左旋多巴多巴的工業化生產研究

摘要：左旋多巴是生物體內一種重要的生物活性物質，是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產物，它是治療帕金森病的有效藥物。本文綜述了左旋多巴的三種生產方式，即化學合成法、從植物中提取、微生物酶轉化，以及左旋多巴的提取，其中利用微生物的酪氨酸分解酶以鄰苯二酚、丙酮酸和氨為底物合成L-DOPA被證明是一種最經濟且最有前途的方法。在左旋多巴的提取中，向其反應體系中加入晶種使多巴從反應體系中析出，除去菌體和雜質，再進行重結晶可得到純度較高的多巴是一種很好的方法。關鍵詞：左旋多巴酪氨酸酚解酶微生物酶重結晶

1

前言1.1

帕金森病簡介帕金森病（Parkinson'sdisease）又稱"震顫麻痹"、巴金森氏癥或柏金遜癥，多在60歲以后發病。主要表現為患者動作緩慢，手腳或身體其它部分的震顫，身體失去柔軟性，變得僵硬

。震顫麻痹的病變原因是大腦和中腦的黑質紋狀體變性，引起神經介質多巴胺減少而出現的一系列癥狀，據統計，普通人群帕金森病的發病率為0.1%，60歲以上老人的發病率為1%，80歲以上老人發病率為2%。而左旋多巴正是治療帕金森病的常見有效藥物。1.2

左旋多巴的性質L-DOPA:化學名L-3,4一二羥基丙氨酸，它是生物體內一種重要的生物活性物質，是從L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產物。其具有臨二酚結構，性質不穩定，極易被空氣中的氧氣氧化變質。其水溶液久置后，可變黃、紅、紫，直至黑色，高溫、水、光、堿、重金屬可加速其變化。對其鑒定的方法有兩種，一種為將其溶于0.1mol/L鹽酸溶液中，遇三氯化鐵溶液顯綠色，將該溶液分兩份，一份加稀氨水顯紫色，另一份加過量的氫氧化鈉溶液顯紅色，另一種為將其水溶液加1%茚三酮溶液加熱顯紅色。1.3

左旋多巴的國內外研究進展1911年人們首次利用3，4-碳酰二氧苯甲醛為原料化學合成L-DOPA，這些年來國內外嘗試用化學合成法合成多巴的途徑有很多，到70年代初，國外化學合成多巴的產量已達150噸。雖用化學法合成多巴的途徑有許多，但遇到一個主要的困難是合成出來的產品是D-型和L-型的混合物，將二者分開較困難。1990

年,

西北工業大學的孫曉莉用可避免DL

拆旋操作的不對稱合成法合成左旋多巴,

但工藝非常復雜。1913年就有人從蠶豆籽苗種豆莢中提取天然L-DOPA，1949年從野生植物藜豆中提取出L-DOPA。國內于1972年從豆科植物藜豆種子中提取L-DOPA獲得成功，1974年商品L-DOPA投放市場。從貓豆中提取L-DOPA的得率，從1.5%已提高到3.25%。但是從植物中提取L-DOPA由于受到原料來源的限制，產量小，遠不能滿足市場需求。60年代末，國外一些學者開始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。70年代初，日本學者Yamada等對微生物酶法合成L-DOPA進行了深入的研究，通過菌種選育及發酵條件的優化于1993年在味之素公司投入工業化生產。目前國外L-DOPA的產率超過100mg/mL.80年代后期，武漢大學的彭珍榮等在國內首先開展了微生物法合成L-DOPA的研究，但至今國內尚未有工業化的報道。雖然現在國內有多家制藥廠生產L-DOPA及其藥劑，但大都是從植物中提取的。1.4

左旋多巴的應用前景多巴的衍生物多巴胺是一種重要的神經遞質，但多巴胺不能通過血腦屏障而進入腦組織，而L-DOPA可以通過血腦屏障，在腦組織中可脫羧形成多巴胺，可增加多巴胺含量而達到治療帕金森氏病的功效。L-DOPA還有其他許多用途，可用來治療腿多動綜合癥、肝昏迷、CO中毒、錳中毒和精神病、心力衰竭、潰瘍病、脫毛癥、調節人的性功能等。帕金森病是一種因大腦內多巴胺匱乏引起的神經系統疾病,

