微生物學實驗室概述微生物學實驗室是研究微小生物的專業(yè)場所主要研究對象包括細菌、真菌、病毒和原生動物結(jié)合理論與實踐，培養(yǎng)專業(yè)技能實驗室安全規(guī)程個人防護穿實驗服，戴口罩、手套生物安全遵循生物安全分級管理制度緊急處理熟悉消防設(shè)備位置和逃生路線衛(wèi)生要求實驗后立即洗手，不在實驗室內(nèi)飲食微生物實驗室的基本設(shè)備基礎(chǔ)觀察設(shè)備顯微鏡是基礎(chǔ)工具包括普通光學顯微鏡和熒光顯微鏡培養(yǎng)設(shè)備培養(yǎng)箱維持恒溫環(huán)境超凈工作臺提供無菌操作區(qū)域滅菌設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋干熱滅菌箱處理耐熱物品顯微鏡的使用開啟電源調(diào)整光源強度適中從低倍物鏡開始先使用4×或10×物鏡定位粗調(diào)焦后精調(diào)焦小心轉(zhuǎn)動調(diào)焦旋鈕避免鏡頭觸碰標本調(diào)整目鏡間距適合操作者眼距以獲得清晰視野油鏡的正確操作方法準備工作標本染色并干燥，低倍鏡下先找到目標區(qū)域旋轉(zhuǎn)至油鏡位置將轉(zhuǎn)換器旋轉(zhuǎn)，使100×油鏡對準標本滴加浸油在玻片上滴一小滴浸油，避免氣泡精確對焦使用精調(diào)焦旋鈕，小心緩慢調(diào)整直至圖像清晰使用完畢清潔用鏡頭紙輕輕擦拭油鏡，不可用有機溶劑無菌操作技術(shù)洗手消毒實驗前徹底清潔雙手滅菌器材接種環(huán)火焰滅菌至紅熱開啟試管單手操作，試管口經(jīng)火焰消毒轉(zhuǎn)移微生物保持環(huán)境潔凈，快速完成操作超凈工作臺的使用使用前準備開啟紫外燈消毒20-30分鐘關(guān)閉紫外燈，開啟風機10分鐘用75%酒精擦拭工作臺面操作注意事項避免遮擋氣流路徑動作輕緩，避免產(chǎn)生氣流擾動器材放置有序，保持空間整潔使用后處理清理工作臺面所有物品用消毒液擦拭臺面關(guān)閉風機，開啟紫外燈消毒培養(yǎng)基的種類基礎(chǔ)培養(yǎng)基適合大多數(shù)非苛養(yǎng)菌生長選擇性培養(yǎng)基含特定抑制成分，抑制某些菌生長鑒別培養(yǎng)基含指示劑，可區(qū)分不同代謝產(chǎn)物富集培養(yǎng)基含特殊營養(yǎng)，促進特定微生物生長運輸培養(yǎng)基維持微生物活力但限制增殖培養(yǎng)基的配制原則提供平衡營養(yǎng)碳源、氮源、無機鹽和生長因子均衡適宜的水分活度保證微生物代謝所需水分合適的pH值大多數(shù)培養(yǎng)基pH6.8-7.2氧化還原電位滿足不同微生物的氧需求固體培養(yǎng)基的制備1.5-2%瓊脂濃度提供適當硬度支持微生物生長121°C滅菌溫度高壓蒸汽滅菌15-20分鐘45-50°C傾注溫度避免瓊脂凝固又不損傷熱敏成分4°C保存溫度防止水分蒸發(fā)和污染液體培養(yǎng)基的制備準確稱量按照配方精確稱量各組分溶解混合在蒸餾水中充分溶解調(diào)整pH值使用pH計測量并調(diào)整至目標值分裝均勻分裝入試管或燒瓶滅菌高壓蒸汽滅菌確保無菌高壓蒸汽滅菌鍋的使用使用前檢查檢查水位、壓力表和密封圈裝載物品合理擺放，確保蒸汽可充分接觸設(shè)置參數(shù)通常121°C，15-20分鐘等待完成壓力自然降至零后方可開蓋取出物品使用隔熱手套避免燙傷干熱滅菌法適用物品玻璃器皿、金屬器械、耐熱粉末不適用物品液體、含水物質(zhì)、熱敏物品溫度時間160°C×2小時或180°C×30分鐘優(yōu)點徹底滅菌，無殘留，無腐蝕缺點時間長，能耗高，應(yīng)用范圍有限過濾滅菌法原理利用微孔濾膜物理截留微生物適用范圍熱敏性液體、氣體、血清和抗生素溶液常用濾膜聚乙烯膜、醋酸纖維膜，孔徑0.22μm操作方式正壓或負壓過濾系統(tǒng)接種技術(shù)：劃線法滅菌接種環(huán)火焰滅菌至紅熱并冷卻取樣挑取少