ICS11.220DB21B41遼寧省地方標準DB21/T3273—2020豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實時熒光定量PCR鑒別方法ATaqManReal-timePCRMethodforDifferentiationofWild-typeStrainfromgE-deletedVaccineStrainofPseudorabiesVirus遼寧省市場監督管理局發布DB21/T3273—2020目次前言................................................................................II12345678范圍..............................................................................1規范性引用文件....................................................................1縮略語............................................................................1儀器和耗材........................................................................1試劑和材料........................................................................1樣品采集、處理和運輸..............................................................2熒光qPCR操作程序.................................................................3結果判定..........................................................................4附錄A（規范性附錄）溶液配制........................................................6附錄B（規范性附錄）引物和探針......................................................7IDB21/T3273—2020前言本標準根據GB/T1.1-2009的有關規定進行制定。本標準由遼寧省農業農村廳提出并歸口管理。本標準負責起草單位：遼寧省農業發展服務中心。本標準起草人：蘭德松、顧貴波、周維、楊洺揚、李可心、孫世宇、張健、劉賀、李旭、高原、丁靜。本標準發布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復并認真處理，根據實際情況依法進行評估及復審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農業農村廳（沈陽市和平區太原北街2號），聯系電話準起草單位通訊地址：遼寧省農業發展服務中心（沈陽市皇姑區寧山東路29號），聯系電話IDB21/T3273—2020豬偽狂犬病毒野毒株與gE基因缺失疫苗株TaqMan實時熒光定量PCR鑒別方法1范圍本標準規定了豬偽狂犬病毒（pseudorabiesvirus,PRV）野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan熒光PCR檢測方法。本標準適用于豬血液、組織臟器、精液、鼻腔拭子和細胞培養物等材料中PRV核酸的檢測以及PRV野毒株與gE基因缺失疫苗株病毒核酸的鑒別檢測。本標準的實驗操作應在生物安全II級實驗室（BSL-2實驗室）中進行。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682NY/T541分析實驗室用水規格和試驗方法獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范糖蛋白D（glycoproteinD）gE糖蛋白E（glycoproteinE）偽狂犬病病毒（pseudorabiesvirus）熒光PCR儀、高速冷凍離心機（可控溫至4℃，離心速度可達12000r/min以上）、組織研磨儀或研缽、自動化核酸提取儀（如選用商品化核酸提取試劑盒）、PCR微量離心機、2℃～8℃普通冰箱、-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低溫冰箱、移液器（量程0.1μL～2μL、2μL～20μL、20μL～200μL）。無菌無DNA酶的1.5mL離心管、0.2mLPCR反應管或八聯管或96孔反應板、與移液器匹配的吸頭。1DB21/T3273—2020?5.1DNAzolReagent：商品化DNA提取試劑，2℃～8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取試劑盒（如磁珠法核酸提取試劑），通常18℃～25℃保存。5.25.3無水乙醇：-20℃普通冰箱中預冷。75%乙醇：用無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃普通冰箱中預冷。5.4PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2），配制見附錄A。5.58mmol/LNaOH溶液，配制見附錄A。5.62×TaqManFastqPCRMasterMix：為商品化探針法實時熒光PCR反應專用試劑，包含反應所需的緩沖液、酶、dNTP、Mg+等的預混液，-20℃普通冰箱中保存，避免反復凍融。5.75.8引物和TaqMan探針，序列見附錄B。陽性對照和陰性對照：陽性對照使用PRV野毒株細胞培養物、Bartha-K61疫苗毒，陰性對照采用滅菌雙蒸水或健康豬的組織材料。5.96除非另有說明，在檢測中所用的試劑均為分析純，實驗室用水應符合GB/T6682的要求。