細胞生物學教學方案

第一章序論

第一節細胞生物學的特點

第二節細胞學和細胞生物學發展簡史

的名言

一細胞的發現

二細胞學說的建立

細胞學說的主要內容

???

0的名言

二細胞學的經典時期

原生質和原生質體概念的提出原生質()原生質體()

細胞分裂的研究

重要細胞器的發現

三細胞學的分支

遺傳學的發展

()精卵細胞染色體數只是體細胞染色體數的一半

()孟德爾定律的重新發現

⑶1905發現性別和染色體的關系

預見遺傳單位有次序的排列在染色體上()染色體學說

染色體行為和遺傳因子聯系起來.

()連鎖基因圖

細胞生理學

細胞化學

四細胞生物學的形成與發展

空間結構的發現

六十年代”細胞生物學”產生

七十年代細胞生物學教學的開展

八十年代分子細胞生物學的發展

九十年代分子細胞生物學高科技手段的發展和運用

指紋技術

雜交瘤技術的運用

第二章細胞基本知識

第一節非細胞形態的生命體

骯病毒()巴布亞新幾內亞一土著庫魯病笑死癥

羊腦風牛病

類病毒

病毒

第二節原核細胞

支原體

衣原體

立克次氏體

放線菌

細菌和藍藻

第三節真核細胞基本知識概要

三大系統

動植物細胞的比較

第三章細胞生物學研究方法

自年荷蘭學者列文虎克（）用單顯微鏡（單透鏡）第一次看到酵母活

細胞以來,人們一直在努力改革和發展觀察手段，來研究細胞較深層

次的形態和結構。今天人們已經有了具有原子尺度高分辨本領的掃描

隧道顯微鏡。與此同時人們還創造了一系列對細胞組分和細胞生理活

動進行詳盡分析的方法和手段，它們揭示了各種細胞結構與生物大分

子在細胞內的功能和作用。為了提供大量均一的細胞作為生物學的研

究材料,人們又發展了一系列細胞培養技術。這些培養技術已經給人

類帶來了極大的利益。可以認為，細胞形態結構的觀察技術，細胞組

分與功能的分析技術與細胞培養技術是細胞生物學賴以發展的三大

技術手段。在這里我們只能對某些具有代表性的實驗技術的基本原理

和技術特點作一簡單的介紹。希望學生通過本章的學習不但能了解實

驗技術本身，還能夠了解到細胞生物學這一實驗科學的發展是和實驗

技術的進步休威相關的，囚此發展和開發先進的實驗技術也是細胞生

物學的一項重要內容。

第一節細胞形態結構的觀察方法

-固定法與活體觀察法

固定法是以一定的化學物質的溶液(有區是氣體)在盡可能保持細

胞生活結構的情況下迅速殺死組織塊。這一過程稱為固定()。然后制

成薄切片,再染色()進行觀察。這種方法比起觀察活細胞有三個優點:

第一,它能清楚地顯現細胞的細微構造,如關于染色體,各種細胞器、

細胞膜和細胞壁的微細構造都是靠這種方法闡明的。第二,這種方法

的制片一般均能保存很久,便于前后研究各種現象之比較。第三,應用

范圍廣,幾乎可用于所有的組織細胞。

這種方法不僅在細胞學發展的歷史上發揮過很大作用,而且在現代

細胞學中也是重要研究手段之一。例如用電子顯微鏡研究細胞亞顯微

結構時通常都使用固定法。固定法在細胞化學的研究上也有廣泛的應

用。

固定法的缺點是,在用固定劑()殺死細胞的同時,常常難免使細胞的

某些生活結構發生一定的變形。因此這種方法不能完全如實地反映生

活細胞的情況。在實踐上往往是能保存細胞某種結構的固定齊！J,卻不

能使另一些結構保留下來。例如,適于觀察染色體的固定劑,對于觀察

線粒體就不合適。有人因為固定法的這種缺點而對它抱懷疑主義由態

度。這是過分偏激的觀點。事實上只要選擇合適的固定劑，這種方法

是能展示給我們細胞結構的許許多多細節的。當然,另一方面在應用

此法時也不應該忘掉它的固有缺點。在研究某種結構時,最好同時多

用幾種固定劑，對比分析所觀察的現象，以免做出主觀的判斷。

活體觀察法的優缺點與固定法正好相反。它的優點是能夠如實

地反映生活細胞的情況。但完全做到這一點也并不容易，必須嚴格

控制實驗條件，最大限度地使所觀察的細胞得到正常生活條件。活

體觀察的缺點是，顯示細胞結構的精細程度較差。這和在活體情況

下細胞內各種結柩的折光率相近有關。相差顯微鏡的運用雖然在一

定程度上可以克服這一缺點，但較之固定法在顯示細胞結構的精細

程度上仍大有遜色。

由于組織培養方法的進步，能夠進行活體觀察的細胞種類也大

大增多。

固定法和活體觀察法各有優缺點，不能互相代替。只有結合并

用，取長補短，方有利于全面認識細胞生活的真相。

二各種顯微鏡

觀察細胞離不開顯微鏡0o這正象觀察天體要用望遠鏡一樣。

常用的顯微鏡有普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒

光顯微鏡、電子顯微鏡等。

、普通光學顯微鏡0的分辨本領

各種顯微鏡識別微觀物象的能力常用分辨力0的概念來表示。

分辨力是指能夠區分相近兩點的最小距離，能夠區分的兩點間距離

越小，表示顯微鏡的分辨力越高。分辨力亦稱分辨本領。顯微鏡的

分辨力是由物鏡決定的。它和物鏡的鏡□率、照明光線的波長有直

接關系。分辨力可按下式計算：

0

分辨力

2照明光源的波長

鏡□率(數值孔徑)

a

?................()

