ICS11.220DB22B41吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)DB22/T2788—2017貓泛白細(xì)胞減少癥診斷實時熒光PCR法ThediagnosticofFelinepanleukopeniavirusReal-timePCRmethod吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2788—2017前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林省動物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：程榮華、呼延含蓉、王開、郭衍冰、王楠、丁世杰、邵洪澤、于欽磊、白翠、李昱潔、陸偉、何浩、劉沂霖、趙欣、肖玉海、王輝。IDB22/T2788—2017貓泛白細(xì)胞減少癥診斷實時熒光PCR法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貓泛白細(xì)胞減少癥實時熒光PCR方法的縮略語、材料、操作步驟和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于貓泛白細(xì)胞減少癥的實驗室診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3縮略語下列縮略語適用于本文件。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）Ct：循環(huán)閾值（Cyclethreshold）高速冷凍離心機，12000r/min以上。1DB22/T2788—20174.2.71000mL量筒。4.2.81000mL容量瓶。4.2.9PCR八聯(lián)排管。4.2.10吸頭，10μL，200μL，1000μL。4.2.11醫(yī)用棉簽。4.3試劑除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中一級水的要求。4.3.10.02mmol/LPBS，見附錄A。4.3.2基因組DNA提取試劑盒。4.3.3SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）。4.3.4滅菌雙蒸水。4.4引物上游引物F：5'-AATGCTTGGGGAGTTTGGTTT-3'。下游引物R：5'-TTTAGTTGGTGGCTGAGTAGCAGA-3'。5操作步驟5.1采樣器具前處理組織勻漿器或研缽（4.2.1）、醫(yī)用剪刀（4.2.2）、鑷子（4.2.3）經(jīng)160℃干熱滅菌2h。5.1.2離心管經(jīng)121℃±2℃高壓蒸汽滅菌15min。5.2樣品的采集和處理5.2.1用拭子（4.2.11）采集貓眼周分泌物、鼻液、糞便，采集樣品的拭子用少量PBS（4.3.1）浸潤后，3000r/min離心15min，取上清液待檢。5.2.2采集病死貓腸道、肝、脾等組織器官，加等體積PBS（4.3.1）研磨勻漿，3000r/min離心15min，取上清液待檢。5.3DNA提取按照基因組DNA提取試劑盒說明書要求操作，提取的基因組DNA應(yīng)迅速進(jìn)行熒光定量PCR擴增，或置于-20℃冰箱（4.1.4）備用。5.4反應(yīng)體系上游引物F(10μmol/L)下游引物R(10μmol/L)待檢樣品DNA滅菌雙蒸水2DB22/T2788—2017表1（續(xù)）試劑劑量SYBRPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）總體積12.5μL25.0μL5.4.2以滅菌雙蒸水為陰性對照，以貓泛白細(xì)胞減少癥病毒基因組DNA或含目的片段的陽性質(zhì)粒為陽性對照。5.5反應(yīng)程序?qū)崟r熒光PCR反應(yīng)程序見表2。表2實時熒光PCR反應(yīng)程序溫度℃時間s循環(huán)數(shù)反應(yīng)步驟第一步次19530595第二步4060306結(jié)果判定6.1結(jié)果分析條件設(shè)定試驗檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值直接讀取檢測結(jié)果，Ct值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點，不同儀器可對閾值線的位置進(jìn)行調(diào)整，然后讀取檢測結(jié)果。6.2.1陰性對照無Ct值并且無典型擴增曲線。6.3.335.0＜Ct值≤40.0，出現(xiàn)特定的擴增曲線，樣品判為疑似。應(yīng)重新采樣檢測，結(jié)果仍為疑似，判定為陽性。3DB22/T2788—2017AA附錄A（規(guī)范性附錄）磷酸緩沖生理鹽水A.1A液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2B液0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）31.21g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.30.02mol