第1章

發酵工程第2節

微生物的培養技術及應用第2課時

微生物的選擇培養和計數高二下學期生物人教版選擇性必修3一、選擇培養基1.概念：在微生物學中，將允許__________________生長，同時____________其他種類微生物生長的培養基，稱為選擇培養基。特定種類的微生物抑制或阻止2.菌株的篩選

水生棲熱菌

目的菌抑制或阻止二、微生物的選擇培養思路：對土樣進行充分______，再將菌液涂布到制備好的____________上，待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板______。在涂布有合適濃度菌液的平板上就可以觀察到分離的________。稀釋

選擇培養基倒置單菌落三、微生物的數量測定1.稀釋涂布平板法當樣品的________足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個______。通過統計平板上的______數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。稀釋度活菌菌落2.顯微鏡直接計數法用特定的____________或______________，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量。細菌計數板血細胞計數板任務一

選擇培養基【情境】

現有一種培養基，成分和含量如下表。瓊脂蒸餾水(1)從功能角度分析，該培養基均屬于______培養基。選擇

(2)該培養基中作為碳源的物質是________，利用該培養基能分離出______微生物，原因是_____________________________________________________________________________________________。甘露醇

該培養基中無氮源，固氮菌能利用空氣中的氮氣來生長繁殖，沒有固氮能力的微生物的生長會受到抑制固氮

2.幾種常用的選擇培養基選擇培養基培養基中加入青霉素——分離得到酵母菌和霉菌培養基中加入高濃度的食鹽——分離得到金黃色葡萄球菌以尿素作為唯一氮源的培養基——分離得到尿素分解菌不添加氮源的培養基——分離得到固氮微生物石油是唯一碳源時——分離得到能消除石油污染的微生物培養基放在高溫環境中培養——得到耐高溫的微生物不加含碳有機物的培養基——分離得到自養型微生物例1

[2024·湖北襄陽期中]在微生物學中,我們通常根據不同微生物各自的特性，采取不同的培養條件，下列有關細菌培養的敘述，正確的是(

)

A.不同細菌的菌落特征一般相同B.在培養基中加入青霉素可促進細菌生長C.用液體培養基培養破傷風桿菌的過程中通入氧氣能促進破傷風桿菌的生長D.培養醋酸菌時，往培養液中通入氧氣可以促進菌體快速增殖√[解析]

不同細菌的菌落特征一般不同,A錯誤;在培養基中加入青霉素會殺滅細菌,B錯誤;破傷風桿菌是厭氧細菌，因此用液體培養基培養破傷風桿菌的過程中通氧氣會抑制其生長,C錯誤;醋酸菌是好氧細菌，因此培養醋酸菌時，往培養液中通入氧氣可以促進菌體快速繁殖,D正確。例2

[2023·廣東卷]研究者擬從堆肥中取樣并篩選能高效降解羽毛、蹄角等廢棄物中角蛋白的嗜熱菌。根據堆肥溫度變化曲線(如圖)和選擇培養基篩選原理來判斷，下列最可能篩選到目標菌的條件組合是(

)

√

任務二

微生物的選擇培養與數量測定【資料一】

閱讀教材第17頁“稀釋涂布平板法操作示意圖”。

紙袋909等比稀釋↓

①將涂布器浸在盛有______的燒杯中②將涂布器放在火焰上灼燒,待酒精燃盡、涂布器______后,再進行涂布

酒精冷卻涂布器培養皿涂布器滅菌(2)要想得到某種特定細菌的純培養物，上述過程使用的培養基，從功能角度看，為____________。(3)鏟取土樣過程所用的鏟子和紙袋要進行______處理。(4)樣品的等比稀釋過程中，______(填“需要”或“不需要”)更換移液管。要等涂布器冷卻后才能進行涂布操作，原因是____________________。選擇培養基滅菌需要避免高溫殺死微生物(5)本實驗需要設置對照嗎？如果需要，應如何設置？[答案]

需要，將接種的平板與未接種的平板同時培養，以檢驗培養基是否受到污染【資料二】

閱讀教材第18頁“微生物的數量測定”內容。(1)請分析用稀釋涂布平板法進行微生物數量測定的問題：①稀釋涂布平板法除可以用于____________外，也常用來統計樣品中____________。②通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養，其目的是獲得菌落數為_________、適于計數的平板。③為減少實驗誤差，在同一稀釋度下，應至少對___個平板進行重復計數，然后求出平均值。分離微生物活菌的數目