物鏡與標本間的介質的折射率

a物鏡的鏡口角

所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點發出的光線與物鏡前透鏡

有效直徑的邊緣所張的角度()o鏡口角a小于a,故的最大值也

小于。

從公式0可乂看出，為提高分辨力，光源波長(越小越好，而

物鏡的鏡口率越大越好。按可視光線的波長((毫微米)為毫微米，

物鏡的最大鏡口率為計算，微米。這就是說，相近兩點的距離小于

微米時，普通光學顯微鏡符不能分辨出這兩點。因為可視光線的波

長可小到毫微米。所以一般認為普通光鏡的分辨本領的極限約為微

米。

細胞中的結構如染色體、線粒體、中心體、核仁等大于微米，

在光學顯微鏡中能觀察到。這種結構稱顯微結構()內質網的膜、

核膜、微管、微絲等囚小于微米，在普通光學顯微鏡下看不到，稱

為亞顯微結構0O

從公式（）可以看出，要增大鏡口率必須提高物鏡與標本間介質

的折射率。空氣的折射率為，香柏油的折射率為。因為要增大鏡口

率必須用油浸物鏡。

、暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（）是根據丁達爾（）效應的原理設計的。若在暗室

中穿入一細束光線,那么由側面觀察時,那些在普通照明的散射光下

看不見的空氣中的細小塵埃顆粒,可以看得很清楚。這種現象稱丁達

爾現象。暗視野顯微鏡是因為視野內不能直接看到照明光線,只能看

到被檢物體散射或衍射的光線。故視野內呈黑暗狀態。由于被檢物

體表面散射的光亮.才使我們能夠在黑暗的視野中觀察到被檢物體

的外形和運動。

普通顯微鏡的最高分辨力如上所述為微米,而暗視顯微鏡雖然

對被檢物體的細微構造分辨不清，但卻可看到微米以上的微粒子的

存在。這是普通光學顯微鏡所不具有的特性。

暗視野顯微鏡與普通顯微鏡的構造差別,在于集光器的特殊c普

通顯微鏡換上暗視野集光器或用中心擋光法（用黑色厚紙或金屬薄

片制成圓形擋光片。放在普通集光器下面的濾光玻片上，擋住中央

光束）。即可取得暗視野效果。

用中心擋光法若想取得良好的暗視野效果，除了選擇適當直徑

的中心擋光片外，還須考慮反射鏡的角度，光源的強度等各種因素。

常見的暗視野集光器是拋物面集光器（圖）。它的集光鏡是一

個單透鏡，周圍成斜度較小的拋物線形式。由顯微鏡的反光鏡反射

出的光線，被集光鏡的中部遮光板所阻擋，但側面光線則自由進入

遮光板旁和透鏡邊緣之間的縫隙。這些光線在聚光鏡的拋物面的凹

面上發生折射,結果光線集中到聚光鏡的界面以外,處于觀察標本的

平面上。

由于直線進行的光束被遮光板擋住不能進入物鏡，因此視野變

暗。而折射光線集中到標本的物鏡結構時被散射非常光亮,通過物鏡

達到觀察者眼中，故觀察細胞的某些結構（尤其是細胞質顆粒）是亮

的（圖）。

、相差顯微鏡

人們在顯微鏡下觀察被檢標本時，只能靠顏色（光波的波長）和亮度

（光波的振幅）的差別看到被檢物的結構。活細胞近于無色透明,當光

波通過它時顏色和亮度變化不大。因此在普通光學顯微鏡下細致觀

察活細胞的結構是很難的。

三十年代.提出相差顯微鏡（）的原理和設計,四十年代開始制造相

差顯微鏡出售。由于有了相差顯微鏡,在一定程度上克服了上述困難

可以直接看到活細胞中的結構變化。

相差是指同一光線經過折射率不同的介質，其相位發生的差異。

那么什么是相位呢？相位是在某一時間上光的波動所能達到的位

置。當光波通過兩種不同折射率的物質時（如由空氣入水,或由空氣

入玻璃），其波長、振幅和相位皆有不同程度的變化。例如，使光分別

通過公分厚的水和玻璃時，由于水和玻璃的折射率不同,通過它們的

光波的相位產生一定差異（通過玻璃的光波的相位落后）。這個相位

差異稱相差（圖）o相差決定于光波所通過的介質的折射率之差與厚

度,等于折射率與厚度的乘積之差。介質越厚或折射率越大,光波減

速也越大。

光線的相差用肉眼分辨不出，只有利用石射和干涉現象,把相差變

為振幅差,即明暗之差,肉眼才能識別。

光波通過小顆粒（物體）后產生直射光和衍射光。后者的振幅較

小,相位延后（圖）。當在光學系統中,這種直射光和衍射光相遇時,根

據它們相位的異同，其振幅發生減小或加大的變化，使光線變暗或變

亮,這種現象稱為二涉。

相差顯微鏡的工作原理如圖和圖所示。光線通過聚光鏡下的環

狀光闌在物鏡的焦點面聚光。載片上的物體受來自環狀光闌的光線

照射,直射光在'處成像，而散發的衍射光一部分也由于物鏡透鏡的

作用在'成像。這時觀察者看到的是直射光和衍射光在'處干涉形

成的像。但如果使用的是普通物鏡，衍射光的相位落后波長，并且

比直射光的成像弱，因此干涉合成的光與背景光線的振幅差別很小。

相差顯微鏡的物鏡中安裝有相板。相板有推遲直射光或衍射光的相

位和吸收光量，以調節直射光或衍射光的亮度的作用。利用相差物

鏡的相板，把直射光推遲波長，使直射光和衍射光維持同一相位

（圖、）兩者的光波由于干涉現象，其振幅為二者之和。因背景只

有直射光，故被照射的物體比背景亮，稱明反差（）或負反差（）。如

用另一種相差物鏡的相板,把衍射光推遲波長,直射光的衍射光內相

位差變成波長，由它們干涉合成的光波振幅為二者振幅之差（圖、），

故被照射物體比背景暗，稱暗反差（）或正反差（）。

相差顯微鏡的裝置和普通顯微鏡不同者是前者聚光鏡下加環狀

光闌.物鏡里裝有相板。另外有調軸望遠鏡。

不同倍數的相差物鏡要用相應的環狀光闌。因此環狀光闌有X、

X、X、X等不同直徑的，裝配在一個旋轉盤內，按需要調換使用。

物鏡的相板上有一個半透明環，環和環以外的部分涂有不同的

物質,使通過的光線產生一定的相位差,以取得明反差或暗反差效

果。

用顯微鏡目鏡看不清光闌亮圈和相板的環狀圈。只有用調軸望

遠鏡方能看清楚,以便轉動調節裝置，使兩個環圈重合對齊。這樣才

能發揮相差顯微鏡的效能,看清活細胞的結構。

相差顯微鏡的光源要用強光,并使用波長較短的單色濾光玻璃,

通常用綠色玻片。

、熒光顯微鏡

某些物質受紫外線照射時發出熒光（可視光線），這種物質稱熒

光物質。例如維生素、核黃素、硫胺素等都是細胞內的天然熒光物

質。用熒光顯微鏡（）可以觀察這些熒光物質在細胞內的分布位置。

另外給細胞中加入熒光染料（如中性紅、甲基綠、0丫咤橙、口丫咤黃、

剛果紅等）可使細胞中某些物質受紫外線照射使誘發出熒光。例如固

定的切片標本,用。丫。定橙染色,經紫外線照射時可使細胞內的核糖核

酸（）發生紅色熒光,脫氧核糖核酸（）發生綠色熒光。

熒光顯微鏡通常采用高壓水銀燈等做為發生紫外光的光源。在

光源和反光鏡之間放一濾光裝置，把紫外線經過集光器照射到被檢

物體上使之發生熒光。此外,在熒光顯微鏡的接物鏡上方或日鏡下方

的鏡筒中裝設另一個濾光鏡，把剩余的紫外線吸收掉，以保護眼睛,

但使熒光能夠通過。這樣就可通過目鏡觀察細胞中的熒光現象（圖）0

熒光顯微鏡有時在光源與標本間所用的透鏡是用石英制成的,

反光鏡是涂鋁的或為石英三棱鏡。

,電子顯微鏡（）

可見光的波長制約了普通光學顯微鏡的分辨能力。人們在考慮

可能替換的光源。年有人發現了磁場對電子束的聚焦效應，接著魯

斯卡（）借助于磁力線圈把電子束聚焦于盡可能小的點上。這兩項研

究成果奠定了制作電子顯微鏡的基礎。年魯斯卡等人通過試驗證實

了和光學成象的幾何原理一樣，電子照射的物體也可以用磁電子透

鏡分二次放大的形式顯示出來。年魯斯卡制成了第一臺電子顯微鏡,

這臺電鏡被看作是當代各種型號電鏡的祖先。他得到了的圖象。由

于當時電鏡技術尚不完善，他們研究的物質經常被強烈的電子束碳

化。年魯斯卡極大的改善了電子顯微鏡，西門子公司開始批量生產

并成功的將電子顯微鏡推向了市場。年魯斯卡與掃描隧道顯微鏡的

發明人拜寧（）等一起被授于諾貝爾物理獎。魯斯卡在高齡得到這次

殊榮，是為了獎勵他在歲時發明的電子顯微鏡，他可能是歷史二最

老又最年輕的諾貝爾獎獲得者。

電子顯微鏡和光學顯微鏡的幾何成象原理雖然一樣，但分辨本

領卻有了顯著的提高.這首先是由于電子顯微鏡是用電子束作為照

明的光源.電子束的波長遠比光波的波長短.其次,電子顯微鏡使用

的是電子透鏡。光學透鏡是由玻璃制成的可見物質透鏡.與此相反，

電子透鏡不是肉眼可見的物質透鏡，他是由磁或電所行成的局部空

間來起透鏡的做用.正如光學透鏡使光線入射到玻璃時產生折射一

樣,電子束經過電子透鏡也會產生折射.電子透鏡共有三組,分別起

類似光學顯微鏡的聚光鏡、物鏡和目鏡（投射鏡）的作用。

在電鏡中，透過被檢物的電子束投打到熒光屏上，電子能轉

換成光能,成為我們可觀察到的影象。也可以讓電子投射在感光板上,

拍被檢物的相片。那么電子束是怎么成象的呢它和光學象的形成有

何不同？在光學顯微鏡中，成象的反差度,即亮度差,是因被檢物的

不同結構吸收光線的強弱程度不同造成的。就是說，入射電子與物質

原子碰撞后產生散射,被檢的不同部位有不同的散射度,這樣就形成

了電子象的濃淡.電子束的散射度是由物，本的密度與厚之積,以與加

速電壓的大小決定的。

電子顯微鏡的結構是由鏡筒（本體結構）真空系統和供電系

統三部份組成。

鏡筒是由照明系統，標本室,成象系統和照相裝置組成。最

上部是做為電子源的電子槍.給其中的金屬絲（鴇絲）加熱到達高溫

時電子就會從金屬表面發射出來。發射出來的電子帶負電荷,可背萬

伏的高壓電加速。電壓越高電子加速越大，電子運動速度大致與電

壓平方根成正比.加速的電子束經第一個電子透鏡（聚光鏡）集攏并

調節強度，照射到試料標本上.然后在第二個電子透鏡（物鏡）成象和

放大.物鏡是電子顯微鏡的心臟.第三個電子透鏡是投影鏡（目鏡）

它起把物鏡放大的象再放大的做用，即僅放大鏡的作用.

