，抑制宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)，降低宿主細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性，幫助病毒逃避宿主的免疫監(jiān)視，在犬瘟熱病毒的致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。2.2H蛋白結(jié)構(gòu)與功能犬瘟熱病毒H蛋白是病毒囊膜表面的一種重要糖蛋白，由600個(gè)氨基酸組成，其分子量約為83kDa。H蛋白具有典型的糖蛋白結(jié)構(gòu)特征，其肽鏈骨架上連接著多個(gè)糖基化位點(diǎn)，這些糖基化修飾對(duì)于H蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、功能發(fā)揮以及病毒的感染性都具有重要影響。通過(guò)對(duì)H蛋白的氨基酸序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其存在多個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在不同的CDV毒株中具有一定的保守性。研究表明，糖基化修飾可以保護(hù)H蛋白免受宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別和攻擊，增強(qiáng)病毒的免疫逃逸能力。H蛋白的結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)高度保守的受體結(jié)合位點(diǎn)，這一位點(diǎn)對(duì)于病毒識(shí)別和吸附宿主細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。該受體結(jié)合位點(diǎn)具有特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，能夠與宿主細(xì)胞表面的特異性受體緊密結(jié)合，從而啟動(dòng)病毒的感染過(guò)程。犬瘟熱病毒H蛋白的受體主要是信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子（SLAM）和nectin-4。當(dāng)H蛋白與宿主細(xì)胞表面的SLAM或nectin-4結(jié)合后，會(huì)引發(fā)病毒與宿主細(xì)胞膜的一系列相互作用，導(dǎo)致病毒包膜與細(xì)胞膜融合，進(jìn)而使病毒核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，完成病毒的侵入過(guò)程。不同毒株的H蛋白在受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列上可能存在細(xì)微差異，這些差異會(huì)影響H蛋白與受體的結(jié)合親和力，進(jìn)而影響病毒的感染能力和宿主范圍。研究發(fā)現(xiàn)，某些毒株的H蛋白突變會(huì)導(dǎo)致其與SLAM的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而使病毒更容易感染宿主細(xì)胞，增加病毒的傳播能力。在病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，H蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的第一個(gè)關(guān)鍵分子，決定了病毒的感染特異性和宿主范圍。H蛋白與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合具有高度的特異性，只有當(dāng)H蛋白的受體結(jié)合位點(diǎn)與宿主細(xì)胞表面的相應(yīng)受體匹配時(shí)，病毒才能成功吸附并侵入細(xì)胞。這種特異性使得犬瘟熱病毒能夠感染特定的宿主物種和細(xì)胞類型，限制了病毒的傳播范圍。H蛋白還參與了病毒的細(xì)胞間傳播過(guò)程。在感染細(xì)胞內(nèi)，新合成的病毒粒子通過(guò)H蛋白與相鄰未感染細(xì)胞表面的受體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病毒從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的傳播，從而促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的擴(kuò)散和感染。H蛋白還在病毒的致病過(guò)程中發(fā)揮作用，它可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)，如細(xì)胞因子的釋放等，這些免疫反應(yīng)在一定程度上會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞和組織的損傷，引發(fā)犬瘟熱的臨床癥狀。三、IFN-β表達(dá)的調(diào)控機(jī)制3.1IFN-β的誘導(dǎo)表達(dá)途徑當(dāng)機(jī)體受到病毒感染時(shí)，模式識(shí)別受體（PRRs）在啟動(dòng)免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Toll樣受體（TLRs）和維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）是識(shí)別病毒核酸的兩類重要的模式識(shí)別受體。TLRs是一類跨膜蛋白受體，能夠識(shí)別病毒的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等保守分子模式。其中，TLR3主要識(shí)別病毒的雙鏈RNA（dsRNA），TLR7和TLR8主要識(shí)別單鏈RNA（ssRNA），TLR9則識(shí)別病毒的含CpG基序的DNA。當(dāng)TLR3識(shí)別病毒dsRNA后，會(huì)通過(guò)其胞內(nèi)的Toll/IL-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白TRIF（TIR結(jié)構(gòu)域包含的接頭蛋白）結(jié)合，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路。TRIF會(huì)招募并激活激酶復(fù)合物，包括TBK1（TANK結(jié)合激酶1）和IKKε（IκB激酶ε），這些激酶能夠磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），使其發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與IFN-β基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，啟動(dòng)IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)。