3④統計結果一般用______數而不是用活菌數表示。當________________________時，平板上觀察到的只是一個菌落，因此統計的菌落數往往比活菌的實際數目____。菌落

兩個或多個細胞連在一起少(2)請分析用顯微鏡直接計數法進行微生物數量測定的問題：①對相對較大的酵母菌細胞、霉菌孢子等的計數常用________計數板；對細菌等較小的細胞計數常用______計數板。②統計的結果一般是________和________的總和。血細胞細菌活菌數死菌數1.平板劃線法與稀釋涂布平板法的比較比較項目平板劃線法稀釋涂布平板法圖示____________________________________________________________接種工具接種環涂布器關鍵操作接種環在固體平板培養基表面連續劃線①一系列的梯度稀釋②涂布平板法操作比較項目平板劃線法稀釋涂布平板法注意事項每次劃線前后均需灼燒接種環稀釋度要足夠高，為確保實驗成功可以增加稀釋度的范圍菌體獲取在具有顯著的菌落特征的區域中挑取菌體從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體優點可以根據菌落的特點獲得某種微生物的單菌落既可以獲得單菌落，又能對微生物計數續表比較項目平板劃線法稀釋涂布平板法缺點不能對微生物計數操作復雜，需要涂布多個平板共同點都能將微生物分散到固體培養基表面，以獲得單菌落，達到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征續表比較項目稀釋涂布平板法顯微鏡直接計數法原理當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數，然后再計算一定體積的樣品中微生物的數量2.兩種計數方法的比較比較項目稀釋涂布平板法顯微鏡直接計數法公式計數依據培養基上的菌落菌體本身續表比較項目稀釋涂布平板法顯微鏡直接計數法缺點當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落不能區分活菌與死菌結果比實際值偏小比實際值偏大續表例3

高溫淀粉酶在大規模工業生產中有很強的實用性。研究者從熱泉中篩選高效產生高溫淀粉酶的嗜熱菌，其篩選過程如圖a所示。將得到的菌懸液轉接于同時含有葡萄糖和淀粉作碳源的固體培養基上培養，得到若干菌落后用碘液作顯色處理，看到如圖b所示情況。下列選項錯誤的是(

)

A.過程①②合稱為稀釋涂布平板法B.甲、乙試管中的液體均為選擇培養基C.Ⅱ號培養基上的接種方法為平板劃線法D.圖b中周圍不顯藍色的菌落含有所需菌種√[解析]

根據Ⅰ號培養基上菌落分布均勻，可知過程①②為稀釋涂布平板法，A正確；甲、乙試管中的液體是用于樣品稀釋，應為無菌水，B錯誤；由圖可知從Ⅰ號培養基上挑出菌落進行接種的方法是平板劃線法，C正確；淀粉與碘液反應呈藍色，但如果淀粉分解菌中的淀粉酶將淀粉水解就不能呈藍色，因此周圍不顯藍色的菌落含有所需菌種，D正確。

√

任務三

探究·實踐——土壤中分解尿素的細菌的分離與計數1.原理：絕大多數微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成______的微生物才能分解尿素。利用以______作為唯一氮源的選擇培養基，可以從土壤中分離出分解尿素的細菌。脲酶尿素

［分析］

①實驗中所用接種方法是________________。②實驗中能以菌落數表示活菌數的原因是__________________________________________________________________________________。稀釋涂布平板法

當樣品稀釋倍數足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌

④如何檢驗實驗中所配制的選擇培養基能否發揮選擇作用？_____________________________________________________________________________________________________。

將接種了菌液的普通培養基與接種了同種菌液的選擇培養基一起培養，一段時間后，觀察記錄培養基上菌落數目

(1)實驗中在以尿素為唯一氮源的選擇培養基上生長的菌落___________(填“是”“不是”或“不一定是”)分解尿素的細菌，原因是_______________________________________________________________。

不一定是

固氮細菌利用氮氣為氮源，也能在以尿素為唯一氮源的培養基上生長(2)結合所給資料，說出如何對分離的菌種進行鑒定。[答案]