所以，從鏡筒的主要部分的構成看,電子顯微鏡和光學顯微

鏡是相似的。但由于電子顯微鏡中是使用電子束代替照明的光源,

故在構造上有以下主要特點：

（）空氣對電子束起明顯的阻礙做用，因此鏡筒必須保持高度

真空。所以電鏡要配備真空泵裝置。

0配備有加速電子用的高壓電源.

（）為電子束的波長單一化，配備有穩壓裝置。

（）為使電子象變成肉眼可見的光學象，在觀察部位上設置熒

光屏（觀察室）和照相室.

（）放大倍贊高的電鏡在物鏡和投影鏡之間還裝置一個中間鏡,

以多一級放大。調節中間鏡的電流，可在很大范圍內變動放大倍數。

電鏡觀察的標本必須是非常干燥的，同時切片必須很薄（一般

位）因為電子束是一中帶電的粒子流,進入被檢物體后與物質的池子

和原子核發生作用而散射，故只能透過極薄的物體。

近年來，電鏡的研究和制造有了很大的進展。一方面電鏡的分辨率不

斷提高，透射電鏡的分辨率由最初魯斯卡發明電鏡的提高到了一，晶

格分辨率已接近;另一方面除透射電鏡（掃描電鏡（）分析電

鏡（）外，還發展了其他種電鏡。如高壓電鏡（），加速電壓在以上

的電鏡即為高壓電鏡，如果電壓超過就稱為超高壓電鏡。目前世界上

最高的加速電壓可以達到，電鏡體積龐大，相當于二層樓房的高度。

高壓電鏡主要特點是穿透力強，可用于觀察較厚的樣品，整體培養的

細胞不需超薄切片即可觀察內部的三維微細結構，如微絲、微管等。

.掃描隧道顯微鏡（，簡稱）。

人類永遠不會停止對微觀世界的探索，在電子顯微鏡發明大約

半個世紀后，年拜寧()等又發明了掃描隧道顯微鏡它的成象原理

完全不同于光鏡和電鏡。。基于量子力學原理，研究者們發展出了

一系列高分辨顯微鏡。這些發明為人類打開了通向微觀世界的一扇

又一扇大門，使人類真正進入了納米世界。

是這類顯微鏡的代表，它能探索微觀世界物質表面原子排列的

狀況。的探頭有一根探針，針尖只有一個原子的大小，探針的針尖

接近但不接觸觀測樣品的表面并且同時進行掃描.根據量子物理學

原理，當針尖上的原子與樣品表面的原子的距離小于納米時，針尖

和樣品間會產生隧道效應，即產生隧道電流.通過記錄隧道電流的變

化就可以獲得樣品表面原子排列的情況并把它轉化為圖像。

具有其他顯微鏡不可比擬的功能和特點：0具有高分辨能力。

它平行于物體表面的分辨率,即側分辯率可以達到一，而垂直于物體

表面方向的分辨率,即縱分辯率可以達到納米。(2)具有搬移能力。

不僅可以直接觀察物質表面的原子排列情況，而且還可以通過探針

對物質表面的原子或分子進行搬移.從而人們可以按著自己的意愿

在原子水平上進行重構或組建新的材料。0具有刻蝕能力。能對

物質表面進行刻蝕，通過計算知道一個大頭針大小的地方就能記錄

下來象“紅樓夢”那樣的一部書.這為制作高密度信息儲存文件和納

米的電子原件提供了新途徑。0具有在多種多樣下的工作能刀。

對于生物學研究尤其重要的是可以在真空、大氣等多種條件下工作。

()不破壞樣品，在工作時既不接觸樣品又沒有高能電子束的轟擊.