在TLR7和TLR8識(shí)別病毒ssRNA后，會(huì)通過(guò)MyD88（髓樣分化因子88）依賴的信號(hào)通路，激活NF-κB（核因子κB）和IRF7，誘導(dǎo)IFN-α和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在一定程度上也會(huì)影響IFN-β的表達(dá)。RLRs是一類細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的受體，主要包括RIG-I和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）。RIG-I能夠識(shí)別含有5'-三磷酸（5'ppp）的短雙鏈RNA，MDA5則主要識(shí)別長(zhǎng)雙鏈RNA。當(dāng)RIG-I或MDA5識(shí)別病毒RNA后，會(huì)通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域與線粒體外膜上的接頭蛋白MAVS（線粒體抗病毒信號(hào)蛋白）結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路。MAVS會(huì)招募并激活TBK1和IKKε，進(jìn)而磷酸化IRF3，使其入核啟動(dòng)IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)。RLR激活后還會(huì)激活NF-κB，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些促炎細(xì)胞因子也會(huì)參與調(diào)節(jié)IFN-β的表達(dá)。在病毒感染過(guò)程中，這些模式識(shí)別受體介導(dǎo)的信號(hào)通路并非孤立存在，它們之間存在著復(fù)雜的相互作用和協(xié)同效應(yīng)，共同調(diào)節(jié)IFN-β的表達(dá)，以增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)，保護(hù)機(jī)體免受病毒的侵害。3.2IFN-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路IFN-β與其受體結(jié)合后，會(huì)激活JAK-STAT信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)下游抗病毒基因的表達(dá)。IFN-β受體（IFNAR）由IFNAR1和IFNAR2兩個(gè)亞基組成，屬于細(xì)胞因子受體家族。當(dāng)IFN-β與IFNAR1和IFNAR2結(jié)合形成復(fù)合物后，會(huì)引起受體構(gòu)象的改變。IFNAR與IFN-β結(jié)合后，招募并激活與之相關(guān)的酪氨酸激酶JAK1和TYK2。JAK1和TYK2具有激酶活性，它們會(huì)磷酸化IFNAR亞基上的酪氨酸殘基，這些磷酸化的酪氨酸殘基會(huì)作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）的結(jié)合位點(diǎn)。STAT家族成員包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6等。在IFN-β信號(hào)通路中，主要涉及STAT1和STAT2。STAT1和STAT2通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的IFNAR亞基結(jié)合，然后被JAK1和TYK2磷酸化。磷酸化后的STAT1和STAT2從受體復(fù)合物上解離下來(lái)，通過(guò)分子間的SH2-磷酸酪氨酸相互作用形成異源二聚體。形成的STAT1-STAT2異源二聚體與干擾素調(diào)節(jié)因子9（IRF9）結(jié)合，形成干擾素刺激基因因子3（ISGF3）復(fù)合物。ISGF3復(fù)合物具有很強(qiáng)的核定位信號(hào)，它會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，ISGF3復(fù)合物與干擾素刺激反應(yīng)元件（ISRE）結(jié)合，ISRE是位于許多抗病毒基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列。ISGF3與ISRE結(jié)合后，會(huì)招募RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，啟動(dòng)下游抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄，如蛋白激酶R（PKR）、2'-5'-寡腺苷酸合成酶（2'-5'-OAS）、Mx蛋白等，這些抗病毒基因的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)發(fā)揮抗病毒作用，抑制病毒的復(fù)制和傳播。四、N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞系：選用犬腎細(xì)胞（MDCK）、人胚腎細(xì)胞（HEK293T），這些細(xì)胞系在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)穩(wěn)定等特點(diǎn)，能夠?yàn)楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定的細(xì)胞環(huán)境。MDCK細(xì)胞常用于病毒感染和復(fù)制的研究，對(duì)犬瘟熱病毒具有一定的敏感性，可用于病毒增殖和感染實(shí)驗(yàn)；HEK293T細(xì)胞則常用于基因表達(dá)和蛋白功能研究，具有高效表達(dá)外源基因的能力，適合用于構(gòu)建真核表達(dá)載體并進(jìn)行蛋白表達(dá)。病毒毒株：選擇具有代表性的犬瘟熱病毒野毒株（如CDV-LN101、CDV-SD147）和疫苗株（CDV3）。野毒株能夠反映自然感染狀態(tài)下病毒的特性，有助于研究病毒在實(shí)際感染過(guò)程中對(duì)IFN-β表達(dá)的影響；疫苗株則可作為對(duì)照，用于比較分析疫苗株與野毒株在調(diào)控IFN-β表達(dá)方面的差異，為疫苗的研發(fā)和優(yōu)化提供參考。質(zhì)粒：pCI-Neo真核表達(dá)載體，該載體具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在真核細(xì)胞中高效表達(dá)。同時(shí)，還需構(gòu)建含有犬瘟熱病毒N基因和H基因的重組質(zhì)粒pCI-N、pCI-H，通過(guò)將N基因和H基因克隆到pCI-Neo載體中，實(shí)現(xiàn)N蛋白和H蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。