任務一器官培養（一）莖段培養任務二器官培養（二）植物的再生培養任務三培養物的不良表現及改進措施任務四花卉的組織培養任務五水果作物的組織培養任務六植物液體培養常見植物組配方法與易發問題處理項目四常見植物組培方法與易發問題的處理任務六植物的液體培養

一般掌握液體培養基與固體培養基的區別；掌握液體培養基的配制方法及流程；

掌握馬鈴薯莖段液體接種的流程及要點。知識目標123能夠根據不同植物及種類選擇液體培養；能夠根據不同的植物器官及器官狀態，進行液體培養；會通過觀察試管苗的長勢，大體判斷采取何種措施改善培養條件；熟練液體培養組培苗的轉接操作流程；熟練各種試管苗繼代培養過程中的切割方式與技術；技能目標12345學習提示多動手，勤實踐；多比較，多聯想，勤歸納；手、口、腦并用，學做合一。理論閱讀

植物液體培養主要在植物細胞培養中應用廣泛，主要是離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖來獲得大量細胞群體。液體培養可分為靜止培養和振蕩培養等兩類。靜止培養不需要任何設備，適合于某些原生質體和輕質植物莖段的培養。振蕩培養需要搖床或轉床等設備使培養物和培養基保持充分混和以利于氣體交換。

液體培養有以下優點：（1）增加培養細胞與培養液的接觸面，改善營養供應；（2）可帶走培養物產生的有害代謝產物，避免有害代謝產物局部濃度過高等問題；（3）保證氧的充分供給。所以，液體培養的生長條件比固體培養有很大的改善。實際應用

植物莖段的液體培養基同固體培養基的種類及成分大體一致，唯一不同在于固體培養基含有瓊脂等作為支撐物，液體培養及不含瓊脂等。

第一節液體培養基的配制一、根無性繁殖系的建立1.外植體

根的培養材料一般來自無菌種子發芽產生的幼根或植株根系經滅菌處理后的切段。2.根無性繁殖系的建立

將種子進行表面消毒，在無菌條件下萌發，待根伸長后從根尖一端切取長1.2cm的根尖（或植株的根系經表面滅菌后）接種于培養基中。這些根的培養物生長甚快，幾天后發育出側根。待側根生長約一周后，即切取側根的根尖進行擴大培養，它們又迅速生長并長出側根，又可切下進行培養，如此反復，就可得到從單個根尖衍生而來的離體根的無性繁殖系。這種根可用來進行根系生理生化和代謝方面的實驗研究。油棕根培養（引自劉進平，2005）二、培養方法一、植株再生培養根的離體培養也可以用來再生植株。第一步誘導形成愈傷組織；第二步在再分化培養基上誘導芽的分化，在愈傷組織上分化成小植株。

需要注意的是，愈傷組織如果先分化形成根則往往抑制芽的形成。再生培養流程再生培養視頻

視頻4-1-1再生培養

二、固氮培養

通過分離和培養具有固氮作用的根瘤菌，接種到禾谷類等作物的試管苗根系中，可以實現谷物直接利用生物固氮的捷徑。通過選擇有效的適當濃度的誘瘤劑誘導根瘤菌侵入試管苗根部結瘤固氮，固氮菌接種時要給根系創造傷口，以利于根瘤菌的侵入。接種根瘤菌形成的根瘤具有一定的固氮活性并向宿主提供氮素，能促進植株生長和氮營養的改善，無論在株高、鮮重和葉綠素含量都有提高。

二、培養方法三、影響因素1.植物種類2.培養基多為濃度低的White培養基，許多植物在1/2MS培養基上能生根。糖的使用濃度應稍低，如玫瑰生根蔗糖為2%。3.生長物質培養基中添加適宜濃度的生長素有利于根的形成和生長，常用生長素為IAA、NAA、IBA，濃度范圍一般為0.0-1.0mg/L。三、影響因素4.pH根的培養適宜的pH范圍為5.0~6.0，5.光照大多數人認為，黑暗有利于根的形成。試管苗的生根一般無需考慮光照的影響，有時加一點活性炭可減弱光照，對植物的生根比較有利。6.溫度生根溫度一般控制在16~25℃。第二節莖尖培養