因此，可以避免樣品的變形。總之，的觀察到的原子是目前人類所

能直接看到的微觀世界的最小尺度，這項技術已廣泛應用于生命科

學的研究領域。用得到的照片使人類第一次清楚的看到了它的表面

形態。可以肯定，等基于量子力學原理倉」建的顯微鏡將在納米生物

學研究領域發揮越來越重要的作用。

第二節細胞組分與功能的分析方法

首先人們利用一系列顯微鏡對細胞與其結構進行了卓有成效的

觀察，并且結合一些化學手段確定了細胞器與一些大分子聚合物在

細胞中的排布.如對細胞膜、細胞核、染色體、細胞分裂等的觀察。

在深入研究中人們不禁要問，這些細胞結構的化學組成如何？它們

在執行著什么樣的功能？要解決這些問題只靠觀察手段就不夠了。

隨著科學技術的發展人們逐步創造了一系列分析細胞組分與功能的

方法。這些方法大致可分為三種：第一種方法是把細胞與大分子分

離出來進行研究，即分離分析法；第二種是不破壞細胞或組分，在

原位進行組分和功能的研究，既原位分析法.第三種則是在細胞或細

胞組分生活狀態下進行的動態分析法。當然觀察方法和分析的方法

并沒有嚴格的界限。正是觀察方法和分析方法有機的結合才使得細

胞生物學有了長

足的進步。

一、分離分析法

、細胞分離技術

要對不同類型的細胞與組分進行詳盡的分析研究，首先要

得到一定量的同一類型的細胞，進而才能得到純化的細胞器與其它

細胞組分。

可以用蛋白水解酶（胰蛋白酶和膠原酶）和鈣整合劑乙二

胺四乙酸（）處理組織，從中得到大量分上散較好的細胞懸液。再利

用細胞不同的物理性質，通過沉降和離心把大小不同的細胞或輕重

不同的細胞分離開。

利用免疫技術分離細胞是比較先進的方法。將某一種類型

細胞表面特異性抗原的抗體與某種材料結合（如膠元、多糖小珠或

塑料）形成集合表面。這樣當各種細胞通過這一集合表面時，只有

被這種抗體識別的細胞才能粘附在集合表面，然后用輕微的振蕩或

用酶破壞可溶性基質（如膠元）就可將同一類型的細胞回收。

目前流式細胞術和分類術（，）是一項較新的開拓性技

術，可以用此項技術來分離細胞。首先要用熒光染料偶聯的抗體來

標記需要分離的細胞，然后招這種混合的單細胞懸液樣品和鞘流液

（蒸憎水或等滲鹽水）由氣體壓力裝置送進流動室，使樣品和鞘流

液同軸流動。鞘流管末端成圖錐形，具尖端有一直徑的孔，這樣迫

使細胞排成單行流出鞘流管尖端小孔進入樣品流與激光束交叉區既

檢測區。。通過振動蕩流動室時細胞流束已成為小水滴。荷電環系

對帶有熒光細胞的小水滴充電。當帶電小水滴通過高壓偏轉板時，

充電的小水滴就會偏離原來的流向，而不帶電的小水滴（其中含有

未標記細胞）不偏向。收集偏向的小水滴就可以得到大量標記的特

殊細胞。

現代流式細胞術是結合計算機科學、激光技術、單克隆抗

體制劑、定量細胞化學等的一項綜和技術，它不但可以分離細胞而

且還可以測量細胞的多種參數，其中包括象細胞大小、形狀等不經

染色處理就可直接測量的固有（）參數，還包括經過的熒光劑染色后

可測出的細胞含量、含量和細胞總蛋白量等的外源（）參數。例如當

排成單列的細胞通過激光束時，熒光染色的單個細胞受到激光束的

激發，會產生熒光信號，信號檢測器可測定出標記細胞上的熒光強

度。從而對許多外源參數進行測定（表）。

流式細胞計可在小時內分類收集一億八千萬個細胞，純度

可達一。可在分鐘內測出個細胞的、、蛋白質含量和細胞體積。此

儀器應用廣泛但價格十分昂貴（圖）。

、細胞器與生物大分子的分離技術

通過細胞分離方法可以得到純化的細胞群體，并且可以在細

胞整體水平上進行研究。如果要深入研究各種細胞器與細胞內含物

就需要用低滲、超聲波等方法使細胞崩解，造成細胞勻漿，這一過

程叫做細胞的勻漿化（）。然后便可以根據需要招亞細胞組分或各種

顆粒分別分離出來。分離的方法主要應用的是離心技術。

離心機是一種借離心力把顆粒從中心向外推移的機器，當

離心力超過地球引力時，懸浮在液體里的顆粒就會離開中心向外沉

降。用普通離心機可以很快使紅細胞沉降下來，也可把鮮奶分成奶

油和較重的脫脂妞兩部分。然而要分離亞細胞結構只有普通離心機

是不夠的。年代，瑞典化學家斯維德伯格（）發明了一種超速離心

機，它的轉數可達每分鐘十幾萬轉，產生的離心力相當于地心引力

的幾十萬倍。超速離心機的出現極大的推動了細胞生物學的研究.

有了一系列離心機還不夠，為了更精確的分離研究對象，人們

還創造了各種離心方法以適應不同研究層次的需要。

0差速離心法（）

差速離心法是利用不同的離心速度所產生的不同的離心

力，將各種亞細胞組分和各種顆粒分離開.勻漿液在離心場中，不同

大小的顆粒沉向離心管底部的速度不同，當離心力不高并且離心時

間不長時，細胞核首先沉到管底。取出上清液進行離心并加大離心

力，這時可分離出線粒體，這樣進行下去不斷增大離心力，最后可

分離出核糖體（圖）O怎樣對分離出的物質進行純度鑒別呢？一般

有兩種方法，一種是用電鏡作形態學鑒定。更為簡便的是利用各種

細胞器的特征酶或特殊分子做生化分析。

用差速離心法對細胞器的分離只是初步的，要取得比較純

的細胞器還需要進一步的分離純化。另外，經離心分離出核穗體以

后所剩的上清液是可溶性部分和極微小的顆粒與一些生物大分子所

組成。這些成分需要用更產格的超速離心才能分離出來，為此人們

又發展出了密度梯度離心法。

（）密度梯度離心法（）

這種方法是利用離心溶液形成梯度來維持重力的穩定性和抑制

對流的。這需要在溶液中加入化學惰性物質，如蔗糖、甘油與鹽類

（如氯化艷、氯化鋤）。這些物質不影響分離物的物理與化學性質,

分離物的密度一定要在梯度柱密度的范圍內，經高速離心后，不同

密度的分離物就會集中在等密度帶中而得到相互的分離.

①蔗糖密度梯度離心這種方法比較適合于對細胞器的進一步

分離（表）。這需要預先制成不同濃度的蔗糖液（一般濃度在一

或一）。用一定的方法在離心管中做成自下而上遞減的濃度梯度，

將待分離的懸液加在最上面，經超速離心，不同大小、密度的顆粒

由于沉降速率不同，它們揩會分別集中在不同的區帶中，這樣就達

到了分離它們的目的（圖）o

②氯化艷（）密度梯度離心氯化艷是重金屬鹽類，它的溶解度

高，其溶液密度可達，它在離心場中會自動形成密度梯度。用來分

離的物質可直接和金屬氯化銅溶液混合，然后進行等密度離心。這

種方法適合于測定大分子或顆粒的浮力密度（圖）。也就是說，

它是根據檢測對象的浮力密度的差異而不是根據他的大小來進行分

離的,比如線粒體、溶酶體或過氧化物酶體的大小相近，但密度不同,

我們可以根據浮力密度對它們做進一步的分離。這種方法的精確和

靈敏是令人信服的，早在年人們就用氯化艷密度梯度離心技術將含

有15標記的細菌和未標記的細菌分子分離開，這個經典實驗直接證明

了的半保留復制。

利用離心特別是超速離心技術對細胞與其組分進行分離分析,

在細胞生物學的研究中起著極重要的作用。例如，從對分離純化出

的線粒體和葉綠體的研究中人們了解到了這些細胞器在能量轉化過

程中的作用。用分離分析方法可以使內質網和高爾基體的封閉泡互

相分離開。粗糙內質網經分離形成的小泡稱微粒體0,它給內質網

的研究帶來了極大的方便.正是對微粒體分離研究使我們得到了關

于分泌蛋白合成機制等許多成果。又如，在蛋白質合成機制的研究

中，當初發現在細胞粗提液中能使翻譯成蛋白質。然后將粗提液分

步分離，依次得到了核糖體、和各種酶，是否是這些物質構成了蛋

白質合成體系呢？我們可以向這個體系中加入或不加入各種純組

分，這樣就可以研究出每個組分在整個過程中發揮準確作用。事實

上，在研究細胞與其組分的功能過程中,分離分析的方法是在構建一

種非細胞體系（）。這種體系來源于細胞，但不具有完整的細胞結

構，它包含了部分細胞提取物，這些提取物能夠進行正常的生物學

反應。用這種方法使細胞中各種生物學過程相互分開，不受細胞中

復雜副反應的干擾，因而可以確定這些生物學過程的詳細的分子機

制。近年來，非細胞體系有了更廣泛的應用，以非洲瓜蟾卵提取物

非細胞體系為例，來自非洲瓜蟾的卵首先去膠膜后，經活化、裂解、

然后超速離心，去掉上層脂類和下層卵黃、色素顆粒后剩下的提取

物即是非細胞反應體系。向該體系中加入外源，孵育一段時間后即

可重構成新的細胞核。人們利用這一體系研究探討了許多細胞生物

學的重要問題。女［細胞周期調空、復制，核膜與染色質組裝、核質

運輸等。

需要說明的是，離心技術有二個主要參數.一是離心力，一般用

離心機的每分鐘轉數。來表示。文獻中也經常直接用離心力（）來

表示。它們之間的換算關系是：。二是沉降系數0,它是用

來表示大分子沉降速度的，各種大分子顆粒均具有一定的沉降系數。

為了紀念諾貝爾獎獲得者斯維德伯格，沉降系數的單位用了他的名

字命了名，即斯維德伯格單位（），秒，簡稱。

二、細胞的原位分析方法

人們除了用分離的方法對細胞進行研究外，同時還發展出了一

系列對細胞進行原位分析的方法。顧名思義，這種方法要求被測定

的物質必須保持在細胞的原來位置不動。一般的細胞化學方法都屬

于這一類。比如為了測定蛋白質、核酸、多糖和脂類等細胞組分，

通常利用一些顯色劑與被檢物質中一些特殊基團特異性的結合，通

過這種結合所產生的顏色和顏色深淺度的不同來判斷各種物質在細

胞中的分布和含量。四氧化械與不飽和脂肪酸反應呈黑色，用以證

明脂肪滴的存在。用氮汞試劑與組織中蛋白質側鏈上的酪氨酸殘基

反應,形成紅色沉淀。這是著名的米倫()反應。原位分析的方法很多,

我們在這里僅作一簡單的介紹.