量菌懸液或單個菌落劃線一三象限密集劃線，二四象限逐漸稀釋培養(yǎng)倒置放入培養(yǎng)箱適溫培養(yǎng)接種技術(shù)：涂布法涂布法適用于定量分析，需準確移取0.1-0.2mL菌液均勻涂布于瓊脂表面玻璃涂布棒需火焰滅菌并冷卻后使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿確保均勻分布接種技術(shù)：傾注法加入菌液將1mL稀釋好的菌液加入空培養(yǎng)皿傾注培養(yǎng)基加入45-50℃融化的瓊脂培養(yǎng)基混勻轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使菌液與培養(yǎng)基充分混合凝固培養(yǎng)待凝固后倒置培養(yǎng)細菌的單染色法常用染料：亞甲藍、龍膽紫、復紅、堿性品紅等優(yōu)點：操作簡單快速，能清晰觀察細菌形態(tài)和排列方式革蘭氏染色法原理革蘭氏陽性菌細胞壁肽聚糖層厚結(jié)晶紫-碘復合物不易被脫色劑洗脫顯紫色革蘭氏陰性菌細胞壁肽聚糖層薄外膜含脂質(zhì)，易被酒精脫色復染后顯紅色是細菌分類和鑒定的重要依據(jù)，也是選擇抗生素的參考革蘭氏染色法操作步驟涂片固定制備細菌涂片，空氣干燥，火焰固定結(jié)晶紫染色加結(jié)晶紫染液1分鐘，水洗碘液處理加碘液1分鐘，形成結(jié)晶紫-碘復合物脫色95%酒精脫色10-20秒，立即水洗復染加沙黃或復紅復染30秒，水洗芽胞染色法制備涂片選取含芽胞菌種制備涂片并固定初染覆蓋孟加拉紅或堿性品紅，加熱至冒蒸汽5分鐘脫色水洗用水沖洗染液，再用0.5%鹽酸酒精脫色10秒4復染亞甲藍復染30秒，水洗，晾干莢膜染色法莢膜的意義保護細菌免受環(huán)境危害增強細菌毒力，抵抗吞噬幫助菌體附著于宿主表面染色原理負染法：背景著色而莢膜無色創(chuàng)造對比顯示莢膜輪廓常用墨汁或黑藍墨水作背景操作要點使用新鮮培養(yǎng)物避免加熱固定使用稀釋染料染菌體觀察時調(diào)節(jié)光圈獲得最佳對比細菌形態(tài)觀察球菌球形，直徑0.5-1.0μm可呈單個、成對或鏈狀排列桿菌桿狀，1-10μm長兩端圓形或方形螺旋菌螺旋形或彎曲長度和彎曲度各異真菌形態(tài)觀察4酵母菌單細胞卵圓形或橢圓形霉菌多細胞絲狀體，形成菌絲網(wǎng)絡(luò)孢子不同真菌產(chǎn)生特征性孢子二相性真菌在不同條件下可表現(xiàn)為酵母或霉菌形態(tài)原生動物形態(tài)觀察制備濕片觀察活體運動特征注意調(diào)節(jié)光圈獲得最佳對比度觀察細胞結(jié)構(gòu)：核、偽足、纖毛、鞭毛等細菌生長曲線測定時間(小時)菌數(shù)(logCFU/mL)生長曲線分為滯后期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和死亡期分光光度計的使用預熱儀器開機預熱15-30分鐘2選擇波長細菌通常選擇600nm波長空白校正使用無菌培養(yǎng)基調(diào)零測量樣品記錄吸光度值(OD值)平板計數(shù)法梯度稀釋制備10^-1至10^-8系列稀釋液平板接種每個稀釋度接種2-3個平行平板培養(yǎng)適溫培養(yǎng)至菌落可數(shù)計數(shù)選取30-300個菌落的平板計數(shù)計算CFU/mL=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)最近似數(shù)法（MPN法）適用范圍水樣和食品中低濃度微生物計數(shù)原理統(tǒng)計學原理估計活菌數(shù)量操作步驟梯度稀釋，多管發(fā)酵，記錄陽性管數(shù)判讀方法參照MPN表，根據(jù)各組陽性管數(shù)確定MPN值優(yōu)點可檢測低濃度微生物，適用不能形成菌落的微生物缺點精確度低，操作繁瑣，耗時長細菌菌落形態(tài)觀察大小微小型、小型、中等、大型形狀圓形、不規(guī)則、絲狀、根狀邊緣整齊、波浪狀、齒狀、絲狀表面光滑、粗糙、顆粒狀、皺褶真菌菌落形態(tài)觀察生長速度緩慢、中等或快速生長質(zhì)地絨毛狀、粉末狀、棉絮狀、蠟質(zhì)顏色變化觀察正反面顏色，隨生長階段變化表面特征放射狀褶皺、同心環(huán)、區(qū)域分化微生物的分離與純化獲得純培養(yǎng)物單一菌種的純培養(yǎng)分離培養(yǎng)將混合菌群分離為單個菌落3富集培養(yǎng)創(chuàng)造有利條件促進目標微生物生長樣品采集正確采集并保存微生物樣品稀釋平板法10?1初始稀釋樣品與稀釋液1:9混合10??最終稀釋度連續(xù)稀釋至適宜濃度0.1mL接種量取適量稀釋液接種平板30-300理想菌落數(shù)易于計數(shù)且有統(tǒng)計學意義劃線分離法第一象限接種環(huán)蘸取菌液密集劃線第二象限從第一象限邊緣少量菌液劃入第三象限同理從第二象限邊緣劃入第四象限最終獲得分散單菌落單菌落分離法初次分離混合培養(yǎng)物劃線或稀釋平板挑取單菌落選擇典型、分離良好的單個菌落二次劃線純化將單菌落再次劃線培養(yǎng)純度檢驗顯微鏡觀察和培養(yǎng)特性驗證菌種保藏確認純度后進行保存菌種保藏方法短期保藏斜面保藏：4℃冰箱，1-3個月礦物油覆蓋：防止水分蒸發(fā)水中保存：無菌蒸餾水中懸浮中期保藏凍干保存：-20℃，1-3年瓊脂塊保存：培養(yǎng)基塊浸入甘油硅膠干燥保存：孢子在硅膠中長期保藏超低溫凍存：-80℃，5-10年液氮保存：-196℃，10年以上冷凍干燥：真空條件下，10年以上細菌生理生化實驗：糖發(fā)酵試驗原理檢測微生物分解糖產(chǎn)酸或產(chǎn)氣能力培養(yǎng)基含特定糖和pH指示劑操作方法接種待測菌于含糖發(fā)酵管適溫培養(yǎng)24-48小時結(jié)果判讀產(chǎn)酸：指示劑變色產(chǎn)氣：倒管中出現(xiàn)氣泡細菌生理生化實驗：硫化氫產(chǎn)生試驗培養(yǎng)基TSI培養(yǎng)基或SIM培養(yǎng)基接種方法直刺和劃線接種于斜面培養(yǎng)條件37℃培養(yǎng)18-24小時結(jié)果判定黑色沉淀為H?S陽性細菌生理生化實驗：吲哚試驗1原理檢測色氨酸分解為吲哚的能力2培養(yǎng)接種于含色氨酸的肽水中3加試劑培養(yǎng)后添加柯瓦奇試劑結(jié)果判讀表層形成紅色環(huán)為陽性細菌生理生化實驗：甲基紅試驗原理檢測混合酸發(fā)酵產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)的能力培養(yǎng)MR-VP培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48小時加指示劑加入5滴甲基紅試劑結(jié)果判讀紅色為陽性，黃色為陰性細菌生理生化實驗：VP試驗原理檢測丁二醇發(fā)酵產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的能力1培養(yǎng)基MR-VP培養(yǎng)基，與甲基紅試驗共用試劑α-萘酚和40%KOH溶液3判讀15分鐘內(nèi)出現(xiàn)玫瑰紅色為陽性細菌生理生化實驗：檸檬酸鹽利用試驗原理檢測微生物以檸檬酸鹽為唯一碳源的能力培養(yǎng)基西蒙檸檬酸鹽瓊脂(Simmonscitrateagar)指示劑溴麝香草酚藍，pH上升變藍色接種方法在斜面表面劃線接種培養(yǎng)條件35-37℃培養(yǎng)24-48小時陽性結(jié)果培養(yǎng)基從綠色變?yōu)樗{色陰性結(jié)果培養(yǎng)基保持原綠色細菌生理生化實驗：尿素酶試驗原理：檢測微生物分解尿素產(chǎn)生氨的能力判讀：pH升高導致指示劑從黃色變?yōu)榉奂t色為陽性細菌生理生化實驗：過氧化氫酶試驗原理：檢測微生物分解H?O?產(chǎn)生水和氧氣的能力方法：滴加3%H?O?