3-2基因工程的基本操作程序基因工程選擇性必修3巴甫洛夫1849.9.26—1936.2.02基因表達載體的構建二、基因表達載體的構建

游離的“殺蟲(基因)”直接進入棉花細胞，一般會被分解，就算能表達，也不能隨細胞分裂進行增殖，導致子代無該基因，若游離DNA能整合到染色體DNA上，或者能在細胞內獨立穩定存在，能自我復制，則該游離DNA會隨著細胞分裂傳給子代

獲取了足夠量的目的基因（Bt基因）后，下一步就是要讓目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發揮作用，這就需要構建基因表達載體。這一步是培育轉基因抗蟲棉的核心工作。蘇云金芽孢桿菌產生Bt基因直接導入抗蟲棉培育棉花細胞核DNA×基因表達載體二、基因表達載體的構建基因表達載體標記基因復制原點終止子啟動子插入目的基因位于基因的上游；RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNADNA復制的起始位點人們所需要的基因位于基因的下游；終止轉錄便于重組DNA分子的篩選（將含有目的基因的受體細胞篩選出來）組成二、基因表達載體的構建組成啟動子位于基因上游，是RNA聚合酶識別和結合位點，驅動基因轉錄。組成型啟動子（一直干活）組織特異性啟動子（特定組織中干活）誘導性啟動子（特定誘導物下干活）終止子位于基因下游，提供轉錄終止的信號。基因表達載體標記基因復制原點終止子啟動子插入目的基因二、基因表達載體的構建拓展：非編碼區非編碼區原核生物基因啟動子終止子編碼區非編碼區非編碼區真核生物基因啟動子終止子編碼區外顯子內含子真、原核生物基因的結構及轉錄和加工過程轉

錄前體mRNA加

工成熟mRNA轉

錄mRNA注意：啟動子和終止子都是DNA序列，而起始密碼子和終止密碼子則位于mRNA

上，分別是翻譯的起點和終點。二、基因表達載體的構建構建過程目的基因限制酶切割位點構建程序：先用同種限制酶或能產生相同末端的限制酶（同尾酶）切割載體和含有目的基因的片段，再用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體上，形成重組DNA分子標記基因啟動子限制酶切割位點終止子復制原點限制酶限制酶DNA連接酶二、基因表達載體的構建思考討論載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’11.使用一種DNA限制酶進行切割，共有幾種連接情況?二、基因表達載體的構建思考討論2.構建基因表達載體時目的基因插入的位置應該在哪里？為什么？啟動子下游和終止子上游。因為只有插入在啟動子和終止子之間，目的基因才可以正常表達基因表達載體標記基因復制原點終止子啟動子插入目的基因如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SamⅠ。所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(1)不破壞目的基因原則：(2)保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：二、基因表達載體的構建思考討論3.限制酶的選擇原則二、基因表達載體的構建思考討論3.限制酶的選擇原則(3)確保出現相同黏性末端原則：與只使用PstⅠ相比較，使用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點是什么？①可以防止質粒、目的基因的自身環化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。對點訓練A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質粒，可得到2條DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割質粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會破壞目的基因C.構建重組DNA時，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時切割質粒和外源DNAD.導入了重組DNA的細菌能在含四環素的培養基上生長而不能在含氯霉素的培養基上生長1.(2023·江蘇蘇州高二期末)某科研小組利用質粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構建重組DNA。下列分析不正確的是（）03將目的基因導入受體細胞三、將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞的方法，因為受體細胞的不同而有所區別。

轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。

導入方法：實質：將目的基因整合到受體細胞基因組中。花粉管通道法（我國科學家獨創）農桿菌轉化法（常用）導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞顯微注射法Ca2+處理法三、將目的基因導入受體細胞1.花粉管通道法