免疫細胞化學法

在一些經典的蛋白質細胞化學反應中，如米倫反應、重氮反應

等，都只是一種一般蛋白質的定位反應，如果想了解其一特殊蛋白

質的情況需要用特殊蛋白質的原位分析法。近些年發展起來的免疫

細胞化學法。開創了這方面研究工作的新領域.這項技術主要是利

用抗原和其相應的抗體能作特異性結合即免疫反應這一原理，來定

位組織或細胞中蛋白質抗原成分的一類技術。我們可以利用這一技

術來對蛋白類抗原進行定位定性分析。雖然抗原和抗體的結合具有

高度的敏感性和特異性，但是抗體與抗原的結合是看不見的，為了

解決這一問題，早在四十年代巧妙的使熒光素和抗體項結合，然后

用這種被標記的抗體同被檢測的抗原進行免疫反應，這樣就很容易

在熒光顯微鏡下檢測到組織或細胞中的抗原物質。從而創建了這項

技術,后來，用于標記抗體的物質不斷得到改進，先后出現了免疫酶

標記技術、免疫鐵蛋白技術。特別是年和創造的免疫膠體金技術是

日前最受歡迎的免疫電鏡技術。這項技術的特點是，膠體金能迅速

而穩定地與蛋白質即抗體相結合.這是一種由于蛋白質被膠體金表

面負電荷吸引而結合的過程。這種結合主要是物理過程，不會影響

蛋白質的活性.另外金顆粒容易識別，能產生強烈的二次電子，是理

想的掃描電鏡的標記物。今天，免疫電鏡技術已得到了廣泛的應用,

如分泌蛋白的研究、胞內酶的研究、一些結構蛋白的研究，包括膜

蛋白的定位與細胞骨架蛋白的定位等。膠體金不但能與免疫球蛋白

即抗體相結合形成金標記抗體，而且還可以同其他蛋白相結合形成

金標記酶、金標記凝集素等。因此金標記酶不僅可用于光鏡和電鏡

的免疫細胞化學技術，還可以用于其它物質的檢測。

孚爾根。反應

年德國化學家孚爾根()在研究核酸時找到了一種方法，

它只能使著色，而不著色。他發現在細胞核里，特別是在染色體里。

他用此方法證明，普遍存在于動植物細胞核中。后來，人們稱這種

能特異顯示存在部位的方法為孚爾根反應。這一技術的基本步驟是:

首先用酸處理已固定好的材料，酸水解可以除去,保留，并在的膘吟

一脫氧核糖昔鍵水平上除去瞟瞪，使脫氧核糖的醛基暴露。然后用

希夫試劑()處理，所暴露的自由醛基就會與希夫試劑起反應而呈現

紫紅色.在顯微鏡下可以看到紫紅色的核，無色的胞質和核仁,即細

胞核的福爾根反應為正，而胞質為負反應。核中異染色質區為強的

正反應，核仁為負反應。

原位雜交技術

福爾根技術可使我們了解到一般在細胞中的存在位置.但

如果我們想知道某段特殊核甘酸順序在染色體上或在細胞中的確切

位置，福爾根技術便無能為力了，這需要用原位雜交技術。

原位雜交（）是一項核酸分子雜交技術（）。其原理

是，兩條具有互補核甘酸順序的單鏈核苜酸分子片斷,在一定條件下

通過氫鍵的結合形成一一或一的雙鏈分子。進行原位雜交首先要制

作探針，即對一段特異的核酸序列進行放射性同位素或熒光素的標

記.然后要把所要研究的樣品如細胞或染色體固定于載玻片上,并使

或原位變性,再注入探針，使樣品與標記的核酸進行原位雜交反應。

將未反應的標記核酸分離后，用放射自顯影術或螢光技術對雜交分

子進行觀察和定位。例如，年等從細胞的多核糖體中分離出，并以儂

標記制成探針，并測探出的基因在染色體上的位置。具體過程是這

樣的，首先對載片上的人體細胞中期染色體進行原位變性，并加入

探針?這時，探針只能和產生它的模板互補，即進行分子雜交，而其

他部位則不行。放射自顯影暴露二個月后，發現在所有制片的染色

體組中，一對一號染色體均被標記，標記的位置是短臂末端，這說

明基因位于第一號染色體的短臂末端。原位雜交技術首先是在光鏡

水平上發展起來的。近年來隨著免疫電鏡技術的不斷進步，電鏡原

位雜交技術也得到了發展。電鏡原位雜交和光鏡原位雜交的基本原

理是一致的，區別是探針的標記物不同，一般以生物素等一些小分

子取代同位素或螢光素來標記特異核甘酸序列來制作探針進行原位

雜交。然后用與膠體相連的生物素的特異性抗體對原位雜交樣品進

行免疫反應，這樣就可在電鏡下觀察到探針的位置，從而把特異核

酸序列的定位與細胞的超微結構分析結合了起來。

三、細胞動態分析的方法

事實上，在生活狀態的細胞中生物大分子總是呈現動態變化

的。人們早就希望能找到一些方法,可以對生物大分子進行動態內分

析研究.

第一位在這個方向上努力的是德國生物化學家努普（）。早

在年他就用苯環標記脂肪分子對脂肪代謝進行研究，得出了在體內

脂肪代謝過程中脂肪分子每次斷裂下兩個碳原子的結論。這個結果

被年后的進一步研究所證實。年德國化學家帕內斯0等人想到可

以用放射性同位素標記生物大分子來研究大分子在細胞中的活動和

代謝情況。這樣就有了放射自顯影技術0O

放射自顯影技術是利用放射性同位素的電離輻射對含有乳膠的

感光作用來研究生物大分子在細胞內代謝過程的一種技術。開始，

帕內斯等曾用放射性鉛作為標記，然而鉛的同位素極容易打亂活細

胞正常的代謝過程。后來逐漸摸索到了一些常用的同位素（表）。

這些同位素都是細胞生命活動中基本的起重要作用的元素。放射性

同位素技術所以能被應用是由于存在兩個基本條件，一是放射性同

位素不影響機體的正常代謝。二是機體組胞對某種元素與其不穩定

同位素“一視同仁”O該項技術的應用使得細胞生物學取得了很大

的進展.例如象檸檬酸循環，尿素循環過程的發現；首次證明核仁是

合成的場所；半保留復制的證明等都是應用這項技術得到的成果。

制造帶有放射性同位素的小分子并不復雜，只要把普通化合物

放在核反應堆里用中子轟擊，取出后就帶有放射性同位素了。如今

用于標記的幾乎所有小分子前體都可以通過商品銷售得到。囚此現

在這項技術的應用已十分廣泛。這種方法的基本過程是，先使紐胞

含有示蹤原子（例如

3143214323214323232143232323214323232323214323232323232M323232323232321132323232323232321432323232323232323214323232

32323232323232M3232323232323232323232I4323232323232323232323232M32323232323232323232323232或其他）的化

合物，然后把這種組織細胞做成切片，使液體乳膠涂于其上，經過

一定時間的暴光（即放射性物質放出的射線落在乳膠上使其溟化銀

還原而析出金屬銀，這個過程稱為自顯過程，亦稱曝光），再進行

顯影和定影。根捱乳膠上出現的銀粒在組胞中的位置，便可判斷放

射性物質（或由這種放射性物質以與其他物質合成的化合物）在細

胞內的分布.這種方法的基本過程是,先使細胞含有示蹤原子的化合

物，然后把這種組織細胞制成切片，使液體乳膠涂與其上，經過一

定的時間暴光（即放射性物質放出的射線落在乳膠上使其溟化銀還

原而析出金屬銀,這個過程稱為自選過程，亦稱暴光），在進行顯影和

定影手續。根據乳膠上出顯的銀粒在細胞中的位置，便可判斷放射

性的物質（或由這種放射性物質以與它物質合成的化合物）在紐胞

內的分布.

自顯過程的具體操作步驟是：（）:將染色或未染色的切片標本

先覆蓋一層明膠保護膜；（）在暗室聘凝膠;士液體加熱融化，然后招盛

乳膠的小杯放入攝氏度的水浴鍋中，再招切片浸入乳膠內片刻；（）

取出載片，立于染色缸內自干，或揩去載片被面的乳膠，平放在溫臺

內烘干；（）將干燥的乳膠片放入暴光暗匣內,再攝氏度低溫下暴光；（）

顯影定影后，再用常規方法制片,最后用樹膠封藏.

制備電子顯微鏡的放射自顯影標本的程序是把用3等放射性同

位素標記的化合物引入組織細胞,制成超薄切片,放在有支持膜（火

棉膠加碳）的載網二，噴碳膜后再涂一薄層核乳膠。然后放在暗處暴

光（暴光時間的長短視條件而不同，例如溫度,切片中放射性物質的

量和半衰期等，常要靠實踐來確定，一般要幾周乃至數月的時間），

暴光后進行顯影定影和沖洗.再經電子染色制成的標本即可在電鏡

下觀察（圖）o

放射自顯影術不但在定位研究上有靈敏度高，定位精確的

特點，它還是動態研究中最有效的手段。針對活細胞一般都采用放

射自顯影的追蹤標記也稱脈沖標記（-）的方法。這種方法是先用帶

同位素標記的前體分子摻入到生活細胞的代謝中去，標記一段時間

后便把它徹底洗掉，再用不帶標記的前體分子代替。然后在不同時

間取樣并分析同位素的量和它所在的位置，從而了解它們的代謝途

徑。許多生物大分子在細胞中的合成、修飾、排出、蓄積、更新等

作用的機制和部位的研究結果都是利用脈沖標記的方法得到的.

