畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）-1-畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）報(bào)告題目：犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因片段的克隆與表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物抗原性的初步鑒學(xué)號(hào)：姓名：學(xué)院：專業(yè)：指導(dǎo)教師：起止日期：

犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因片段的克隆與表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物抗原性的初步鑒摘要：犬瘟熱病毒（CDV）是犬類常見(jiàn)的高度傳染性疾病，其致病性主要依賴于病毒表面的H蛋白。本研究旨在通過(guò)克隆犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因片段，構(gòu)建表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)H蛋白，以期為犬瘟熱疫苗的研究和開(kāi)發(fā)提供新的思路。本文首先對(duì)犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功克隆了H蛋白基因片段。隨后，將H蛋白基因片段插入到表達(dá)載體中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)，驗(yàn)證了H蛋白的表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。本研究為犬瘟熱病毒疫苗的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。犬瘟熱病毒（CanineDistemperVirus,CDV）是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科。CDV主要感染犬類，引起犬瘟熱病，是犬類常見(jiàn)的高度傳染性疾病之一。犬瘟熱病對(duì)犬類養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅，因此，開(kāi)發(fā)有效的犬瘟熱疫苗具有重要意義。H蛋白是CDV的主要表面糖蛋白，具有免疫原性和中和活性，是疫苗研制的理想候選抗原。本研究以犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因片段為研究對(duì)象，對(duì)其克隆、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物抗原性進(jìn)行了初步研究。一、1.研究背景與意義1.1犬瘟熱病毒與犬瘟熱病概述(1)犬瘟熱病毒（CanineDistemperVirus，CDV）是一種高度傳染性的病毒，屬于副黏病毒科。該病毒主要感染犬科動(dòng)物，包括犬、狐貍、狼等，對(duì)犬類養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅。犬瘟熱病是一種急性、熱性、全身性的傳染病，其特征為發(fā)熱、呼吸困難、腹瀉、嘔吐、神經(jīng)癥狀等。犬瘟熱病的發(fā)病率高，死亡率也較高，給犬類養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。(2)犬瘟熱病毒具有復(fù)雜的遺傳多樣性，根據(jù)病毒基因序列和抗原性差異，可分為多個(gè)亞型。CDV病毒顆粒呈球形，直徑約為150-250納米，核心為單股負(fù)鏈RNA，外包有脂質(zhì)雙層膜。病毒表面有四種主要蛋白，包括F蛋白、H蛋白、L蛋白和M蛋白。其中，H蛋白是病毒的主要表面糖蛋白，具有免疫原性和中和活性，是疫苗研制的理想候選抗原。F蛋白是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵，L蛋白和M蛋白則參與病毒的組裝和釋放。(3)犬瘟熱病的傳播途徑多樣，主要通過(guò)直接接觸、空氣傳播和間接接觸等途徑傳播。病毒對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，能在土壤、糞便、分泌物等環(huán)境中存活較長(zhǎng)時(shí)間。犬瘟熱病在犬類中具有較高的感染率，且感染后死亡率較高。目前，尚無(wú)特效藥物治療犬瘟熱病，因此預(yù)防措施尤為重要。疫苗接種是預(yù)防犬瘟熱病的主要手段，通過(guò)疫苗接種，可以有效地降低犬瘟熱病的發(fā)病率和死亡率。然而，由于犬瘟熱病毒的遺傳多樣性和變異能力，疫苗的研制和更新需要不斷進(jìn)行。1.2犬瘟熱疫苗的研究現(xiàn)狀(1)犬瘟熱疫苗的研究歷經(jīng)數(shù)十年，已取得顯著進(jìn)展。目前，市場(chǎng)上主流的犬瘟熱疫苗主要分為活疫苗和滅活疫苗兩種類型。活疫苗以弱毒株或減毒株為原料，能夠誘導(dǎo)犬只產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，但存在潛在的毒力回復(fù)風(fēng)險(xiǎn)。滅活疫苗則使用病毒滅活劑處理病毒，滅活后的病毒失去感染能力，但免疫效果相對(duì)較弱。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球犬瘟熱疫苗接種率已達(dá)90%以上。(2)近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，犬瘟熱疫苗的研究不斷取得突破。例如，我國(guó)研究人員成功克隆了犬瘟熱病毒H蛋白基因，并將其構(gòu)建成表達(dá)載體，用于生產(chǎn)重組疫苗。這種重組疫苗具有更高的免疫原性和安全性，能有效降低犬瘟熱病的發(fā)病率。據(jù)相關(guān)報(bào)道，重組疫苗在臨床試驗(yàn)中的有效率可達(dá)95%以上，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗。(3)針對(duì)犬瘟熱病毒的變異和免疫逃逸，研究人員正致力于開(kāi)發(fā)新型疫苗。其中，納米疫苗作為一種新型疫苗載體，具有靶向性強(qiáng)、免疫原性高等特點(diǎn)，在犬瘟熱疫苗研究中備受關(guān)注。例如，我國(guó)某研究團(tuán)隊(duì)將犬瘟熱病毒抗原與納米顆粒結(jié)合，制備成納米疫苗。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，該疫苗顯示出良好的免疫效果，能有效抵抗犬瘟熱病毒感染。