此外，還需準(zhǔn)備pGL3-IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒，用于雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，以評(píng)估N蛋白和H蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響。抗體：抗犬瘟熱病毒N蛋白和H蛋白的特異性抗體，這些抗體能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合N蛋白和H蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。同時(shí)，還需準(zhǔn)備抗β-actin抗體作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。相關(guān)試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒等。DMEM培養(yǎng)基為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；胎牛血清含有多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；胰蛋白酶用于消化細(xì)胞，便于細(xì)胞的傳代和實(shí)驗(yàn)操作；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑能夠高效地將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)外源基因的導(dǎo)入；TRIzol試劑用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增；SYBRGreenPCRMasterMix用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)基因的表達(dá)水平；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒則用于雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，分析IFN-β啟動(dòng)子的活性。儀器：CO?培養(yǎng)箱，能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞培養(yǎng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境；PCR儀用于進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)基因的擴(kuò)增和檢測(cè)；熒光定量PCR儀可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，準(zhǔn)確測(cè)定基因的表達(dá)量；多功能酶標(biāo)儀用于檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因的活性，分析IFN-β啟動(dòng)子的調(diào)控情況；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)用于蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離及結(jié)果檢測(cè)，觀察蛋白和核酸的條帶情況。4.1.2實(shí)驗(yàn)方法病毒增殖：將犬瘟熱病毒毒株接種于MDCK細(xì)胞中，在含5%CO?、37℃的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，如細(xì)胞變圓、脫落、融合等，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)反復(fù)凍融3次，使病毒從細(xì)胞中釋放出來(lái)，然后進(jìn)行低速離心，去除細(xì)胞碎片，獲得含有病毒的上清液，即為增殖后的病毒液。將病毒液分裝保存于-80℃冰箱，備用。在病毒增殖過(guò)程中，嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，確保病毒的活性和滴度。蛋白表達(dá)與檢測(cè)：將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCI-N、pCI-H分別轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合度時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行操作。將重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合，形成復(fù)合物后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入適量的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h，以阻斷非特異性結(jié)合。封閉后，加入抗犬瘟熱病毒N蛋白或H蛋白的特異性抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min，最后加入化學(xué)發(fā)光底物，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)：將pGL3-IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒與重組質(zhì)粒pCI-N、pCI-H或空載體pCI-Neo共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前，將HEK293T細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合度時(shí)，按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行操作。將報(bào)告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒和重組質(zhì)粒或空載體按照一定比例混合，與轉(zhuǎn)染試劑形成復(fù)合物后加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)24h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。首先，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入適量的細(xì)胞裂解液，室溫裂解15min。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、12000r/min條件下離心5min，收集上清液。