樣品采集、處理和運輸采樣前準備6.1參照NY/T541中第5.1條的要求。血液：參照NY/T541中第6.1條中豬血液樣品采集的要求進行，將采集的血液注入含1/10體積組織臟器：參照NY/T541中第6.2條和6.3條中的要求進行，將采集的病死豬或剖殺豬主要臟器（腦組織、三叉神經節、扁桃體、肺臟、淋巴結等）或活體采集的扁桃體裝入滅菌的15mL～50mL離心管中，鼻腔拭子：參照NY/T541中第6.4條中的豬鼻腔拭子采集要求進行，將拭子樣品放入PBS緩沖液（0.02細胞培養物：細胞培養物反復凍融3次，第3次解凍后，4℃4000g離心10min，取上清轉入新的無菌無DNA酶的1.5mL離心管中，編號備用。2DB21/T3273—20206.47樣品運輸參照NY/T541中第9條的要求。熒光qPCR操作程序7.1DNA提取在實驗室的核酸提取區進行。7.1.1DNAzol手工提取7.1.1.1取n個無菌無DNA酶的1.5mL離心管，n為待檢樣品數+陽性對照+陰性對照，對每個離心管進行編號。7.1.1.2每管加入800μLDNAzol，分別加入被檢樣品、陽性對照、陰性對照各200μL，顛倒混勻，室溫靜置5min；4℃10000g離心10min。7.1.1.3取900μL上清，轉入新的無菌無DNA酶1.5mL離心管中，加入500μL預冷的無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置3min；4℃10000g離心5min。7.1.1.4棄上清，沿管壁緩慢加入1mL-20℃普通冰箱中預冷的75%乙醇，顛倒混勻，4℃10000g離心5min。重復洗滌2次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干或用移液器小心移去殘液。7.1.1.57.1.2用50μL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，DNA在-20℃以下保存備用。核酸提取儀提取按照與核酸提取儀匹配的核酸提取試劑盒說明書提取。將提取的DNA轉入新的無菌無DNA酶的1.5mL離心管中，在-20℃以下普通冰箱中保存備用。在試劑配制區進行。gD基因和gE基因的反應體系相同。設熒光qPCR反應管數為n，n為待檢樣品數+陽性對照管數+陰性對照管數，每個反應體系見表1，配制體系時建議按照n+1個反應進行配制，配制反應體系建議在冰盒中進行；配制好的反應液充分混勻后，按照每管18μL分裝于PCR反應管內，并做好標識。3DB21/T3273—2020在核酸提取區進行。每個反應管中按順序分別加入2μL待檢樣品、陽性對照、陰性對照DNA溶液，蓋好蓋子后，PCR微量離心機瞬時離心30s，轉移至PCR擴增區。7.2.3qPCR擴增檢測在PCR擴增區進行。7.2.3.1熒光通道將PCR反應管放入熒光PCR儀內，設置探針：5’端選擇FAM熒光通道，3’端選擇無（none）熒光。7.2.3.2熒光qPCR反應條件gD和gE基因熒光qPCR反應條件均為：94℃3min；94℃15s，60℃45s，收集熒光，40個循環。8結果判定8.1閾值設定閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增的最高點為準。8.2質量控制8.2.18.2.28.2.38.3陰性對照無Ct值，且無典型的S型擴增曲線。陽性對照FAM通道Ct值≤30，且擴增曲線為典型的S型。以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。結果描述及判定8.3.1gD基因檢測結果Ct值≤36，且擴增曲線為典型的S型，報告為PRV核酸陽性，但需進一步經gE基因檢測來進行PRV野36＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開始進行一次重復檢測。如重復檢測結果仍為36＜Ct值≤38，且擴增曲線均呈典型的S型擴增曲線，報告為PRV核酸陽性，但需進一步經gE基因檢測來進行PRV野毒與疫苗毒的鑒別檢測。4DB21/T3273—20208.3.2.2陽性Ct值≤36，且擴增曲線為典型的S型，報告為PRV野毒核酸陽性。8.3.2.3可疑36＜Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開始進行一次重復檢測。如重復檢測結果仍為36＜Ct值≤38，且擴增曲線均呈典型的S型擴增曲線，報告為PRV野毒核酸陽性。8.3.3鑒別方法針對缺失包含gE基因在內的PRV活疫苗免疫豬只，如果gE基因檢測陽性，則判定為PRV野毒核酸陽性；如果gD基因檢測陽性而gE基因檢測陰性，則判定為PRV疫苗毒陽性；如果gD基因和gE基因檢測均為陰性，則判定為PRV核酸陰性，既無PRV野毒也無疫苗毒。針對未免疫缺失gE基因的PRV疫苗（△gE/PRV）的豬只，如果gD基因或gE基因檢測結果為陽性，則判定為PRV野毒核酸陽性；如果gD基因和gE基因檢測均為陰性，則判定為PRV核酸陰性。5DB21/T3273—2020AA附錄A（規范性附錄）溶液配制A.18mmol/LNaOH溶液的配制稱量0.32gNaOH，溶解到1000mL滅菌去離子水中，混勻，分裝，常溫保存。A.20.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制A.2.10.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.64g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）31.21g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.3量取0.2moL/L磷酸氫二鈉溶液360mL，0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液140mL，稱取氯化鈉38g，用無離子水溶解稀釋至5000mL，4℃保存。6DB21/T3273—2020BB附錄B（規范性附錄）引物和探針名稱序列（5’-3’）gD-qF（上游引物）gD-qR（下游引物）GTT