本文件規(guī)定了小鼠肺炎病毒（PVM）的檢測方法。下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。根據免疫學原理，采用PVM抗原檢測小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠血清中PVM抗體。4.1試劑:PVM感染小鼠待發(fā)病后取肺臟，研磨，制成10%懸液，3000r/min離心10min后取上清液感染處理后，低速離心去除細胞碎片，上清液再經超速離心濃縮后制成ELISA抗原。BHK21細胞凍融破碎后，經低速離心去除細胞碎片而獲得的上清液。4.1.2抗原片涂片。室溫干燥后，冷丙酮固定10min，-20℃保存。PVM免疫清潔或SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠所獲得的抗血清。辣根過氧化物酶標記葡萄球菌蛋白A(SPA)可用于小鼠、豚鼠、地鼠血清抗體的檢查。表1實時熒光RT-PCR擴增引物和探針GCAAGGACACTCGGCATGTTGGAGCCCTATTTCTGCCACFAM-CTTACTTACTGCCTTCAACCGTTGCGAAGA-BHQ-1714.2器材5.4采用熒光定量PCR方法（見附錄A）進行核酸檢測。則判為PVM抗體陽性。典型擴增曲線，判為可疑，需復檢，復檢仍出現35＜Ct值≤40，并且曲線有明顯的對數為陽性；否則判為陰性。無Ct值或Ct值＞40且無特征性擴增曲實驗動物小鼠肺炎病毒核酸檢測方法A.1主要設備和材料A.1.1實時熒光PCR儀A.1.2Nanodrop紫外分光光度計。A.1.3高速冷凍離心機A.1.4臺式離心機。A.1.5恒溫孵育器。A.1.6漩渦振蕩器。A.1.7組織勻漿器或手持式均質器。A.1.8生物安全柜。A.1.9PCR工作臺。A.1.10-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。A.1.11微量移液器（10μL，100μL，100A.1.12無RNase和DNase的離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），無RNase和DNase的吸頭（10μL，200μL，1mL），無RNase和DNase的PCR擴增反應管。A.2試劑A.2.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.2B液0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。A.2.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL去離子水溶解稀釋，用HCl調pH至7.2，最后定容至1000mL，經121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.2無DNase/RNase去離子水實驗用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。A.2.3RNA抽提試劑TRIzol或其他等效產品。A.2.4無水乙醇。A.2.575%乙醇（無DNase/RNase去離子水配制）。A.2.6三氯甲烷（氯仿）。A.2.7異丙醇。A.2.8引物和探針：根據表1的序列合成引物和探針，引物和探針加無RNase去離子水分別配制成10μmol/L儲備液，-20℃保存。A.3樣本的采集A.3.1臟器組織將活體動物安樂死后剖檢，無菌采集動物的肺、腸系膜淋巴結、肝臟、或脾臟，剪取待檢樣品2.0g于無菌離心管。A.3.2盲腸內容物或糞便無菌采集動物盲腸內容物或糞便，取待檢樣品2.0g于無菌離心管中。A.3.3實驗接種物直接取待測細胞培養(yǎng)物、腫瘤組織等待測實驗接種物于無菌離心管中。A.3.4實驗動物環(huán)境樣本取適量實驗動物飼料和墊料置于無菌樣品袋中；取適量實驗動物飲水直接轉移到無菌離心管中；用無菌拭子拭取實驗動物籠具出風口初效濾膜表面粉塵裝入無菌離心管中；取籠具系統(tǒng)內置的出風口粉塵吸附介質裝入無菌離心管中；用無菌拭子拭取實驗動物環(huán)境中的待測位置后裝入無菌離心管中。A3.5樣本的運輸和存放樣本采集后應密封、加冰并盡快運送到檢測實驗室。在2~8℃條件下暫存應不超過24h，若不能立即檢測應-20℃保存，若需長期保存，須置于-80℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。A.4樣本RNA提取使用TRIzol或其他等效產品提取RNA，TRIzol對人體有害，使用時應戴一次性手套，注意防止濺出。A.4.1取200μL處理后的樣本加1mLTRIzol后，充分混勻，室溫靜置10min使其充分裂解。A.4.2按每毫升TRIzol加入200μL氯仿，蓋緊樣本管蓋，用手用力振蕩搖晃離心管15s；不應用漩渦振蕩器，以免基因組RNA斷裂。室溫靜置5min。4℃、12A.4.3離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA存在于水樣層當中，水樣層的容量大約為所加TRIzol容量的60%。吸取上層水相至另一離心管中，注意不要吸取中間界面。A.4.4按每毫升TRIzol加入0.5mL異丙醇異丙醇混勻，室溫放置10min。4℃12000r/min離心10min，棄上清，RNA沉淀一般形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。A.4.5按每毫升TRIzol加入1mL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃7500r/min離心5min，棄上清，將離心管倒立吸水紙上，盡量使液體流干。A.4.6室溫自然風干干燥5~10min，RNA樣本不要過于干燥。A.4.7用50~100μL無RNase去離子水溶解RNA樣品，制備好的RNA應盡快進行下一步PCR反應；若暫時不能進行PCR反應，應于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩.5實時熒光RT-PCR實時熒光RT-PCR反應體系見表6。反應液的配制在冰上操作，每次反應同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照。1)反應體系見表2。總體系50μL。表2：熒光RT-PCR反應體系配制表反應組份用量/μL終濃度2×OneStepRT-PCRBufferⅢ25ExTagHS(5U/μL)1/PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ1/ForwardPrimer(10μM)2.5500nMReversePrimer(10μM)2.5500nMProbe(5μM)2250nMRox1/TotalRNA/無RNase去離子水5/實時熒光RT-PCR反應參數見表3。表3：熒光RT-PCR反應參數表步驟溫度采集熒光信號循環(huán)數逆轉錄42℃5min否1預變性95℃30sec否1變性95℃5sec否退火，延伸60℃34sec是40相應調整。試驗結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值判定結果。A.5.3實時熒光RT-PCR結果判定直接讀取檢測結果，基線和閾值設定原則根據儀器的噪聲情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。質控標準：空白對照無Ct值，且無熒光擴增曲線，一直為水平線；陰性對照無Ct值，且無熒光擴增曲線，一直為水平線；陽性對照Ct值≤35，且有明顯的熒光擴增曲線，則滿足質控要求；否則此次試驗無效，需重測。A.5.3.1質控成立條件下，若待檢測樣本無熒光擴增曲線，則判定為陰性。A.5.3.2質控成立條件下，若待檢測樣本有熒光擴增曲線，且Ct值≤35