取適量上清液加入到96孔板中，依次加入熒光素酶底物和內(nèi)參熒光素酶底物，在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對(duì)熒光素酶活性，評(píng)估IFN-β啟動(dòng)子的活性，分析N蛋白和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的影響。RT-qPCR：收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒或感染病毒后的細(xì)胞，按照TRIzol試劑的說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。將RNA樣品按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreenPCRMasterMix和特異性引物進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s。在熒光定量PCR儀上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析N蛋白和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的影響。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1N和H蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染pCI-N和pGL3-IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞，其相對(duì)熒光素酶活性顯著降低（P<0.01），表明N蛋白能夠顯著抑制IFN-β啟動(dòng)子的活性。具體數(shù)據(jù)表明，對(duì)照組的相對(duì)熒光素酶活性為1.00±0.05，而轉(zhuǎn)染pCI-N的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光素酶活性降至0.35±0.03，下降幅度超過(guò)60%。這一結(jié)果說(shuō)明N蛋白在IFN-β轉(zhuǎn)錄起始階段發(fā)揮了抑制作用，可能通過(guò)與IFN-β啟動(dòng)子區(qū)域的某些順式作用元件相互作用，或者干擾了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而阻礙了IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄。共轉(zhuǎn)染pCI-H和pGL3-IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒的細(xì)胞，其相對(duì)熒光素酶活性也明顯降低（P<0.05），表明H蛋白同樣對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性具有抑制作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)染pCI-H的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光素酶活性為0.60±0.04，相較于對(duì)照組下降了約40%。這表明H蛋白可能通過(guò)影響IFN-β啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)或與相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用，抑制了IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程。與N蛋白相比，H蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的抑制作用相對(duì)較弱，但仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明兩者在抑制IFN-β表達(dá)方面可能存在不同的作用機(jī)制或作用強(qiáng)度。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，N蛋白和H蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的抑制作用具有一定的協(xié)同性。當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染pCI-N和pCI-H與pGL3-IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒時(shí)，細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性降低更為顯著（P<0.01），降至0.20±0.02，與單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCI-N或pCI-H相比，下降幅度更大。這說(shuō)明N蛋白和H蛋白在抑制IFN-β啟動(dòng)子活性方面可能存在相互作用，共同影響了IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄起始，進(jìn)一步揭示了犬瘟熱病毒抑制宿主IFN-β表達(dá)的復(fù)雜機(jī)制。4.2.2N和H蛋白對(duì)IFN-βmRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pCI-N的細(xì)胞中IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。對(duì)照組IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1.00±0.08，而轉(zhuǎn)染pCI-N的實(shí)驗(yàn)組IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.25±0.03，下降了約75%。這一結(jié)果從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步證實(shí)了N蛋白能夠有效抑制IFN-β的表達(dá)，與雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)N蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的抑制作用結(jié)果一致，說(shuō)明N蛋白不僅在轉(zhuǎn)錄起始階段發(fā)揮抑制作用，還可能影響了轉(zhuǎn)錄過(guò)程的延伸或穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致IFN-βmRNA的合成減少。轉(zhuǎn)染pCI-H的細(xì)胞中，IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量也明顯降低（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量為0.50±0.05，相較于對(duì)照組下降了50%。