植物花粉在柱頭上萌發后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后滴加純化的表達載體，使目的基因借助____________進入受體細胞。我國的________________就是用此種方法獲得的。花粉管通道轉基因抗蟲棉含目的基因的重組Ti質粒Ti質粒T-DNA三、將目的基因導入受體細胞2.農桿菌轉化法目的基因構建表達載體轉入農桿菌含重組Ti質粒的農桿菌導入植物細胞表現新性狀的植物轉基因植物細胞染色體DNA植物葉片切下與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，或將花序培養在農桿菌溶液中，獲得種子，然后篩選、鑒定組培三、將目的基因導入受體細胞2.農桿菌轉化法

把目的基因插入到農桿菌的__________的________上，構建重組質粒。將重組質粒轉入農桿菌，然后用農桿菌侵染植物細胞。侵染過程中，目的基因隨著__________轉移到植物細胞，并插入到植物細胞的____________上。轉基因的植物細胞還需要通過_________________技術才能發育成轉基因植株。Ti質粒T-DNAT-DNA染色體DNA植物組織培養三、將目的基因導入受體細胞3.顯微注射法目的基因的表達載體提純取卵(受精卵)顯微注射受精卵發育獲得具有新性狀的動物①個體大，易操作。②受精卵全能性高，易培養成完整個體。原因顯微注射法三、將目的基因導入受體細胞4.導入微生物細胞操作方法：Ca2＋處理過程：Ca2+處理細胞感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA分子42℃,1min冰上3min原核生物作為受體細胞的優點：繁殖周期短、體積小易于培養操作、多為單細胞、遺傳物質相對較少等大腸桿菌細胞Ca2+處理大腸桿菌細胞，可使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。三、將目的基因導入受體細胞4.導入微生物細胞

早期的基因工程操作都用____________作為受體細胞，其中以大腸桿菌應用最為廣泛。轉化大腸桿菌細胞最常用的方法是：首先用______處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，這種細胞稱為__________細胞。第二步是將重組表達載體DNA分子溶于______液中與感受態細胞混合，在一定的溫度下促進感受態細胞吸收DNA分子，完成轉化過程。原核生物Ca2+感受態緩沖原核生物繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等思考：為什么早期基因工程都用原核細胞作為受體細胞？Ca2+處理細胞感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA分子42℃,1min冰上3min04目的基因的檢測與鑒定四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（1）檢測目的基因是否導入——

通過PCR等技術檢測提取DNAPCR操作是否擴增出目的基因M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；電泳操作害蟲死亡抗蟲棉PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（2）檢測目的基因是否轉錄出mRNA——

通過PCR等技術檢測M3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發生轉錄提取mRNAPCR操作是否擴增出目的基因對擴增產物進行檢測害蟲死亡逆轉錄產生DNA抗蟲棉四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測（3）檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交四、目的基因的檢測與鑒定2.個體生物學水平的檢測

例如，一個抗蟲或抗病的目的基因導入植物細胞后，是否賦予了植物抗蟲或抗病特性，需要做____________________實驗，以確定是否具有抗性以及____________。又如，有的基因工程產品需要與天然產品的功能進行活性比較，以確定轉基因產品的__________是否與天然產品相同。抗蟲或抗病的接種抗性的程度功能活性四、目的基因的檢測與鑒定2.個體生物學水平的檢測轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常常見轉基因生物在個體水平上鑒定、檢測的方法（列舉如下表）四、目的基因的檢測與鑒定【拓展】利用基因探針來檢測目的基因是否導入或者轉錄基因探針：是一小段單鏈的DNA或RNA，帶有放射性同位素標記，并能與目的基因的的一條鏈發生堿基互補配對。DNA1DNA2四、目的基因的檢測與鑒定【拓展】利用基因探針來檢測目的基因是否導入或者轉錄基因探針：一段帶有檢測標記（熒光或同位素標記）且順序已知的與目的基因能互補的核酸序列（DNA

或

RNA）。檢測方法：將待測DNA或RNA與基因探針混合，如果發生了核酸雜交，則說明有目的基因。DNA分子雜交四、目的基因的檢測與鑒定【拓展】利用基因探針來檢測目的基因是否導入或者轉錄DNA分子雜交分子雜交教材課后習題·概念檢測1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基