其典型癥狀為震顫、肌強直、運動減少和姿式異常。60

年代以來,

多巴胺的前體—左旋多巴一直是治療帕金森病的主要藥物。隨著我國人口老齡化速度的加快，對L-DOPA的需求將迅速增加,據1993年國家對消耗外匯的100種藥物的統計，L-DOPA的進口總金額居第17位。而目前國內市場上的L-DOPA來源絕大部分依靠進口，如何能使微生物法合成L-DOPA在國內投入工業化生產是一個急待解決的問題。運用現代生物技術對菌種進行改造，期望獲得高效表達酪氨酸酚解酶的菌株對于提高L-DOPA的產率是非常重要的。另外，固定化細胞法的進一步研究，可提高生產的連續性、穩定性、高效性。雖然L-DOPA的提取方法有多種多樣，但L-DOPA易于氧化，這樣給提取帶來許多不便。又由于L-DOPA大都被用作藥來治療帕金森病，因而對此純度要求很高，這樣對下游提取技術提出更高的要求。L-DOPA作為藥物被研究開發成為一個世界性的問題，亟待科研工作者的深入研究。2

左旋多巴的生物轉化途徑左旋多巴由芳香族氨基酸L一酪氨酸苯基的3

位上添加一個羥基而成,

可由一種或幾種前體在單一酶催化下轉化得到。因生產或研究中所用催化劑(酶或徽生物)

種類不同,

左旋多巴合成途徑也不同,

一般有以下幾種:2.1Tyrosinase轉化法TPLE.herbicoLa絲氨酸氨鄰苯二酚固定化細胞連續50h0.130.013TPLE.herbicoLa丙酮酸氨鄰苯二酚固定化細胞分批20h7.880.39TyrosinaseP.meLanogenumATCC17806突變株L-酪氨酸（轉化率<50%）一步法15h21.01.40Tyrosinase假單孢屬細菌L-酪氨酸（轉化率>90%）一步法15h7.50.50