在以尿素為唯一氮源的選擇培養基中加入酚紅指示劑(3)選擇培養基與鑒別培養基的比較鑒別培養基是根據微生物的代謝特點,在培養基中加入特定的作用底物和指示劑,通過指示劑在培養前后的變化將該種微生物與其他微生物區分開來。與選擇培養基比較如下:類別作用舉例選擇培養基培養、分離出特定微生物培養酵母菌和霉菌,可在培養基中加入青霉素,培養金黃色葡萄球菌,可在培養基中加入高濃度食鹽等鑒別培養基鑒別不同種類的微生物用伊紅—亞甲藍瓊脂培養基鑒別飲用水或乳制品中是否有大腸桿菌(若有,菌落呈深紫色,并帶有金屬光澤)(1)將涂布器從酒精中取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒。不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。(2)要按照無菌操作的方法，進行規范操作。取土樣時用的鐵鏟和取樣紙袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。4.注意事項

過程如圖，并成功篩選到能高效降解尿素的細菌(目的菌)，培養基成分如下表所示。下列敘述錯誤的是(

)

葡萄糖尿素瓊脂

√

菌落，可采用稀釋涂布平板法將錐形瓶中的細菌接種到固體培養基上，C正確；分解尿素的細菌是需氧型微生物，因此在培養時應充分振蕩或攪拌，使目的菌與氧氣充分接觸，D正確。1.正誤辨析(1)稀釋涂布平板法可用于分離微生物和統計樣品中活菌數目。(

)

√(2)將土壤稀釋液徹底滅菌后再接種到培養基上，可以有效防止雜菌的污染。

(

)

×[解析]

將土壤稀釋液徹底滅菌，會殺死目的菌株。(3)稀釋涂布平板法的操作中，不同濃度的菌液均可在培養基表面形成單個的菌落。(

)

×[解析]

只有當菌液的稀釋倍數達到一定程度時，才能通過稀釋涂布平板法在培養基表面形成單個的菌落。(4)“土壤中分解尿素的細菌的分離與計數”實驗過程中應使用涂布器、移液管等操作工具，使用前進行滅菌處理。(

)

√

×[解析]

用平板劃線法不能對微生物進行計數，應用稀釋涂布平板法對纖維素分解菌進行計數。(6)利用血細胞計數板可以直接統計待測菌液中的活菌數目。

(

)

×[解析]

利用血細胞計數板計數，不能區分死菌與活菌。

壤中分離目標菌的過程中,發現培養基上甲、乙兩種細菌都能生長并形成菌落(如圖所示)。下列分析錯誤的是(

)

√

3.[2024·河北保定期末]在鑒別培養基中添加適量的溴甲酚紫可用于分離和篩選產生代謝酸(有機酸)的微生物。如果培養基的顏色由紫色變成了黃色則說明其中的微生物能產生代謝酸。下列相關分析與實際相符的是(

)

√

√

乙、丙、丁挑取不同的菌落培養，丙瓶與乙、丁瓶相同條件培養，但培養液中沒有酒精產生，且瓶內活菌數量不低，丙瓶出現的原因可能是培養瓶密封不嚴，酵母菌進行有氧呼吸；丁瓶的活菌數比乙瓶少，但是產生的酒精和乙瓶幾乎一樣多，所以丁瓶酵母菌產酒精能力比乙瓶強，D正確。1.如圖表示采用富集方法從土壤中分離能降解對羥基苯甲酸的微生物的實驗過程。下列有關敘述不正確的是(

)

A.該實驗所用的器具、培養基均需滅菌處理B.①→②→③重復培養能提高目的菌的比例C.④→⑤的培養過程可以純化目的菌D.⑥⑦的培養基中都應含有對羥基苯甲酸√[解析]

圖示為微生物的分離和培養實驗，需要進行無菌操作，所以該實驗所用的器具、培養基均需滅菌處理，A正確；①→②→③是將土壤樣品置于含對羥基苯甲酸的培養液中培養，重復多次可以提高目的菌的比例，B正確；④→⑤的培養過程采用稀釋涂布平板法，所以可以純化目的菌，C正確；⑥⑦的實驗目的是說明通過選擇培養的確得到了欲分離的目標微生物，有一組作為對照，不含有對羥基苯甲酸，D錯誤。2.木質纖維素可被酶水解為葡萄糖和木糖。漢遜酵母是一種耐高溫的微生物，可利用木糖合成乙醇等物質，但葡萄糖會抑制野生型漢遜酵母利用木糖，進而限制了該酵母利用木質纖維素水解液的能力。下列說法正確的是(