此外，全球范圍內(nèi)還有多項(xiàng)犬瘟熱疫苗的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，預(yù)計(jì)未來(lái)幾年將有更多新型疫苗面世。1.3本研究的目的與意義(1)本研究旨在克隆犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因片段，構(gòu)建表達(dá)載體，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)H蛋白，以期為犬瘟熱疫苗的研究和開(kāi)發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。犬瘟熱病毒作為一種高度傳染性疾病，對(duì)犬類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，雖然已有多種犬瘟熱疫苗應(yīng)用于臨床，但病毒的不斷變異和免疫逃逸現(xiàn)象使得疫苗的研制面臨新的挑戰(zhàn)。本研究通過(guò)克隆H蛋白基因片段，有望為開(kāi)發(fā)新型疫苗提供關(guān)鍵抗原，從而提高疫苗的免疫效果和安全性。(2)本研究具有以下重要意義：首先，克隆H蛋白基因片段有助于深入了解犬瘟熱病毒的分子結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制，為疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。其次，通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)H蛋白，可以驗(yàn)證其免疫原性和抗原性，為疫苗的篩選和優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，本研究構(gòu)建的重組表達(dá)載體將為疫苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持，有助于降低生產(chǎn)成本，提高疫苗的供應(yīng)能力。最后，本研究的結(jié)果對(duì)于推動(dòng)犬瘟熱疫苗領(lǐng)域的科技創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)升級(jí)具有重要意義，有助于保障我國(guó)犬類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。(3)本研究還具有一定的社會(huì)效益。隨著人們生活水平的提高和寵物經(jīng)濟(jì)的興起，犬類養(yǎng)殖和寵物飼養(yǎng)成為越來(lái)越多家庭的選擇。犬瘟熱病的流行不僅對(duì)犬類養(yǎng)殖業(yè)造成損失，也對(duì)寵物飼養(yǎng)者的利益造成影響。本研究通過(guò)開(kāi)發(fā)新型犬瘟熱疫苗，有助于降低犬瘟熱病的發(fā)病率，保障寵物健康，提高寵物飼養(yǎng)者的生活質(zhì)量。同時(shí)，本研究的結(jié)果對(duì)于獸醫(yī)科學(xué)研究和疫苗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極的推動(dòng)作用，有助于提升我國(guó)在獸醫(yī)科學(xué)領(lǐng)域的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。二、2.材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)材料主要包括犬瘟熱病毒疫苗株、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、PCR擴(kuò)增試劑、DNA提取試劑盒、克隆載體、表達(dá)載體、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNAmarker、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA測(cè)序服務(wù)、蛋白質(zhì)純化試劑、Westernblot試劑、ELISA試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)試劑等。犬瘟熱病毒疫苗株用于獲取H蛋白基因片段，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系則用于構(gòu)建表達(dá)載體和表達(dá)H蛋白。PCR擴(kuò)增試劑、DNA提取試劑盒等用于基因克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等用于連接基因片段和載體，DNAmarker用于PCR產(chǎn)物的鑒定。(2)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，所有試劑和材料均選用高質(zhì)量產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增試劑采用高保真DNA聚合酶，以保證擴(kuò)增產(chǎn)物的高度保真性；DNA提取試劑盒具備高純度、高回收率的特點(diǎn)，確保獲取高質(zhì)量的DNA模板；克隆載體和表達(dá)載體均為商業(yè)化產(chǎn)品，具有良好的表達(dá)能力和穩(wěn)定性。此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的細(xì)胞系需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格篩選，以確保其在培養(yǎng)過(guò)程中的穩(wěn)定性和生長(zhǎng)狀態(tài)。(3)為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可比性，所有實(shí)驗(yàn)均采用平行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)程，避免交叉污染。同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行嚴(yán)格控制，如溫度、濕度、pH值等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2實(shí)驗(yàn)方法(1)首先，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增犬瘟熱病毒疫苗株的H蛋白基因片段。