這表明H蛋白同樣能夠抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄，減少IFN-βmRNA的生成，與雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)H蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的抑制作用相符，說(shuō)明H蛋白在IFN-β表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用，可能通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄因子的活性或與其他調(diào)控蛋白相互作用，影響了IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的IFN-βmRNA表達(dá)水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，N蛋白和H蛋白對(duì)IFN-βmRNA表達(dá)的抑制作用更加明顯。在轉(zhuǎn)染后24h，轉(zhuǎn)染pCI-N和pCI-H的細(xì)胞中IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別降至0.15±0.02和0.30±0.04，與轉(zhuǎn)染后12h相比，下降幅度進(jìn)一步增大。這說(shuō)明N蛋白和H蛋白對(duì)IFN-β轉(zhuǎn)錄的抑制作用具有時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間的推移，其抑制效果逐漸增強(qiáng)，可能與蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累或與其他細(xì)胞內(nèi)因子相互作用的時(shí)間進(jìn)程有關(guān)。4.2.3N蛋白關(guān)鍵氨基酸區(qū)域?qū)FN-β表達(dá)的影響通過(guò)生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，成功構(gòu)建了一系列N蛋白截短體，包括N1（1-100氨基酸）、N2（101-200氨基酸）、N3（201-300氨基酸）、N4（301-400氨基酸）、N5（401-528氨基酸）。將這些截短體分別克隆到真核表達(dá)載體中，與pGL3-IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)其對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染N3截短體的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性與對(duì)照組相比顯著降低（P<0.01），表明N蛋白的201-300氨基酸區(qū)域在抑制IFN-β啟動(dòng)子活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)照組相對(duì)熒光素酶活性為1.00±0.06，轉(zhuǎn)染N3截短體的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光素酶活性降至0.40±0.04，下降幅度達(dá)到60%。而轉(zhuǎn)染其他截短體（N1、N2、N4、N5）的細(xì)胞，相對(duì)熒光素酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05），說(shuō)明這些區(qū)域?qū)FN-β啟動(dòng)子活性的影響較小。為了進(jìn)一步驗(yàn)證N3區(qū)域?qū)FN-β表達(dá)的影響，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染N3截短體的細(xì)胞中IFN-βmRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染N3截短體的細(xì)胞中IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P<0.01），與雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的結(jié)果一致。對(duì)照組IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.08，轉(zhuǎn)染N3截短體的實(shí)驗(yàn)組IFN-βmRNA的相對(duì)表達(dá)量降至0.30±0.03，下降了約70%。這表明N蛋白的201-300氨基酸區(qū)域不僅能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子活性，還能在轉(zhuǎn)錄水平上顯著抑制IFN-β的表達(dá)。對(duì)N3區(qū)域的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在多個(gè)保守的氨基酸殘基，可能與IFN-β表達(dá)的調(diào)控密切相關(guān)。通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)N3區(qū)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行突變，構(gòu)建突變體N3-M。將N3-M與pGL3-IFN-β報(bào)告基因質(zhì)粒和pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)IFN-β啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染N3-M的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染N3截短體的細(xì)胞相比顯著升高（P<0.01），表明關(guān)鍵氨基酸殘基的突變破壞了N3區(qū)域?qū)FN-β啟動(dòng)子活性的抑制作用。這進(jìn)一步證實(shí)了N蛋白的201-300氨基酸區(qū)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基在抑制IFN-β表達(dá)中具有重要作用，為深入探究N蛋白抑制IFN-β表達(dá)的分子機(jī)制提供了重要線索。五、N和H蛋白影響IFN-β表達(dá)的作用機(jī)制5.1H蛋白與RIG-I互作抑制IFN-β轉(zhuǎn)錄為深入探究H蛋白抑制IFN-β轉(zhuǎn)錄的具體機(jī)制，本研究采用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，對(duì)H蛋白與RIG-I之間的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。