于菌落上觀察氣泡產(chǎn)生結(jié)果：產(chǎn)生氣泡為陽性，無氣泡為陰性細菌生理生化實驗：氧化酶試驗原理檢測細胞色素氧化酶存在與否傳遞電子給氧的末端氧化酶試劑1%對-氨基-N,N-二甲基苯胺或氧化酶試紙操作方法滴加試劑于新鮮菌落或?qū)⒕渫磕ㄓ谠嚰埳辖Y(jié)果判讀10-30秒內(nèi)變紫色為陽性不變色為陰性細菌的鑒定方法分子生物學鑒定PCR、16SrRNA測序、基因芯片2蛋白質(zhì)分析鑒定質(zhì)譜分析、血清學方法3生化特性鑒定API系統(tǒng)、自動化生化分析儀形態(tài)學鑒定顯微形態(tài)、染色特性、菌落特征抗生素敏感性試驗：紙片擴散法準備培養(yǎng)基Mueller-Hinton瓊脂平板接種細菌標準濃度菌懸液均勻涂布放置抗生素紙片等距離放置含抗生素的紙片測量抑菌環(huán)培養(yǎng)后測量透明抑制圈直徑抗生素敏感性試驗：最小抑菌濃度（MIC）測定肉湯稀釋法系列稀釋抗生素于肉湯中瓊脂稀釋法抗生素與瓊脂混合制備梯度平板E-test法梯度濃度抗生素條帶直接讀取MIC值水質(zhì)微生物檢測樣品采集無菌容器，規(guī)范采樣膜過濾0.45μm濾膜過濾水樣培養(yǎng)檢測選擇性培養(yǎng)基檢測指示菌3計數(shù)分析菌落計數(shù)或MPN法定量空氣微生物檢測沉降平板法打開培養(yǎng)皿暴露特定時間撞擊式采樣使用空氣采樣器收集微生物過濾采樣法抽濾空氣通過濾膜捕獲微生物培養(yǎng)計數(shù)適溫培養(yǎng)后計數(shù)分析土壤微生物檢測采樣無菌工具采集不同深度土樣處理土樣混勻，去除雜質(zhì)3懸浮稀釋土壤懸浮液系列稀釋分離培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)不同類群鑒定分析形態(tài)學和分子生物學方法鑒定食品微生物檢測檢測對象病原菌：沙門氏菌、金黃色葡萄球菌指示菌：大腸菌群、菌落總數(shù)腐敗菌：假單胞菌、乳酸菌檢測方法傳統(tǒng)培養(yǎng)法：選擇性培養(yǎng)基分離快速檢測法：ATP生物發(fā)光法分子生物學方法：PCR、DNA雜交質(zhì)量控制標準操作程序(SOP)規(guī)范操作陽性和陰性對照確保結(jié)果準確實驗室間比對驗證檢測能力PCR技術(shù)在微生物檢測中的應(yīng)用DNA提取從樣品中提取微生物DNA引物設(shè)計設(shè)計特異性引物靶向目標區(qū)域PCR擴增變性、退火、延伸30-40個循環(huán)電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物結(jié)果分析根據(jù)特異性條帶判斷檢測結(jié)果酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）直接法間接法夾心法競爭法原理：抗原抗體特異性反應(yīng)，酶標記檢測應(yīng)用：病原微生物、毒素和抗體的檢測優(yōu)點：高靈敏度、高特異性、操作簡便微生物發(fā)酵實驗：乳酸菌發(fā)酵菌種活化活化乳酸菌種子培養(yǎng)基制備含乳糖或葡萄糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基接種培養(yǎng)適宜接種量,37℃恒溫酸度監(jiān)測定期測量pH值變化產(chǎn)物分析檢測乳酸含量和活菌數(shù)微生物發(fā)酵實驗：酵母發(fā)酵30°C最適溫度酵母發(fā)酵最佳溫度5.0最適pH略酸性環(huán)境有利發(fā)酵10%糖濃度初始糖濃度通常為8-12%48h發(fā)酵時間完全發(fā)酵所需時間生物反應(yīng)器的使用反應(yīng)器結(jié)構(gòu)發(fā)酵罐、攪拌裝置、控制系統(tǒng)參數(shù)監(jiān)控溫度、pH、溶氧、攪拌速度無菌操作嚴格滅菌和無菌接種采樣分析定期