第三節細胞培養和單克隆抗體技術

-細胞培養

在細胞生物學與其它有關細胞的研究中，如何取得充足的高質

量的細胞始終是一個需要解決的基本問題。特別是高等動物或人的

細胞.從生物個體上取細胞不但費用貴而且不方便。解決這一問題

的有效方法就是體外培養細胞。實際上人們早就開始了細胞的體外

培養工作。

年，德國學者發現雞脛細胞可在溫熱的生理鹽水中存活一段時

間，他稱這項試驗為，即體外種植的意思。年美國動物學家從

兩棲類胚胎中取下一塊神經管組織，放在一滴淋巴液中作懸滴培養，

他觀察到了神經管分化或神經元，并且向培養液中伸出了軸突。這

些可以說是細胞培養的開拓性工作。從這些工作可以看出細胞培養（）

是指將細胞從機體中分離出來，進行體外培養的技術。近年來，這

項技術得到了很大的發展，許多動植物細胞都可以在人工配制的特

定的培養基中存活，有的培養細胞還可以分裂增殖甚至分化。目前

細胞培養技術已在細胞生物學，分子生物學，遺傳學，免疫學等許

多領域中得到廣泛的應用。

動物細胞培養技術

人們在研究細胞培養過程中發現，雖然動物細胞的種類繁多，

性質各異，但它們在體外培養的生長方式上大致可分為二種類型.一

類是貼壁依賴性細胞，大多數動物細胞都屬這一類型.另一類型是非

貼壁依賴性細胞，比如來源于血液，淋巴組織的細胞，許多腫瘤細

胞屬于這一類型。

0貼壁培養

剛接種的細胞常成圓形并游離于培養液中，經數十分鐘到數小

時后細胞從游離期進入貼附期，細胞伸展并貼附于瓶壁。這叫細胞

貼壁。圓形細胞一經貼壁就立刻鋪展成多種形態并開始有絲分裂，

細胞在分裂過程中并沒有停止移動，由于細胞數目不斷增多，細胞

間的距離也越來越小了。平展生長數天后就會形成致密的細胞單層.