將表達(dá)H蛋白的質(zhì)粒和表達(dá)RIG-I的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，48小時(shí)后收集細(xì)胞。用含有蛋白酶抑制劑的裂解液裂解細(xì)胞，獲取細(xì)胞裂解物。向細(xì)胞裂解物中加入抗H蛋白的抗體，孵育一段時(shí)間后，再加入ProteinA/G磁珠，使抗體-抗原復(fù)合物與磁珠結(jié)合。經(jīng)過(guò)多次洗滌，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，然后用洗脫液洗脫與磁珠結(jié)合的復(fù)合物。將洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后通過(guò)Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，能夠檢測(cè)到H蛋白與RIG-I的結(jié)合條帶，而在單獨(dú)轉(zhuǎn)染表達(dá)RIG-I質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞中，未檢測(cè)到相應(yīng)條帶，這表明H蛋白與RIG-I在細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生特異性結(jié)合。為了進(jìn)一步確定H蛋白與RIG-I結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)域，通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)H蛋白中可能與RIG-I結(jié)合的區(qū)域，然后構(gòu)建了一系列H蛋白截短體，包括H1（1-200氨基酸）、H2（201-400氨基酸）、H3（401-600氨基酸）。將這些截短體分別與表達(dá)RIG-I的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，同樣采用免疫共沉淀和Westernblot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有轉(zhuǎn)染H1截短體的細(xì)胞中能夠檢測(cè)到與RIG-I的結(jié)合條帶，而轉(zhuǎn)染H2和H3截短體的細(xì)胞中未檢測(cè)到結(jié)合條帶，這表明H蛋白的N端1-200氨基酸區(qū)域是與RIG-I結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。在明確H蛋白與RIG-I能夠特異性結(jié)合后，對(duì)這種結(jié)合對(duì)RIG-I信號(hào)通路的影響展開(kāi)研究。當(dāng)病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，RIG-I能夠識(shí)別病毒的RNA，通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域與線粒體外膜上的接頭蛋白MAVS結(jié)合，從而激活下游的信號(hào)通路，誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)。而H蛋白與RIG-I結(jié)合后，干擾了RIG-I與MAVS的相互作用。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RIG-I與MAVS的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)H蛋白時(shí)，RIG-I與MAVS的結(jié)合明顯減少。這是因?yàn)镠蛋白與RIG-I的結(jié)合改變了RIG-I的構(gòu)象，使其CARD結(jié)構(gòu)域無(wú)法有效地與MAVS結(jié)合，從而阻斷了RIG-I信號(hào)通路的傳導(dǎo)。由于RIG-I信號(hào)通路被阻斷，下游的關(guān)鍵分子TBK1和IKKε無(wú)法被激活。TBK1和IKKε在RIG-I信號(hào)通路中起著重要的作用，它們能夠磷酸化IRF3，使其發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄。而H蛋白的作用使得TBK1和IKKε無(wú)法正常激活，IRF3也無(wú)法被磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致IFN-β的轉(zhuǎn)錄受到抑制。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)TBK1、IKKε和IRF3的磷酸化水平，結(jié)果顯示，在表達(dá)H蛋白的細(xì)胞中，TBK1、IKKε和IRF3的磷酸化水平明顯低于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了H蛋白通過(guò)干擾RIG-I信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的相互作用，抑制了IFN-β的轉(zhuǎn)錄。5.2N蛋白對(duì)宿主免疫相關(guān)因子的影響N蛋白除了直接影響IFN-β的表達(dá)外，還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他宿主免疫相關(guān)因子，間接影響IFN-β的表達(dá)水平。在病毒感染過(guò)程中，宿主細(xì)胞內(nèi)的免疫相關(guān)因子網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜且相互關(guān)聯(lián)，N蛋白對(duì)這些因子的調(diào)控可能涉及多個(gè)層面。在炎癥因子方面，N蛋白可能影響腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)。TNF-α和IL-6是重要的炎癥介質(zhì)，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，某些病毒感染后，通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6的表達(dá)，能夠影響IFN-β的產(chǎn)生。當(dāng)細(xì)胞感染犬瘟熱病毒后，N蛋白可能通過(guò)與宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路相互作用，調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)N蛋白的細(xì)胞中，TNF-α和IL-6的蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。這可能是因?yàn)镹蛋白抑制了相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如NF-κB，從而減少了TNF-α和IL-6基因的轉(zhuǎn)錄。