基于數字PCR的核酸檢測定量參考品制備與應用引言數字PCR（DigitalPCR,dPCR）作為一種新興的核酸定量技術，通過將反應體系分割成大量微小的反應單元，實現對核酸分子的絕對定量，具有更高的靈敏度、準確性和精密度，在臨床診斷、病原體檢測、基因表達分析、轉基因檢測等眾多領域展現出廣闊的應用前景。在數字PCR檢測過程中，核酸檢測定量參考品起著至關重要的作用，它不僅是評估數字PCR系統性能的重要工具，也是保證檢測結果準確性和可比性的關鍵因素。本文將詳細介紹基于數字PCR的核酸檢測定量參考品的制備方法及其在實際應用中的要點。核酸檢測定量參考品制備靶核酸的選擇與獲取目標確定：根據應用目的明確靶核酸，如臨床診斷中針對特定致病基因，病原體檢測針對病毒或細菌的特征核酸序列。例如，在新冠病毒檢測中，選擇新冠病毒的N基因或ORF1ab基因等作為靶核酸。獲取途徑：人工合成：對于已知序列的短片段核酸，可通過化學合成方法獲得，如合成寡核苷酸片段。其優勢在于序列精確可控，能準確引入特定突變或修飾，但合成長度有限，成本相對較高。基因克隆：將靶核酸序列克隆至合適的載體（如質粒），通過細菌培養擴增。這種方法可獲得較長且穩定的核酸片段，成本較低，但操作過程較為復雜，需要一定的分子生物學技術基礎，且存在載體相關雜質污染的風險。從生物樣本中提取：直接從含有目標核酸的生物樣本（如細胞、組織、血液等）中提取核酸。適用于研究天然狀態下的核酸，但提取過程易受樣本來源、質量及提取方法等因素影響，導致核酸純度和完整性參差不齊。參考品的構建構建形式：質粒標準品：將靶核酸片段克隆到質粒載體上構建重組質粒。質粒具有穩定的雙鏈環狀結構，在細菌中可大量復制，便于制備高濃度、均一性好的參考品。通過對重組質粒進行測序驗證，確保插入片段的準確性。體外轉錄RNA標準品：對于RNA檢測的數字PCR參考品，可利用體外轉錄技術制備。以含有目標RNA序列的質粒為模板，在RNA聚合酶的作用下轉錄生成RNA。體外轉錄的RNA可模擬天然RNA的結構和功能，用于評估RNA檢測方法的性能，但RNA穩定性較差，易被RNA酶降解，需要在制備和保存過程中特別注意。基因組DNA標準品：從含有目標基因的細胞系或組織中提取基因組DNA，經過純化和定量后作為參考品。基因組DNA參考品能反映核酸在天然基因組背景下的狀態，適用于涉及基因組結構和拷貝數變異分析的數字PCR檢測，但由于基因組DNA結構復雜，制備過程中的均一性和穩定性控制難度較大。濃度梯度設置：為滿足不同檢測靈敏度和定量范圍的需求，需制備一系列不同濃度梯度的參考品。濃度梯度的設置應根據數字PCR儀器的線性范圍和實際應用場景進行合理規劃。一般采用倍比稀釋法，如10倍梯度稀釋，制備出至少5-6個不同濃度水平的參考品，涵蓋從低濃度（接近檢測限）到高濃度的范圍，以確保在整個檢測范圍內都能準確評估數字PCR系統的性能。參考品的質量控制核酸濃度測定：分光光度法：利用核酸在260nm處有最大吸收峰的特性，通過測定260nm和280nm波長處的吸光度（A260和A280）來計算核酸濃度，并根據A260/A280的比值判斷核酸純度。一般純凈的DNAA260/A280比值約為1.8，RNA約為2.0。但分光光度法易受核酸樣品中雜質（如蛋白質、酚類等）的干擾，導致濃度測定不準確。熒光定量法：使用特異性結合核酸的熒光染料（如PicoGreen用于雙鏈DNA定量，RiboGreen用于RNA定量），在熒光分光光度計或酶標儀上測定熒光強度，根據標準曲線計算核酸濃度。熒光定量法靈敏度高，對雜質的耐受性較好，適用于低濃度核酸樣品的定量。核酸完整性檢測：瓊脂糖凝膠電泳：將核酸樣品在瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，通過觀察核酸條帶的位置和完整性來判斷核酸的質量。對于DNA，完整的基因組DNA應呈現一條清晰的高分子量條帶，若出現降解則表現為條帶彌散或出現多條低分子量條帶；對于RNA，在變性瓊脂糖凝膠電泳中，真核生物的總RNA應呈現28S和18SrRNA兩條清晰的條帶，且28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，若RNA發生降解，條帶會變模糊或出現多條低分子量條帶。毛細管電泳：采用毛細管電泳儀對核酸進行分析，可更精確地檢測核酸的片段大小和完整性。與瓊脂糖凝膠電泳相比，毛細管電泳具有更高的分辨率和自動化程度，能提供更準確的核酸完整性信息。序列驗證：通過測序技術對參考品的核酸序列進行驗證，確保靶核酸序列的準確性和一致性。