意義：莖尖不僅生長速度快、繁殖率高、不易產生遺傳變異，而且是獲得無病毒苗木的有效途徑，故莖尖培養是植物組織培養最常用的試材之一。類型：莖尖培養分為微莖尖培養和普通莖尖培養。微莖尖指帶有1～2個葉原基的生長錐，其長度不超過0.5mm。普通莖尖指較大的莖尖（如幾mm到幾十mm）、芽尖及側芽。這里主要講普通莖尖培養。這種培養技術簡單，操作方便，莖尖容易成活，成苗所需時間短。一、普通莖尖培養1.取材

挑選雜菌污染少，生長不久的莖尖。木本植物可在取材前對莖尖噴幾次滅菌藥劑。以保證材料不帶或少帶雜菌。用于普通莖尖培養，可先從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2cm以上的頂梢。莖尖取材示意圖視頻4-1-2外植體采集與處理視頻外植體采集與處理視頻

莖尖的解剖構造（引自劉進平，2005）一、普通莖尖培養2.滅菌將采到的莖尖切成0.5～1.0cm長，并將大葉除去，休眠芽預先剝除鱗片。將莖尖置于流水沖洗2～4小時(視干凈程度），再在70%的酒精中處理10-30秒，然后在稀釋5～10倍的次氯酸鈉（商品次氯酸鈉為10%）中浸10～15分鐘，最后用無菌水沖洗3～4次，或者用0.1～0.2%的氯化汞滅菌5～10分鐘，無菌水沖洗5次以上。莖尖滅菌視頻4-1-3外植體滅菌外植體滅菌視頻一、普通莖尖培養

3.接種

為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0.5cm左右大小。有些植物的莖尖由于多酚氧化酶的氧化作用而發生褐化，使培養基變褐，影響材料的成活。所以在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接，減少傷口在空氣中暴露的時間，也可配制1～5%Vc液，將切下的莖尖材料浸入處理一下。視頻4-1-4接種接種視頻一、普通莖尖培養

4.培養（1）培養基多數莖尖培養采用MS作為基本培養基或改良MS培養基。培養基中生長素是必須的，如2,4-D，IAA，NAA等，一般用0.1mg/L左右，高于此濃度，往往產生畸變芽或形成愈傷組織。莖尖在培養過程中會出現生長太慢、生長太快和生長正常等三種類型。

桑樹莖尖萌發

桑樹莖尖萌發

楊樹頂芽萌發成叢生芽楊樹頂芽萌發成叢生芽

一、普通莖尖培養

4.培養（2）初代培養

莖尖的初代培養主要是通過適宜的培養條件刺激頂芽和腋芽的生長。外植體啟動生長的關鍵主要是培養基的激素配比與濃度，一般應使用較高濃度的細胞分裂素和較低濃度的生長素，解除頂端優勢的抑制作用，生長素濃度過高容易產生愈傷組織。視頻4-1-5初代培養初代培養視頻一、普通莖尖培養

4.培養

（3）繼代培養

莖尖長成的新梢，可切成若干小段，轉入到增殖培養基中。長大后又可切成小段，再轉入新培養基，這樣一代一代繼續下去，便建立和維持了莖尖無性繁殖系。繼代培養的激素濃度要降低或用MS0培養基。有時也可邊進行繼代培養邊進行誘導生根。取比較長的新梢（如2cm以上）轉入生根培養基，余下較短的新梢繼續進行繼代培養。視頻4-1-6繼代培養繼代培養視頻一、普通莖尖培養

4.培養（4）誘導生根誘導生根多采用1/2MS培養基，即MS培養基的各種組成成份用量均減半的培養基。并加入一定的生長素類調節物質，如NAA、IBA等。也可將切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液中處理4～8小時，然后轉移到無激素的生根培養基中。注意較高濃度的生長素對生根有抑制作用。視頻4-1-7生根培養生根培養視頻單芽莖段微繁示意圖

單芽莖段微繁示意圖單芽莖段增殖示意圖單芽莖段增殖示意圖叢生芽微繁示意圖（引自劉進平，2005）叢生芽微繁示意圖叢生芽增殖示意圖（5）培養條件

每天照光16小時，照度1500～3000Lx即可，溫度通常為25±2℃。一般莖尖培養在40天左右可長成新梢，進行繼代培養。4.培養一、普通莖尖培養5．馴化移栽

生根培養一個月左右，多數新梢即可獲得生長健壯而發達的根系。移植時可根據生根情況來進行。若發現新梢基部生有較濃密的不定根，長度在1cm以內，就可移栽入土。移栽時通過幾天的煉苗過程，從試管中取出小植株，輕輕洗掉培養基。栽后給予較高的空氣濕度條件。一、普通莖尖培養視頻4-1-8馴化馴化視頻