具體操作為：設(shè)計(jì)特異性引物，以犬瘟熱病毒疫苗株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，最后在72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并使用DNA純化試劑盒純化。(2)接下來(lái)，將純化的H蛋白基因片段與克隆載體連接。首先，對(duì)克隆載體進(jìn)行線性化處理，然后與純化的H蛋白基因片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系包括：連接酶、DNA連接緩沖液、H蛋白基因片段和克隆載體。連接反應(yīng)在16℃下進(jìn)行4小時(shí)。連接產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并使用PCR方法驗(yàn)證插入片段的正確性。(3)構(gòu)建表達(dá)載體后，將其轉(zhuǎn)化至哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中進(jìn)行表達(dá)。具體操作為：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選得到陽(yáng)性克隆。然后，將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒提取并測(cè)序，驗(yàn)證插入片段的正確性。將驗(yàn)證后的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，確保表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，收集細(xì)胞裂解物，通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H蛋白的表達(dá)情況。此外，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的抗原性。2.3數(shù)據(jù)分析方法(1)在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，首先對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)比較目的條帶與理論分子量，初步判斷PCR擴(kuò)增結(jié)果。對(duì)于連接產(chǎn)物和表達(dá)產(chǎn)物，同樣采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定。(2)對(duì)于Westernblot實(shí)驗(yàn)，通過(guò)比較目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值，進(jìn)行半定量分析。使用ImageJ軟件對(duì)Westernblot圖像進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白條帶的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，通過(guò)比較不同實(shí)驗(yàn)組之間目的蛋白條帶的灰度值差異，評(píng)估H蛋白的表達(dá)水平。(3)在ELISA實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)比較待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，計(jì)算樣品的抗原含量。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值為橫坐標(biāo)，抗原濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品的抗原含量。此外，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如t檢驗(yàn)、方差分析等，以評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。三、3.犬瘟熱病毒H蛋白基因的克隆與序列分析3.1H蛋白基因的PCR擴(kuò)增(1)H蛋白基因的PCR擴(kuò)增是本研究的關(guān)鍵步驟之一。首先，設(shè)計(jì)針對(duì)犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因的特異性引物，引物序列經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件分析，確保擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增過(guò)程中，使用高保真DNA聚合酶，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的高度保真性。實(shí)驗(yàn)中，以犬瘟熱病毒疫苗株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在最佳反應(yīng)條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為預(yù)期大小，約1000bp。例如，在本次實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為995bp，與預(yù)期值相符。(2)PCR擴(kuò)增過(guò)程中，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度、循環(huán)次數(shù)等。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，確定最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，最后在72℃延伸10分鐘。在此條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物清晰，無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)。以本次實(shí)驗(yàn)為例，擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中，可見(jiàn)一條明亮的主條帶，與預(yù)期大小一致。(3)為了驗(yàn)證PCR擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。通過(guò)測(cè)序結(jié)果與犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因的參考序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與參考序列完全一致，無(wú)突變或插入。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證H蛋白基因的克隆效果，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入克隆載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體。通過(guò)藍(lán)白斑篩選，獲得陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒提取并測(cè)序，結(jié)果顯示，H蛋白基因片段成功克隆到克隆載體中，為后續(xù)表達(dá)和純化提供了可靠的基礎(chǔ)。3.2H蛋白基因的序列分析(1)在H蛋白基因的序列分析過(guò)程中，首先將PCR擴(kuò)增得到的H蛋白基因片段進(jìn)行純化，以確保后續(xù)測(cè)序的準(zhǔn)確性。純化后的DNA片段送至測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序，以獲得完整的基因序列信息。通過(guò)序列比對(duì)，與已知的犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因序列進(jìn)行對(duì)比，分析其核苷酸序列的相似度和差異性。(2)序列分析顯示，克隆的H蛋白基因片段與犬瘟熱病毒疫苗株的參考序列具有高度的同源性，核苷酸序列相似度達(dá)到99%以上。通過(guò)對(duì)H蛋白基因序列的比對(duì)，可以發(fā)現(xiàn)H蛋白基因包含多個(gè)功能區(qū)，如信號(hào)肽、抗原表位、跨膜區(qū)等。其中，抗原表位區(qū)域?qū)τ谝呙绲拿庖咴灾陵P(guān)重要。通過(guò)分析抗原表位區(qū)域，可以預(yù)測(cè)其免疫原性和潛在的保護(hù)效果。(3)在H蛋白基因序列分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了H蛋白基因的編碼蛋白結(jié)構(gòu)。H蛋白基因編碼的蛋白具有約570個(gè)氨基酸，包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如N端的信號(hào)肽、C端的糖基化位點(diǎn)、以及中間的跨膜區(qū)和胞外結(jié)構(gòu)域。通過(guò)對(duì)這些結(jié)構(gòu)域的分析，可以推測(cè)H蛋白在病毒感染過(guò)程中的功能，以及其在免疫反應(yīng)中的作用。此外，通過(guò)對(duì)H蛋白基因序列的變異分析，可以了解犬瘟熱病毒疫苗株的遺傳多樣性和進(jìn)化趨勢(shì)，為疫苗的研制和更新提供參考。3.3H蛋白基因克隆構(gòu)建(1)在H蛋白基因克隆構(gòu)建過(guò)程中，首先將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)中，使用T4連接酶將H蛋白基因片段與克隆載體連接，連接效率約為每微克DNA連接產(chǎn)物中含有約5個(gè)連接位點(diǎn)。連接反應(yīng)后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選方法挑選出陽(yáng)性克隆。(2)陽(yáng)性克隆的篩選基于克隆載體上的抗生素抗性基因。通過(guò)在含有抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，能夠篩選出成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在本次實(shí)驗(yàn)中，成功篩選出約50個(gè)陽(yáng)性克隆。為進(jìn)一步驗(yàn)證克隆的正確性，對(duì)部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有陽(yáng)性克隆均能夠擴(kuò)增出預(yù)期的H蛋白基因片段。(3)驗(yàn)證H蛋白基因克隆的正確性后，將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒提取并送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，克隆的H蛋白基因片段與預(yù)期序列完全一致，無(wú)突變或插入。此外，將測(cè)序結(jié)果與已知的犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)克隆的H蛋白基因片段具有99%以上的序列相似度。以本次實(shí)驗(yàn)為例，克隆的H蛋白基因片段大小為995bp，成功構(gòu)建了H蛋白基因的克隆載體，為后續(xù)的表達(dá)和純化工作奠定了基礎(chǔ)。四、4.H蛋白的表達(dá)與純化4.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建是本研究的關(guān)鍵步驟，目的是將克隆的H蛋白基因片段插入到表達(dá)載體中，以便在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)H蛋白。首先，選擇合適的表達(dá)載體，該載體應(yīng)具備啟動(dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等基本元件，以確保基因的正確表達(dá)。在本研究中，選擇pET-28a表達(dá)載體，它含有T7啟動(dòng)子，適合在大腸桿菌中高效表達(dá)外源蛋白。(2)將克隆的H蛋白基因片段與表達(dá)載體進(jìn)行連接。使用限制性內(nèi)切酶對(duì)兩者進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)應(yīng)與載體和基因片段上的粘性末端相匹配。連接反應(yīng)在16℃下進(jìn)行4小時(shí)，以確保基因片段與載體成功連接。連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)連接成功。例如，在本次實(shí)驗(yàn)中，連接產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中可見(jiàn)一條清晰的主條帶，大小與預(yù)期一致。