)

A．纖維素水解液可作為漢遜酵母培養基中的碳源和氮源B．漢遜酵母耐高溫的特性使其發酵過程的溫控成本增加C．由于乙醇可殺菌，故利用漢遜酵母生產乙醇時無需嚴格滅菌D．改造漢遜酵母使之能利用葡萄糖，可提高纖維素水解液的利用率√[解析]

纖維素水解液中含有葡萄糖和木糖，可作為漢遜酵母培養基中的碳源，但不能作為氮源，A錯誤；漢遜酵母耐高溫的特性使其發酵過程的溫控成本降低，B錯誤；利用漢遜酵母生產乙醇時需嚴格滅菌，C錯誤；改造漢遜酵母使之能利用葡萄糖，可提高纖維素水解液的利用，D正確。3.大腸桿菌是一種條件致病菌，一定數量的大腸桿菌有利于胃腸蠕動，過量的大腸桿菌則容易引發腹痛、腹瀉等癥狀。某校高中生對某品牌的雪糕進行了檢驗，并使用細菌計數板對其中大腸桿菌的數目進行了估計。下列說法錯誤的是(

)

A．如果直接從靜置的試管底部吸出培養液進行計數，結果可能偏大B．使用細菌計數板并用臺盼藍染色后計數，可估算大腸桿菌活菌數C．平板劃線法可用于分離大腸桿菌，也常用來統計大腸桿菌的數目D．大腸桿菌也能作為益生菌，與胃腸中其他細菌的關系可能為種間競爭√[解析]

如果直接從靜置的試管底部吸出培養液進行計數，結果可能偏大，需振蕩搖勻后取樣，A正確；使用細菌計數板并用臺盼藍染色后計數，可估算大腸桿菌活菌數，因為被臺盼藍染色的為死亡的大腸桿菌，B正確；平板劃線法可用于分離大腸桿菌，但不能用于統計大腸桿菌的數目，C錯誤；一定數量的大腸桿菌有利于胃腸蠕動，能作為益生菌，與胃腸中其他細菌有共同的空間、資源，因而它們之間的關系可能為種間競爭，D正確。4.急性腸胃炎是由細菌通過消化道進入人體導致的，因此檢驗飲用水的細菌含量是有效監控疾病發生的必要措施，如圖表示檢驗微生物的簡要步驟，以下敘述正確的是(

)

A.根據圖甲的微生物接種方法，可得到圖乙所示的四種菌落分布圖B.為保證統計的菌落更加準確，同稀釋度下需要培養三個培養皿C.培養基的配制需考慮微生物的適宜pH，應在滅菌后進行pH調整D.用如圖所示的方法進行計數，結果往往比實際值高√[解析]

圖甲所用的接種方法為稀釋涂布平板法，而圖乙所示的四種菌落分布圖中，a、b、c三個培養皿屬于稀釋涂布平板法接種，d培養皿屬于平板劃線法接種，A錯誤；同一稀釋度下需要培養三個培養皿，分別計數3次，取平均值，以保證統計的菌落更加準確，B正確；培養基的配制需考慮微生物的適宜pH，有利于微生物的生長，但是應在滅菌前進行pH調整，以防止雜菌污染，C錯誤；用稀釋涂布平板法進行微生物計數時，統計的菌落數往往比活菌的實際數目少，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，D錯誤。5.酵母菌在工業生產中具有重要的用途，常用YPD進行培養。YPD又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培養基，其主要配方為1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。酵母膏是指采用新鮮酵母為原料，經酶解自溶、分離過濾、濃縮而得到的一種棕黃色至棕褐色的膏狀物。請回答:YPD中為酵母菌提供氮源的是

。一位同學在用稀釋涂布平板法純化土壤中的酵母菌時，發現培養基上的菌落連成一片，最可能的原因是

。

菌液濃度過高(或稀釋度不夠)

[解析]

YPD的主要配方為1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖，其中為酵母菌提供氮源的是酵