3.3.5

植物細胞培養技術和基因工程技術的應用近年來,

國外有人把植物細胞培養技術和基因工程技術引人了合成左旋多巴的研究領域。Pras

等用固定化產酪氨酸酶植物細胞

MucunapruiensL.合成左旋多巴;Fovr則以克隆有ErwiniaherbicoLaATCC

21434有關基因的重組大腸桿菌為生產菌,克隆后的大腸桿菌能以乳糖取代酪氨酸為誘導物大量合成酪氨酸酚解酶。3.3.6利用基因工程菌合成L-DOPA90年代初人們開始運用基因工程的手段獲取TPL的基因片段，然后連接到不同的載體中讓其在宿主細胞中高效表達。90年Kurusu.Y等人構建了pGRY30-TPL1質粒，此質粒含有來自Escherichiaintermedia的酪氨酸酚解酶（I）基因。91年Kurusu,Y等人分析了Escherichiaintermedia中TPL結構基因的核酸序列，91年Fukushima.M等人構建了pHTDI質粒，比質粒在E.coLi中能高效地表達產生酪氨酸酚解酶。這個質粒產生的酪氨酸酚解酶的量比其親株Escherichiaintermedia多15倍。91年波蘭的PoLak.J等人從Cfreundii中提取出TPL基因并構建質粒。92年Hideyuki.S等人對ErwiniaherbicoLaAJ2982的TPL基因克隆到E.coLi中進行表達，再將培養的細胞轉入多巴合成體系中，反應30h后，反應液中多巴含量為105mM（20.7mg/ml）。94年，有人將編碼TPL的基因克隆到質粒載體pGY1000和pGY4000中并將其轉入E.coLi中進行表達，用于L-DOPA的生產。4L-DOPA的提取為了獲得純凈的符合標準的產品，必須有適宜的L-DOPA的提取方法。利用微生物發酵法生產L-DOPA，其最終發酵產物含有許多不溶和可溶性雜質，必須采用適當的方法除去這些雜質，分離出純凈的L-DOPA。從發酵液中提取L-DOPA的一般步驟為：（1）離心去掉菌體等不溶物，（2）采用適當方法除去一些可溶性雜質，有必要還需脫色，（3）濃縮得到結晶，再采用一定的方法純化，得到純凈的晶體。以L-酪氨酸為底物用微生物發酵法生產L-DOPA，最后的發酵產物為棕黑色液體，要從其中提取出純凈的L-DOPA，首先必須進行脫色，活性炭脫色法的人們廣為使用脫色方法。但采用活性炭進行脫色遇到一些問題，活性炭對各種天然氨基酸具有吸附作用，對芳香族氨基酸表現出最強的吸附力，吸附率達20%左右，因此在L-DOPA提取過程中用活性炭脫色損失較大。近來，有許多研究者研制和尋找新的替代活性炭的脫色劑。提取L-DOPA的方法有許多，針對不同的生產方法得到的待提取液，人們采取了各有特點的方法來提取L-DOPA。HitoshiEnei等以活性炭層析法來分離純化L-DOPA，他們將最終發酵產物的pH用濃鹽酸調至1.0，然后酸洗，水洗，最后以氨水洗脫，洗脫液經濃縮后調pH至3.5，得到沉淀以酸堿法重結晶得到純凈L-DOPA，得率為56%。TomohisaNagsaki等最終發酵產物用10%HCI調pH至2.5；然后離心去掉菌體等不溶物，上清液經真空濃縮后，用乙酸乙酯洗兩次，調pH至4.5，放置過夜得粗結晶，粗結晶用等電點沉淀法純化兩、三次，用熱水溶化，重新結晶兩次，獲得較純晶體，得率為50%。Katsujihaneda等采用Dowex50-4X（200-400目）H+-型樹脂來分離L-DOPA，Kaiser，A。等用硼酸復合物來提取L-DOPA，SeaLockR.R和Brenner.M.用鉛復合物法來提取L-DOPA，但此方法步驟較多，且產品中可能有對人體有害的鉛。BLocker.P.等用液態離子交換。Micker.D.等發現，在低于30℃的情況下，從過飽和的溶液中結晶出來的L-DOPA為針形晶體，比高于30℃情況下結晶出來的立方形晶體更純，針形晶體在加熱的情況下可變成立方體形晶體。日本在L-DOPA的提取方面作了大量的研究，他們向反應液中添加L-DOPA的無水結晶，在25℃以下繼續反應，無水結晶不斷析出。反應在25℃以上可析出一水結晶，但向其中加入無水結晶時，析出無水結晶。5

今后研究的幾個方向國外研究酶法合成左旋多巴已有較長歷史,

在培養條件和反應工藝方面的研究已很成熟,

基于國內酶法合成左旋多巴的工業化目的的考慮,

我認為以后的研究主要應從以下三個方面進行:(1)

改善菌種的產酶性能。除了使用常規誘變育種方法外,

還應在深入了解菌種產酶機理的基礎上采用代謝調控育種和代謝調控發酵的手段。(2)

降低前體對酶的抑制和失活作用。在以酪氨酸酚解酶為催化劑時,

所用前體對酶的抑制和失活作用是提高酶活利用率和生產強度的最主要的限制因素,為解決這個問題,

應從兩個方向入手:

尋找現有前體的替代物質或對現有前體進行適當處理,

如鄰苯二酚—硼酸復合物的使用:

摸索合適的反應條件和前體的流加方法,

把抑制和失活作用控制在最小。(3)

充分發掘固定化細胞法的潛力。理論上,

固定化細胞法比較適合于由含輔助因子酶催化的左旋多巴合成反應,

但目前的研究結果并不理想為達到工業化目的,

應在固定化方法的選擇(如固定化增殖細胞)、反應方式的選擇和反應器的設計等方面進行深人研究。6

總結通過對資料的查閱，我得知自然界中的許多細菌,如嗜麥芽假單胞菌，Escherichia（埃系氏菌屬）、proteus變形菌屬和Erwinia（歐文氏菌屬）具有酪氨酸酚解酶的合成能力,

其中的Erwinia

herbicoLa（草生歐文氏菌屬）經常在研究中使用。草生歐文氏菌屬：屬于桿菌屬，是酷似大腸桿菌的一種細菌。寄生于植物并引起腐敗病。由于它帶有果膠多聚半乳糖醛酸酶，因而侵害植物。但是通過對有關文獻的閱讀，我發現近年來有關左旋多巴的生產報導還是很少的，國內在這個領域的研究與國際水平還相差很多，但是我國醫藥行業對左旋多巴的需求卻是在不斷增加，我希望在我的實驗中能夠通過篩選獲