ICS65.020DB22B05吉林省地方標準DB22/T2946—2018野生大豆抗胞囊線蟲鑒定技術規范Technicalspecificationsforbioassayofwildsoybeanresistancetosoybeancystnematode(Heteroderaglycines)吉林省市場監督管理廳發布DB22/T2946—2018前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由吉林省農業農村廳提出并歸口。本標準起草單位：吉林省農業科學院。本標準主要起草人：袁翠平、董英山、王玉民、趙洪錕、劉曉冬、齊廣勛、王英男、李玉秋、顏秀娟。IDB22/T2946—2018野生大豆抗胞囊線蟲鑒定技術規范1范圍本標準規定了野生大豆對大豆胞囊線蟲抗性的鑒定方法和抗性評價。本標準適用于野生大豆種質資源對大豆胞囊線蟲的抗性鑒定與評價。2術語和定義下列術語和定義適用于本文件。2.12.22.3胞囊cyst大豆胞囊線蟲雌蟲，每個胞囊內約含200粒～600粒卵，從胞囊中孵化出來即為二齡幼蟲。胞囊指數（雌蟲指數）femaleIndex（FI）接種后28d~30d，供試植株根系上的胞囊數占感病對照植株根系上胞囊數的百分比。在形態上沒有差異，但在寄主上具有顯著致病性差異的大豆胞囊線蟲群體，需采用特定的一套鑒別3.1.1.1宜使用本地區優勢HGtype或混合大豆胞囊線蟲群體。3.1.1.2將含有大于30個/100g胞囊的病土裝入高度16cm～25cm，盆口徑15cm～25cm的塑料盆中，播種高感大豆品種，每盆3株～5株。3.1.1.3出苗后30d～35d，將大豆根系輕輕拔出，用高壓水槍沖洗根系，將根系上的胞囊收集于干凈的塑料桶內。3.1.2胞囊和二齡幼蟲懸浮液的制備3.1.2.1將含有胞囊的懸液倒入自上而下依次為20目,40目,60目的套篩上，將胞囊收集在60目網篩上。3.1.2.2將3.1.2.1收集到的胞囊用橡膠棒碾碎，使之釋放出卵和少數的二齡幼蟲。用洗瓶沖洗卵和二齡幼蟲，將其沖入自上而下依次為200目，500目的套篩上，將卵和二齡幼蟲收集在500目網篩上。用洗瓶將500目網篩上的卵和幼蟲轉移到燒杯中，加水配制成卵和幼蟲懸浮液。1DB22/T2946—20183.1.2.4搖勻并用100μL的移液器吸取一定量的卵和幼蟲懸浮液置于載玻片上，通過40倍顯微鏡觀察計數卵和幼蟲，配制成2000個/mL卵和幼蟲的懸浮液，備接種用。3.2接種植物的準備3.2.1種子消毒將健康飽滿待鑒定的野生大豆、感病對照種子，用1%次氯酸鈉溶液浸泡3min，期間攪動2次～3次，然后用滅菌的蒸餾水沖洗3次～4次。3.2.2種子萌發3.2.2.1消毒后的野生大豆種子在萌發前用無菌刀片在遠胚芽處劃破種皮。3.2.2.2將滅菌的濾紙放置在滅菌的培養皿內，然后將種子放置在濕潤的濾紙上，于光照培養箱中25℃發芽3d，期間保持濾紙濕潤。3.2.3幼苗移栽3.2.3.1抗胞囊線蟲鑒定試驗在溫度保持在27℃±2℃溫室內進行。3.2.3.2試驗完全隨機或隨機區組設計，設3次重復，每個重復5株。3.2.3.3在直徑27cm，高30cm的塑料桶中放入5cm厚的滅菌細砂，然后將直徑4cm，長25cm兩端通透的PVC管插入細砂中，每個桶約插入20個PVC管，PVC管內和管間填好細砂，且高度一致，細砂距離上管口2cm。3.2.3.4將萌發3d健壯的幼苗移栽于PVC管中，每管移栽1株，將移栽后的塑料桶置于27℃～28℃的自動恒溫水浴箱中。在距離供試植株1cm處用玻棒扎一個深4cm～5cm的孔，用移液器向孔中注射1mL的卵和幼蟲懸浮液，用滅菌的細砂將孔填平。苗期及時澆水，保持細砂濕潤，溫室溫度保持在27℃±2℃，每個處理定期施用等量營養液。3.5.2.1.1將PVC管連同細砂和植株從桶中輕輕拔出，用高壓水槍沖洗PVC管，將細砂和植株沖洗2DB22/T2946—20183.5.2.1.2將含有胞囊和細砂的懸濁液過20目,40目,60目的套篩，再向塑料桶注入自來水，搖勻，將含有胞囊和細砂的懸濁液再過20目,40目,60目的套篩，如此重復2次，將胞囊收集在60目網篩上，將收集的胞囊用自來水沖洗轉移到15mL塑料管中保存。3.5.2.2胞囊計數將收集在15mL塑料管的胞囊混合液倒入計數培養皿中，并用少量水沖洗塑料管內壁，倒入計數培養皿中，然后于20倍顯微鏡計數，即為該供試植株的根系胞囊數。3.5.2.3記載方法分別記載每個重復每個供試品種和感病對照的胞囊數（表1）。表1野生大豆抗胞囊線蟲鑒定調查匯總表胞囊數平均胞囊數個供試材料感病對照重復胞囊指數抗性級別個12345ⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢⅠⅡⅢ3DB22/T2946—2018根據胞囊指數確定供試野生大豆種質的抗性水平。按照下列公式（1）計算。FIT100.....................................(1)C式中：T——供試種質的平均胞囊數，單位為個每株（個/株）；C——感病對照