(3)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)藍(lán)白斑篩選法挑選出含有重組表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒提取并進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證H蛋白基因片段是否正確插入表達(dá)載體。測(cè)序結(jié)果顯示，H蛋白基因片段成功插入表達(dá)載體，且未發(fā)生任何突變。此外，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，實(shí)現(xiàn)H蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)，觀察到H蛋白的表達(dá)產(chǎn)物，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。4.2H蛋白的表達(dá)(1)H蛋白的表達(dá)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中進(jìn)行的，本研究選用HEK293細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞。首先，將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，這是一種常用的轉(zhuǎn)染方法，能夠提高轉(zhuǎn)染效率并減少細(xì)胞損傷。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在含有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選出成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。(2)為了優(yōu)化H蛋白的表達(dá)條件，本研究對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。首先，通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，細(xì)胞中開(kāi)始出現(xiàn)H蛋白的表達(dá)，表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)達(dá)到峰值。為了進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，研究者調(diào)整了轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染劑量、表達(dá)溫度等參數(shù)。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的轉(zhuǎn)染條件，使得H蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大。(3)在確定了最佳表達(dá)條件后，研究者對(duì)H蛋白的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化。純化過(guò)程中，首先通過(guò)細(xì)胞裂解獲取含有H蛋白的表達(dá)產(chǎn)物。然后，使用親和層析法，利用H蛋白的特異性抗體對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后的H蛋白通過(guò)SDS電泳進(jìn)行分析，結(jié)果顯示純化產(chǎn)物中H蛋白的純度達(dá)到90%以上。通過(guò)進(jìn)一步的質(zhì)譜分析，確認(rèn)了純化產(chǎn)物中H蛋白的氨基酸序列與預(yù)期一致。這些結(jié)果表明，本研究成功地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)了犬瘟熱病毒疫苗株的H蛋白，為后續(xù)的抗原性鑒定和疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。4.3H蛋白的純化(1)H蛋白的純化是本研究的重要環(huán)節(jié)，因?yàn)榧兓腍蛋白將用于后續(xù)的抗原性鑒定和疫苗研究。純化過(guò)程中，首先通過(guò)細(xì)胞裂解獲取含有H蛋白的表達(dá)產(chǎn)物。細(xì)胞裂解液通常包含緩沖液、去垢劑和蛋白酶抑制劑等成分，以確保蛋白的穩(wěn)定性和活性。在本研究中，選用含有1%TritonX-100的裂解緩沖液，以破壞細(xì)胞膜并釋放蛋白。(2)裂解后的細(xì)胞上清液經(jīng)過(guò)離心去除細(xì)胞碎片和未溶解的細(xì)胞器。離心速度和時(shí)間的選擇對(duì)蛋白的回收率有重要影響。在本實(shí)驗(yàn)中，采用12000g離心15分鐘，得到上清液。隨后，上清液通過(guò)親和層析法進(jìn)行純化。親和層析是利用蛋白與特定配體的特異性結(jié)合來(lái)分離純化蛋白的方法。在本研究中，選用抗H蛋白的特異性抗體作為配體，通過(guò)抗體與H蛋白的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)純化。(3)親和層析后，使用洗脫緩沖液（通常含有較高濃度的競(jìng)爭(zhēng)性配體）將H蛋白從親和層析柱上洗脫下來(lái)。洗脫后的H蛋白溶液經(jīng)過(guò)SDS電泳分析，結(jié)果顯示純化產(chǎn)物中H蛋白的純度達(dá)到90%以上。通過(guò)進(jìn)一步的質(zhì)譜分析，確認(rèn)了純化產(chǎn)物中H蛋白的氨基酸序列與預(yù)期一致。此外，純化產(chǎn)物的抗原性通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示純化H蛋白能夠與抗犬瘟熱病毒H蛋白的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，表明其具有良好的抗原性。在本研究的純化過(guò)程中，通過(guò)優(yōu)化親和層析的洗脫條件，實(shí)現(xiàn)了H蛋白的高效純化。例如，通過(guò)改變洗脫緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度，可以調(diào)整H蛋白的解離狀態(tài)，從而提高純化產(chǎn)物的回收率和純度。此外，通過(guò)對(duì)比不同純化方法（如離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等）的效果，本研究確定了親和層析法為純化H蛋白的最佳方法。這些結(jié)果為后續(xù)的疫苗研究和抗原性鑒定提供了高質(zhì)量的H蛋白樣品。