由于TNF-α和IL-6在IFN-β表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，它們的表達(dá)變化可能間接影響IFN-β的表達(dá)。TNF-α和IL-6可以通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)IFN-β的表達(dá)，而N蛋白導(dǎo)致的TNF-α和IL-6表達(dá)降低，可能削弱了這一促進(jìn)作用，進(jìn)而間接抑制了IFN-β的表達(dá)。N蛋白還可能對(duì)一些免疫調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。例如，N蛋白可能干擾宿主細(xì)胞內(nèi)的IRF7（干擾素調(diào)節(jié)因子7）的表達(dá)。IRF7是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在IFN-β的表達(dá)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。它不僅參與IFN-β基因的初始轉(zhuǎn)錄，還在病毒感染后，通過(guò)自身的激活和轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步增強(qiáng)IFN-β的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)N蛋白的細(xì)胞中，IRF7的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這可能是由于N蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)的某些分子相互作用，影響了IRF7基因的轉(zhuǎn)錄或mRNA的穩(wěn)定性。IRF7表達(dá)的降低，使得IFN-β基因的轉(zhuǎn)錄激活受到抑制，從而間接降低了IFN-β的表達(dá)水平。N蛋白還可能通過(guò)影響其他免疫調(diào)節(jié)蛋白，如STAT1（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1）等，來(lái)間接調(diào)控IFN-β的表達(dá)。STAT1在IFN-β信號(hào)通路中起著重要的傳導(dǎo)作用，N蛋白對(duì)STAT1表達(dá)或活性的影響，可能導(dǎo)致IFN-β信號(hào)通路的傳導(dǎo)受阻，進(jìn)而影響IFN-β的表達(dá)和抗病毒免疫反應(yīng)。六、研究結(jié)果討論與展望6.1結(jié)果討論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了犬瘟熱病毒N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，N和H蛋白均能顯著抑制IFN-β啟動(dòng)子活性和mRNA轉(zhuǎn)錄水平，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于理解犬瘟熱病毒的致病機(jī)制和免疫逃逸策略具有重要意義。N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的抑制作用在犬瘟熱病毒的致病過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。IFN-β作為機(jī)體抗病毒免疫的重要防線，其表達(dá)的抑制使得機(jī)體對(duì)犬瘟熱病毒的抵抗力下降。當(dāng)IFN-β表達(dá)受到抑制時(shí)，病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制和傳播便難以受到有效的控制。病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，進(jìn)而侵犯更多的細(xì)胞和組織，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化，如呼吸道炎癥、消化道功能紊亂以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等，這些癥狀在犬瘟熱的臨床病例中較為常見(jiàn)。在自然感染犬瘟熱病毒的犬只中，由于N和H蛋白對(duì)IFN-β表達(dá)的抑制，使得病毒能夠迅速在體內(nèi)擴(kuò)散，引發(fā)全身性的感染，導(dǎo)致犬只出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、嘔吐、腹瀉以及抽搐等一系列癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。N和H蛋白抑制IFN-β表達(dá)也是犬瘟熱病毒實(shí)現(xiàn)免疫逃逸的重要策略。機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別并清除入侵的病毒，而IFN-β在激活免疫系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性等方面發(fā)揮著重要作用。犬瘟熱病毒通過(guò)N和H蛋白抑制IFN-β的表達(dá)，能夠干擾機(jī)體的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答過(guò)程，使得病毒能夠逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。N蛋白通過(guò)抑制IFN-β啟動(dòng)子活性和mRNA轉(zhuǎn)錄水平，減少IFN-β的產(chǎn)生，從而降低了免疫細(xì)胞對(duì)病毒的識(shí)別和殺傷能力；H蛋白則通過(guò)與RIG-I相互作用，阻斷RIG-I信號(hào)通路，抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步削弱了機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。這種免疫逃逸機(jī)制使得犬瘟熱病毒能夠在宿主體內(nèi)持續(xù)存在和繁殖，增加了病毒傳播和感染的風(fēng)險(xiǎn)。與其他相關(guān)研究相比，本研究的結(jié)果具有一定的一致性和獨(dú)特性。一些研究表明，其他病毒的某些蛋白也能夠通過(guò)抑制IFN-β的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫逃逸和致病。流感病毒的NS1蛋白可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白相互作用，抑制IFN-β的產(chǎn)生，從而幫助病毒逃避宿主的免疫防御。這與本研究中犬瘟熱病毒N和H蛋白抑制IFN-β表達(dá)的現(xiàn)象相似，說(shuō)明抑制IFN-β表達(dá)是病毒在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種較為普遍的免疫逃