對于質粒標準品和體外轉錄RNA標準品，測序可確認插入片段或轉錄產物的序列與設計序列完全一致；對于基因組DNA參考品，可通過PCR擴增靶區域后進行測序，驗證目標基因的序列是否正確。常用的測序方法包括Sanger測序和二代測序技術，Sanger測序適用于較短片段的精確測序，二代測序技術則可實現高通量、大規模的序列測定。核酸檢測定量參考品在數字PCR中的應用數字PCR系統性能評估準確性評估：使用已知濃度的核酸檢測定量參考品進行數字PCR檢測，將檢測結果與參考品的標稱濃度進行比較，計算相對偏差。相對偏差越小，說明數字PCR系統的準確性越高。例如，若參考品標稱濃度為1000copies/μL，多次重復檢測結果的平均值為980copies/μL，則相對偏差為[(980-1000)/1000]×100%=-2%。精密度評估：對同一濃度的參考品進行多次重復數字PCR檢測，計算檢測結果的變異系數（CoefficientofVariation,CV）。CV值越小，表明數字PCR系統的精密度越好，即重復性和再現性越高。一般要求數字PCR系統在不同實驗人員、不同儀器及不同時間等條件下的精密度CV值應小于15%。例如，對某一濃度參考品進行10次重復檢測，檢測結果的平均值為500copies/μL，標準差為50copies/μL，則CV=(50/500)×100%=10%。靈敏度評估：通過檢測一系列低濃度的核酸檢測定量參考品，確定數字PCR系統能夠可靠檢測到的最低核酸濃度，即檢測限（LimitofDetection,LOD）。一般以95%置信度下能檢測到陽性信號的最低濃度作為LOD。例如，當檢測濃度為10copies/μL的參考品時，在20次重復檢測中有19次檢測到陽性信號，則該數字PCR系統對該靶核酸的LOD可近似認為是10copies/μL。線性范圍評估：使用不同濃度梯度的核酸檢測定量參考品進行數字PCR檢測，以參考品濃度的對數值為橫坐標，以檢測得到的拷貝數的對數值為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性回歸分析計算標準曲線的相關系數（R2），R2越接近1，說明數字PCR系統在該濃度范圍內的線性關系越好，線性范圍越寬。一般理想的數字PCR系統線性范圍應跨越3-5個數量級，如101-10?copies/μL。臨床診斷與疾病監測病原體核酸定量檢測：在傳染病診斷中，數字PCR可利用核酸檢測定量參考品對病原體核酸進行準確的絕對定量，為疾病的早期診斷、病情監測和療效評估提供重要依據。例如，在乙肝病毒感染的診斷中，通過數字PCR檢測患者血清中乙肝病毒DNA的拷貝數，可精確判斷病毒載量，指導臨床治療方案的選擇和調整。與傳統的實時熒光定量PCR相比，數字PCR不受擴增效率差異的影響，能更準確地定量低水平的病毒核酸，有助于發現隱匿性感染和評估抗病毒治療的效果。腫瘤基因檢測：在腫瘤診斷和個性化治療中，數字PCR可用于檢測腫瘤相關基因的突變頻率和拷貝數變異。利用核酸檢測定量參考品對數字PCR系統進行校準和質量控制，確保檢測結果的準確性和可靠性。例如，在非小細胞肺癌患者中，通過數字PCR檢測EGFR基因突變的頻率，可指導靶向藥物的選擇；檢測乳腺癌患者HER2基因的拷貝數，有助于判斷患者的預后和制定治療方案。數字PCR能夠檢測到低豐度的腫瘤基因突變，為腫瘤的早期診斷和微小殘留病灶的監測提供了有力的技術支持。科研領域應用基因表達分析：在基因表達研究中，數字PCR可利用核酸檢測定量參考品對目標基因的mRNA進行絕對定量，準確評估基因的表達水平。與傳統的相對定量方法（如實時熒光定量PCR的2^-ΔΔCT法）相比，數字PCR無需內參基因，能直接給出目標基因的拷貝數，避免了內參基因選擇不當和擴增效率差異對結果的影響，可更精確地分析基因在不同組織、細胞或生理病理狀態下的表達變化。例如，在研究藥物對細胞基因表達的影響時，通過數字PCR定量檢測藥物處理前后相關基因的mRNA拷貝數，可準確評估藥物的作用機制和效果。轉基因生物檢測：在轉基因生物安全檢測中，數字PCR利用核酸檢測定量參考品對轉基因生物中的外源基因進行準確的拷貝數測定。通過構建含有已知拷貝數外源基因的參考品，對數字PCR系統進行校準和驗證，能夠準確判斷轉基因生物中外源基因的整合情況和拷貝數變異，為轉基因生物的安全性評價和監管提供科學依據。例如，在轉基因農作物檢測中，數字PCR可準確檢測外源基因的拷貝數，區分不同轉基因事件，保障農產品的質量安全。結論基于數字PCR的核酸檢測定量參考品的制備是一項復雜而關鍵的工作，涉及靶核酸的選擇與獲取、參考品的構建及