這時細胞彼此之間已經接觸，這使細胞的運動受到抑制，這種現象

叫接觸抑制()。然而接觸抑制實際上只抑制了細胞的運動而并沒有

抑制細胞的分裂。所以我們看到細胞長滿生存平面后仍能繼續分裂,

直到細胞達到一定密度，才停止分裂。這后一種抑制叫密度抑制()。

這時如果要細胞繼續分裂增殖就要進行與時的分散，分瓶接種于新

鮮培養基中繼續培養。這一過程叫傳代培養OO這種直接從有機

體取出的細胞培養至第一次傳代為止，稱原代細胞培養。原代培養

的細胞一般傳到代左右，大部份細胞才會進入退化期，出現細胞的

大量死亡。有人據此而把培養代以前的細胞統稱為原代細胞培養。

經過代培養的細胞仍有極少數存活下來，這些細胞往往會繼續順利

傳代一次。雖然這些細胞的形態有了很大的變化，但它們仍保持著

染色體的倍體數量和接觸抑制的行為。多數學者把這種傳代細胞稱

為細胞株()O經過次左右傳代的細胞，已不能再繼續正常生長了。

然而在“漫長”的細胞傳代過程中可能會有極少數細胞發生了帶有

癌變特點的遺傳性突變.發生突變的細胞可能無限制的進行分裂和

增殖，這種能無限傳代的細胞叫作細胞系O0將初始細胞在體外

轉化成能無限傳代的細胞的過程叫作建系()這些細胞被稱為轉化

細胞。轉化細胞的特點是染色體數量明顯改變，一般呈亞倍體或非

正倍體。細胞失去接觸抑制行為，容易傳代培養。著名的細胞就是

年從一位名叫的美國婦女的子宮頸上皮癌分離出來的細胞系.目前

這一細胞系已遍布世界各地的實驗室，但仍沒有壽終正寢的跡象“

表列出了一些常用的細胞系。

細胞系細胞來源

纖維細胞（小鼠）

纖維細胞（敘利亞）

上皮細胞（人）

腎細胞（）

卵巢細胞（中日）

上皮細胞（袋）

成肌細胞（大鼠）

漿細胞（小鼠）

體外培養的細胞畢竟和體內的細胞的生長環境有很大的差別，

因此它們的細胞形態也會有較大的變化,體外培養細胞一般會呈現

兩種基本形態：成纖維樣細胞（）與上皮樣細胞（）

0懸浮培養

非貼壁依賴性細胞如雜交瘤細胞等比較適合于懸浮培養，它是

指細胞在培養器中自由懸浮生長的過程。這種方法是在微生物發酵

的基礎上發展起來的。但由于動物細胞沒有細胞壁的保護，它不能

耐受劇烈的攪拌和通氣。因此在許多方面又與發酵培養不同。

懸浮培養的優點是設備結構簡單，有成熟的理論計算，可以借

鑒微生物發酵的部分經驗。它的不足是懸浮培養的細胞密度較低。

轉化細胞懸浮培養有潛在的致癌危險等。

二植物細胞培養

德國植物學家從年開始共做了年的細胞培養試驗，從多種植物的

葉柵欄組織，莖髓薄壁組織，表皮等分離出單細胞進行培養相信植

物體細胞有再生完整植株的可能性。遺憾的是由于當時的技術條件

的限制，他始終未能觀察到培養細胞的分裂現象。真正的植物紐胞

培養技術是世紀年代至今逐漸發展起來的。目前這項技術正在農業、

醫藥等領域得到了廣泛的應用。并取得了極大的效益。據報道，全

美國的藥方中四分之一是含有來源于植物的藥品。

植物細胞培養根據不同對象可分為原生質體培養和單倍體細胞

培養。

原生質體培養去壁的植物細胞稱原生質體（）。原生質體類

似動物細胞。它既可供基礎理論的研究，也可作應用的研究.其主要

方法步驟是：①原生質體的制備；②原生質體的培養；③原生質體

培養到細胞培養的過渡；④愈傷組織或脛狀體的形成；⑤植株再生

（圖）.也可以用不同植物的原生質體進行融合與體細胞的雜交，

由此而獲得體細胞雜交的植株。近年來轉基因植物的發現也是由于

首先培養轉基因的植物細胞獲得了成功。

單倍體細胞培養此方法主要用花藥在人工培養基上進行培

養，可以從小父子（雄性生殖細胞）直接發育成脛狀體，然后長成

單倍體植株；或通過愈傷組織誘導分化出芽和根，最終長成植株。

單倍體細胞培養主要應用于植物育種工作，并已取得很大的成就。

三單克隆抗體技術

二十世紀六、七十年代，麥爾斯坦0和柯勒0在對抗體深

入研究過程中遇到了一個困難，他們必須得到大量的試驗材料即單

一特異性的抗體,否則就無法進行對抗體的活性分析.然而人或動物

血清中，存在大量十分混雜的各種各樣的抗體。要解決抗血清的異

質性問題，要求有一個永久抗體產生系，以無限制地提供抗體。而

體外培養條件下淋巴細胞的壽命很短。事實上自然界中存在能分泌

均質的免疫球蛋白又永不死亡的細胞，它們是在漿細胞階段發生了

成瘤轉化的淋巴腫瘤細胞。這種細胞很容易克隆和體外培養。遺憾

的是他們始終沒有發現能與淋巴腫瘤細胞分泌的抗體的相應抗原。

因此不能用來進行抗體分析。年麥爾斯坦和科勒合作，試圖培養一

株骨髓瘤細胞，使之能永久產生針對一個已知抗原的抗體。

他們用羊紅細胞免疫小鼠，取小鼠的脾細胞和一種小鼠的骨髓

瘤細胞，在病毒或細胞融合劑聚乙二醇（）的作用下，使脾細胞中

的淋巴細胞和瘤細胞融合為一個雜合細胞.這項工作獲得了成功，他

們把這種雜合細胞稱作雜交瘤細胞.然而在實際得到的培養液中并

非只有雜交瘤細胞，它們是淋巴細胞，瘤細胞和雜交瘤細胞的混合

體.為此他們應用年創立的選擇培養基對混合細胞進行培養選擇。其

選擇原理是這樣的。正常細胞在培養基中合成有兩條途徑，一是主

要合成途徑，另外還有一條是補救旁路。主途徑是利用培養基中的

糖和氨基酸這些簡單的含碳含氮復合物來合成瞟吟與邀咤核甘酸。

這一過程需要四氫葉酸來供應甲酰基。這一途徑可以被葉酸拮抗物

氨基瞟吟所阻斷；細胞的補救途徑是通過次黃瞟聆鳥瞟吟磷酸核糖

轉移酶0和細胞。密淀核苛激酶（）,揩核甘酸前體合成核甘酸，

以提供合成的原料。（圖）

麥爾斯坦用于融合的腫瘤細胞是經過選擇的缺失次黃瞟峰磷酸

核糖轉化酶的即陰性細胞，它是補救旁路途徑經酶缺失的突變纖胞

系，這種細胞在選擇培養基中不能存活，這是因為培養基中含有氨

基瞟吟，它阻斷了的主要合成途徑，同時這一細胞系又缺失補救途

徑所需要的。正常淋巴細胞在體外的壽命很短，所以它也不能在培

養基上有效傳代，只有雜交瘤細胞能夠生存和傳代。因此很容易在

培養上選擇雜交瘤細胞.這樣得到的雜交瘤細胞既能無限的增殖又

可分泌抗體.但這里還存在一個問題，由于抗原大分子有不同的抗原

部位，所以我們這時得到的實際是多克隆抗體。要從產生各種不同

抗體的各種雜交瘤混合群體中篩選出產生特異抗體的雜交瘤還要經

過有限稀釋法，通過檢測單細胞雜交瘤生長小孔的上清液來選擇出

需要的單克隆抗體產生細胞。然后,再進一步進行單細胞培養，即克

隆化。多次克隆化可淘汰遺傳性狀不穩定的雜交瘤，從而得到能產

生高效單克隆抗體的雜交瘤細胞株。這個原本只是為了得到試駒材

料所設計的技術流程單克隆抗體技術這個理論研究的副產品,現在

己被廣泛的應用，它成為分析蛋白質分子結構與功能的分子生物學

方法，它為免疫診斷和治療開辟了新的途徑年代初，單克隆抗體診

斷盒開始成為受歡迎的商品，有著廣泛的市場.這是生物技術最早開

發的項目。這說明，在許多看不出有任何商業價值或醫學重要性的

理論研究中，可以衍生出意想不到的巨大的實用價值。麥爾斯坦、

科勒和杰尼()等三人也為此共同獲得年諾貝爾生理學獎。

第四節常用分子生物學技術

分子生物學是當前生命科學發展的主流.其主要內容之一是對蛋

白質和核酸大分子結構的研究.和這些研究相關的技術曾經歷了一個

戲劇性的發展過程.

年和提出雙螺旋結構模型.同年英國科學家確立了胰島素的一級

結構.雖說蛋白質結構的研究走在了前面，但當時這個僅由個氨基酸

組成的最小的蛋白質化學結構的測定經歷了年才得以完成.七十年代

初期對蛋白質氨基酸序列分析的研究日臻成熟而對核酸堿基序列分

析的研究進展不大,那時測定一個僅由二十幾個核甘酸組成的鏈,需

要一個熟練的研究者工作三年.七十年代中期核酸測定工作有了關鍵

性的突破年建立了快速測定序列的“加減法”,后來經過改進又稱為

“末端終止法”年美國科學家等又建立了快速測定序列的“化學斷裂

法”.這些先進分子生物學技術的應用使得不但象噬菌體那樣上萬個

核甘酸序列分析成為可能,甚至象人的單倍體細胞基因組的上億個核

甘酸序列的分析也指日可待了.近些年,蛋白質氨基酸序列分析技術

卻顯得相形見細.甚至目前一些蛋白質序列的分析大都依靠其的堿基

順序.一般先以某蛋白質的已知部分肽段的氨基酸順序為基礎,合成

一段相應的探針,然后用分子雜交技術從基因組文庫中克隆出該蛋白

質的對應基因.再根據堿基序列推導出相應蛋白質的氨基酸序列來.

由此看來,有關核酸序列的分析技術是當前最受關注的分子生物學技

術.在這里我們僅對此做一般的介紹，以便對分子生物學技術有一個

大概的了解.

—基因組文庫的構建

基因組()在分子水平上是指某一機體或某一機體的染色體所

含的全部.基因組文庫()是指一個機體全套的基因組克隆.建立基

因組文庫是為了能夠方便的提取某種特殊的基因，以便對其進行研究

和應用.如何構建基囚組文庫呢？首先通過一定的手段如用限制性內

切酶,將全部基因組的切成片段,并且招每一片段都與載體拼連成一

重組.然后，1各所有重組分子分別引入宿主細胞并進行繁殖.結果是每

一個細胞集落（）含一特定基因組片段的重組分子，也稱為基因組克

隆（）（圖）這樣就建立起了某一機體的文庫。

從理論上講基因組文庫的建立是可行的，但在實際操作中卻

要復雜的多。通過內切酶從某種哺乳動物的全部基因組中可以得到58

片段.在克隆過程中可以產生上百萬個不同的載體細胞集落.每個集

落細胞中都含有插入不同的片段的質粒片段的分布是隨機的.有些片

段可能只是基因的一部分,有的片段可能不編碼.如果

對某種特殊蛋白質的基因進行研究就要用被標記的一段探針從文庫

中揩研究對象選擇出來.

二文庫的構建

如果我們從細胞中提取某種，并根據堿基配對的原則在體外由

逆轉錄酶催化合成相應的，這種就稱之為即互補（，）.由逆轉錄酶

合成的單鏈分子可以利用聚合酶轉換成雙辭分子，并可通過質粒引入

宿主細胞進行繁殖,形成克隆（圖）.如果具有某一特定細胞的全部克

隆，它就被稱為文庫（圖）.是從反轉錄而來的，就是說只有細胞內

存在的才能建立起相應的克隆.另外,同一機體不同類型的細胞、同一

類型不同發育階段的細胞、甚至不同生理狀態下的細胞的基因表達都

會有所差異,細胞內出現的的種類和數量也會不同.所以,同一機體細

胞的文庫并不一樣.這一點與基因組文庫有所不同.

文庫的建立至少有兩個意義.其一,克隆可以在宿主細胞中合成

編碼的蛋白質,人們利用這一手段可以生產出大量有用的蛋白質,如

胰島素、干擾素和生長素等.其二,用帶有放射性標記的單鏈即核竣探

針去對基因組文庫的克隆系統進行分子雜交，從而可以選擇出某一特

殊序列的片段.

三特異核酸序列的研究方法

核酸分子雜交無論是建立基因組文庫,還是建立文庫,其

目的都是為了能對某一特殊基因進行方便和有效的研究和應用,我們

知道用核酸分子雜交這一靈敏的方法可以從文庫中檢出特殊的核昔

酸序列.如何利用探針檢出特異的呢

0印記法世紀代中朗，英國科學家提出了印記分析法.這一方

法的基本程序是,①酶解,將高分子量用限制內切酶酶解成一定的片

段.②電泳,將酶解的片段在瓊脂糖凝膠上進行電泳，使之大小分離.

③轉移,電泳后用堿處理，使凝膠中的變成單鏈,然后將單股鏈轉移至

硝酸纖維濾膜上.④用合適的探針與膜片雜交,標記與膜片上的同源

序列會通過氫鏈形成雜交分子.⑤洗去非特異性片段和未雜交的放射

性核素.⑥放射自顯影(圖).這種方法大大提高了分子雜交的靈敏

度,被廣泛的應用于分子生物學的研究.目前人們正習慣用作者E勺名

字命名,因此這種印跡法被稱為.