首先營養缽的培養土要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭小拱棚，以減少水分的蒸騰，初期要常噴霧處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現。當發現小苗有生長趨勢，可逐漸減少濕度將拱棚兩端打開通風，并且減少噴水次數。使小苗適應濕度較小的條件。以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，少澆水或不澆水，促進小苗長得粗壯。

最適宜的溫度是16～20℃，春季地溫較低時，可用電熱線來加溫。光照管理上，初期可用較弱的光照，在小拱棚上加蓋遮陽網或報紙等，以防陽光灼傷小苗和增加蒸騰作用，后期可直接利用自然光照。為了提高馴化效率，可用育苗盤進行馴化生根，選擇2cm左右孔徑的育苗盤即可?？籽ㄑb入蛭石：珍珠巖：草炭土為1︰1︰0.5的基質。第三節莖段培養

莖段培養是指對植物帶有一個以上芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖的幼莖切段）進行培養的技術。莖段培養的主要目的是進行植物的離體快速繁殖。莖段培養用于快速繁殖的優點在于：培養技術簡單易行、繁殖速度較快；芽生芽方式增殖的苗木質量好，且無病、變異小、性狀均一等。第三節莖段培養一、無菌培養物的建立1.取材

取生長健壯無病蟲的當年生幼嫩枝條或鱗莖盤，去掉葉片，剪成3～4cm的小段。取材時注意莖的基部比頂部切段、側芽比頂芽的成活率低，所以應優先利用頂部的外植體，但由于每個新梢僅一個頂芽，也可利用腋芽，莖上部的腋芽培養效果較好。還應注意盡量在生長期取芽，如蘋果在3～6月取材的成活率為60%，7～11月下降到10%，12～2月都在10%以下。一、無菌培養物的建立

視頻4-1-9取材取材視頻2.滅菌

20分鐘，如果材料表面有絨毛應在消毒劑中滴加1-2滴土溫—20或80。因材料老嫩和蠟質多少而定時間。最后用無菌水沖洗數次以致干凈，否則植物材料會受殘留滅菌劑的危害。一、無菌培養物的建立視頻4-1-10滅菌視頻滅菌視頻3.接種

消毒好的莖段用鋒利的解剖刀或剪刀剪去兩端消毒劑殺傷的部位，分切成單芽小段接種于預先配好的誘導側芽萌發的培養基中，一般每瓶接種一塊外植體，防止交叉感染。一、無菌培養物的建立視頻4-1-11接種接種視頻二、培養方法和程序1.培養

最常用的基本培養基為MS培養基，加入3%蔗糖，用0.7%的瓊脂固化。培養條件保持25℃左右，給予充分的光照和光期。經培養后莖段的切口特別是基部切口上會長出愈傷組織，呈現稍許增大，而芽開始長長，有時會出現叢生芽，從而得到無菌苗。二、培養方法和程序

月季莖段側芽萌發（引自譚文澄、戴策剛，1991）月季莖段側芽萌發

在莖段培養中，促進腋芽增殖用6-BA是最為有效的。生長素雖不能促進腋芽增殖，但可改善苗的生長。GA對芽的伸長有促進作用。繼代擴繁是莖段培養的主要一步。這可由二種途徑解決：一是促進腋芽的快速生長；二是誘導形成大量不定芽。二、培養方法和程序莖段快繁方式模式圖

第一種途徑的好處是不會產生變異，能保持品種優良特性，且方法簡便，可在各種植物上使用。每年從一個芽可擴繁增殖10萬株以上。莖段快繁方式模式圖第二種途徑（誘導形成大量不定芽）有時會產生變異。

繼代增殖過程所用培養基和生長調節劑與初代培養相同，有時會稍低。二、培養方法和程序

生根培養主要是降低或除去細胞分裂素而加入生長素。由于在苗增殖時施用了較高濃度的細胞分裂素，其苗中保持著一定的量，因此在生根培養中不需要加細胞分裂素。生長素的濃度，NAA一般為0.01～1.0mg/L，IBA和IAA可稍高。

生根培養時最好在培養基中加0.3%活性炭，以促進生根。二、培養方法和程序二、培養方法和程序2.移植

這是組織培養的關鍵一環。試管苗是在恒溫、濕度飽和、營養豐富、激素適當和無菌條件下生長的。植物的組織發育程度不高，植株幼嫩，表皮角質層變薄，抵抗力減弱