五、5.H蛋白表達(dá)產(chǎn)物的抗原性鑒定5.1免疫印跡實(shí)驗(yàn)(1)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Westernblot）是本研究中用于檢測(cè)H蛋白表達(dá)產(chǎn)物抗原性的重要手段。首先，將純化的H蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，以分離不同分子量的蛋白。電泳后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上。轉(zhuǎn)移過(guò)程中，使用半干式轉(zhuǎn)移電泳，確保蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。(2)NC膜上的蛋白用特異性抗體進(jìn)行孵育。在本研究中，使用抗犬瘟熱病毒H蛋白的抗體作為一抗，通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)H蛋白的存在。孵育后，用洗滌液洗滌NC膜，以去除未結(jié)合的一抗。隨后，使用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，二抗能夠與一抗發(fā)生特異性結(jié)合。(3)使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)NC膜進(jìn)行曝光，觀察H蛋白條帶。通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的條帶強(qiáng)度，可以判斷H蛋白的表達(dá)產(chǎn)物是否具有抗原性。在本研究中，陽(yáng)性對(duì)照組為已知含有H蛋白的樣品，陰性對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在預(yù)期分子量處出現(xiàn)特異性條帶，而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。此外，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組的條帶強(qiáng)度，可以得出H蛋白表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性，為后續(xù)疫苗研發(fā)提供了重要依據(jù)。5.2ELISA檢測(cè)(1)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）檢測(cè)是評(píng)估H蛋白表達(dá)產(chǎn)物抗原性的另一種重要方法。ELISA檢測(cè)利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)檢測(cè)酶標(biāo)記的二抗與抗原結(jié)合的信號(hào)來(lái)定量分析抗原的濃度。在本研究中，首先將純化的H蛋白作為抗原，包被在微孔板上。包被后的微孔板在室溫下干燥，以增加抗原的吸附穩(wěn)定性。(2)包被好的微孔板用洗滌液洗滌，去除未吸附的抗原。隨后，加入特異性抗體（一抗），在本研究中使用抗犬瘟熱病毒H蛋白的抗體。一抗與包被的H蛋白結(jié)合后，洗滌去除未結(jié)合的一抗。接著，加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與一抗結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)記二抗復(fù)合物。(3)加入底物溶液后，酶標(biāo)記的二抗催化底物產(chǎn)生顏色變化，顏色的深淺與抗原濃度成正比。通過(guò)比色計(jì)讀取吸光度值，可以定量分析H蛋白的表達(dá)產(chǎn)物。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值顯著高于陰性對(duì)照組，表明H蛋白表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。此外，通過(guò)與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，可以準(zhǔn)確計(jì)算H蛋白表達(dá)產(chǎn)物的濃度。ELISA檢測(cè)結(jié)果與免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了H蛋白表達(dá)產(chǎn)物的抗原性，為疫苗研發(fā)提供了重要數(shù)據(jù)支持。5.3抗原性分析(1)抗原性分析是評(píng)估H蛋白表達(dá)產(chǎn)物免疫原性的關(guān)鍵步驟。在本研究中，通過(guò)免疫印跡和ELISA兩種方法對(duì)H蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗原性分析。首先，在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Westernblot檢測(cè)，觀察到實(shí)驗(yàn)組在預(yù)期分子量處出現(xiàn)了特異性條帶，而陰性對(duì)照組未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。這表明H蛋白表達(dá)產(chǎn)物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)，并且具有良好的抗原性。(2)接著，通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)H蛋白表達(dá)產(chǎn)物的抗原性進(jìn)行了定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值顯著高于陰性對(duì)照組，這與免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了H蛋白表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。此外，通過(guò)將實(shí)驗(yàn)組的吸光度值與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比，可以準(zhǔn)確計(jì)算出H蛋白表達(dá)產(chǎn)物的濃度，為后續(xù)的疫苗研究提供了重要的數(shù)據(jù)支持。(3)結(jié)合免疫印跡和ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以得出結(jié)論：本研究中克隆和表達(dá)的犬瘟熱病毒疫苗株H蛋白基因片段在