()印記法與相對應的方法是年提出的印跡分析法,這是一種用

探針來檢測特異序列的方法.由于印跡法以作者的名字命了名，所以

人們習慣上把印跡法稱為.

的基本程序同的相似,也要經過抽提變性瓊脂糖凝膠電泳，（變

性破壞分子內局部雙螺旋法構），轉移,雜交,放射自顯影等基本步驟.

序列分析法

當所要研究的一段被檢出后就可以對其進行序列分析.目

前應用的比較廣泛的方法是的“末端終止法”和后來與提

出的化學斷裂法.

0末端終止法“末端終止法”的基本操作是這樣的,以待測序列

的單鏈作為模版,加一個引物與被放射性核素標記的底物.另外再加

一定比例的即''雙脫氧核糖核甘三磷酸.以加入為例，在聚合酶催化合

成過程中就會有和的競爭參與，就會出現兩種可能性,一種是填充位

置,新合成的鏈繼續延伸.另一種可能性是參與配對.在這種情況下，

由于的‘位置沒有定由羥基,不能再與下一個形成磷酸二酯錠.結果

就會可以得到不同長度的以為結尾的片段.如果加入同時參與競爭，

同樣道理,結果就會得到以和為結尾的四種片段。這樣經過放射自顯

影后,就可以直接讀出這段的堿基順序。（圖）

（）化學斷裂法化學斷裂法的基本原理是用化學試劑特異性破壞與

不同堿基相連的磷竣二酯鍵，這樣就可以得到以特定堿基為結尾的四

組片段.自顯影后我們也可以直接讀出的順序來（圖）o

不論是酶法還是化學法在應用過程中都有了明顯的改進。研究者

們還根據這些原理制造了自動分析儀.目前不但一些病毒和原核生物

基因組的全部序列已分析清楚。并且已開始向分析更大的基因組發展.

美國早就有計劃將人類基因組的X9個堿基對全部分析清楚。并且成

立了國際性合作機構:人類基囚組織（，）此項計劃預計招在未來十

幾年內完成。

四技術

在對的研究中，有時樣品可能很少，可能只有一根毛發，一滴血或

者極少的體液.甚至有可能是冷凍多年的少許古生物組織.要對這些

進行分析。首先要進行體外擴增以滿足的需要量。技術，既聚合酶鏈

反應（，）就是一種體外擴增技術。這項技術能在實驗室的試管內

將所要研究的片段在數小時內擴增成千上萬倍.它的基本過程是這樣

的,①變性0,將片段加熱使雙鏈解離成單推。②退火（）溫度下降時,

由化學合成的引物與所要擴增的兩側相結合。③延伸。在種和引物等

條件下聚合酶從引物的'端進行延伸,合成方向為這樣一個過程得

到分子與原來結構相同的片段。這三個基本步驟每循環一次分子數就

會按指數倍增（（）.由此可知其驚人的擴增量.（圖）.

值得一提的是年發表他的方法后，他關于這一理論和技術的論文

至今仍是被全世界科技論文引用最多的文獻也因技術的發明而榮獲

了年諾貝爾獎.

（圖：由流式細胞計測得一個群體細胞相對含量圖解，測定的是一群

生長的細胞群體，由于它們的生長并不同步，當幾萬個細胞經過流式

細胞計后，就可得出一個柱形圖。第一個高峰的細胞數是含量，代表

期細胞，第二個高峰是含量，代表期和期細胞，介于二者之間的含量,

代表期的細胞。）

第四章細胞質與細胞表面

第一節細胞質膜

一、細胞膜的結構模型

三明治模型

單位膜模型

液態鑲嵌模型

二膜質

（一）成分

磷脂卵磷脂

糖脂血型糖脂

膽固醇

（二｝膜質的運動方式

側向運動

自旋運動

尾部擺動

翻轉運動

（三）脂質體

三膜蛋白

（一）類型外在蛋q內在蛋白

四膜的流動性

（一）膜質的流動人鼠細胞的融合試驗（有色熒光）

（二）膜蛋白的流動細胞（熒光抗體）二價抗體成斑成帽

五膜的不對稱性

（-）質膜各部分的名稱

（二）膜質的不對稱性

（三）膜蛋白的不對稱性

六質膜的功能

第一節細胞表面的特化結構

一膜骨架

（一）紅細胞的生物學特性血影

（二）紅細胞質膜蛋芻與膜骨架（圖）不運動纖毛綜合癥

第三節細胞連接

?細胞連接的營養分配暢通說明構成組織的細胞之間有機械的連接

也有生理活動的聯系。我們統稱它們為“細胞連接“，因此細胞

連接是多細胞有機體中相鄰細胞相互聯系，協同作用必不可少的

組織形式。它是對細胞功能的一種補充。

?按其功能可以將細胞連接分成兩大類，一類是機械連接，另一類

是通訊連接（CONNUNICATI0NJUNCTI0N

S）。

一細胞連接的分類

1-機械連接

（1）緊密連接

0錨定連接

A粘合帶連接細胞與細胞

B粘合斑連接細胞與細胞外基質

C橋粒連接細胞與細胞

D半橋粒連接細胞與細胞外基質

2.通訊連接

(I)間隙連接

(2)化學突觸

(3)胞間連絲

一?機械連接顧名思義，這種連接主要起到把細胞和細胞機械連

系在一起的作用。

(I)緊密連接(TIGHTJUNCTION)

緊密連接是腺體上皮細胞特有的連接方式。它存在于細胞頂部

下方質膜上的一個特化區域。(圖)目前認為緊密連接的構造是這樣

的，相鄰質膜上的許多跨膜蛋白互相之間在對應的位置上互相連接。

這樣就構成了一條封閉索(SEALINGSTRAND)。緊密連

接正是由數條交錯成網的封閉索組成(圖)

緊密連接普遍存在于脊椎動物體內各種腔道的上皮細胞中，除

了具有機械的支持功能外還有一個重要的功能，它封閉了細胞之間的

空隙，將細胞連接成具有韌性的一層，使這一細胞層內側的大多數物

質不能自由通透。如，腸腔內容物不能沿腸上皮細胞側壁溢入體液中O

腸上皮細胞對多糖氨基酸重要營物質的吸收靠分布在細胞頂部質膜

上的主動運輸載體完成的，而葡萄糖等營養物質從細胞內運輸到細胞

外液是靠位于細胞基部和側面質膜上被動運輸載體完成的。(圖)顯

然，這一系列運輸過程的正常有序運行有賴于不同功能的載體蛋白在

質膜上的不同分布，正是緊密連接封閉了細胞間隙維持了這兩種載體

蛋白的正常分布，從面保證了小腸上皮細胞的極性的吸收功能。

（2）錨定連接（ANCHORINGJUNCTIONS）細

胞能夠結合成一個有一定機械支撐能力，一個有利于發揮

其功能的有序的細胞群體，主要是靠錨定連接.錨定連接是

一個細胞中的骨架系統成分與另一個細胞中的骨架成分

相連接（橋粒、粘合帶）；以與一個細胞的骨架系統和細

胞外基質相連接（半橋粒、粘合斑）構成的。錨定連接又

可分為與中間纖維相關的連接（橋粒、半橋粒）和與肌動

蛋白相關的連接（粘合帶、粘合斑）。

A、橋粒（DESMOSOME）和半橋粒（HEMIDESMOS

OME）

有一種天皰瘡患者，他的體液滲漏至上皮導致嚴重的表皮大皰，

這是由于患者的身體產生了某種橋粒連接蛋白的抗體，這些抗體作用

于皮膚上皮細胞的橋粒使其失去功能的緣故。可見橋粒對維持上皮結

構的正常是非常重要的。

橋粒在細胞之間的連接作用如同鉀釘，它的結構也呈鉀構樣（圖）

在橋粒處相鄰細胞質膜間的間隙約NM。在質膜的胞質側有一直徑約

NM的盤狀致密斑，其成分是細胞內附著蛋白。細胞骨架的中間纖維

在此落腳，它即是胞胞質中骨架成分又是組成橋粒的結構。相鄰兩個

細胞的致密斑是通過跨膜連接糖蛋白相連。就這樣，細胞質內的中間

纖維通過橋粒相互連接成了于多個組織的網絡保持組織細胞致密