ICS65.020.20DB12B04天津市地方標(biāo)準(zhǔn)DB12/T838—2018辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法MethodofidentifyingseedpurityofpepperbyusingSSR-basedmarker天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布DB12/T838—2018前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、呂敬剛、趙新、王成、蘭璞、焦荻、高素燕、陳銳、關(guān)海濤、張耀中、焦賀敏。IDB12/T838—2018辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法12范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了辣椒種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法的原理、儀器設(shè)備及試劑、方法步驟、純度計(jì)算。本標(biāo)準(zhǔn)適用于辣椒單交種的純度鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。種子純度seedpurity種子在SSR分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占鑒定樣品種子聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction(PCR)由幾個(gè)核苷酸（1～6個(gè)）為重復(fù)單位聚集而成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)至幾百個(gè)bp（一般為100～200）的串聯(lián)重復(fù)序列，又稱(chēng)微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來(lái)源于串聯(lián)數(shù)目的不同。3.44SSR分布于辣椒整個(gè)基因組，每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)單位的數(shù)目不同造成了品種間的多態(tài)性，利用PCR技術(shù)將多態(tài)的SSR擴(kuò)增出來(lái)，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，利用電泳圖譜進(jìn)行辣椒種子純度鑒定。51DB12/T838—20185.1儀器設(shè)備PCR儀；測(cè)序電泳槽；水平電泳槽；高壓電泳儀（3000V，400mA，400W）；萬(wàn)分之一電子天平；微量加樣器；磁力攪拌器；臺(tái)式離心機(jī)；紫外-可見(jiàn)成像系統(tǒng)；膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋；pH計(jì)等。5.2試劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；鹽酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸鈉（SDS）；氯化鈉（NaCl）；氫氧化鈉（NaOH）；硼酸；去離子甲酰胺；溴酚藍(lán)；二甲苯青FF；甲叉雙丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；親和硅烷；剝離硅烷；無(wú)水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；過(guò)硫酸銨；冰醋酸；硝酸銀；甲醛溶液（37%）；TaqDNA聚合酶（含Mg的10×PCR緩沖液）；四種脫氧核糖核苷酸2+（dNTPs）；SSR引物；瓊脂糖；GoldView染料；定性PCR試劑盒；DNA提取試劑盒；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水或符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水等。除特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純?cè)噭?.3溶液配制相關(guān)溶液配制方法見(jiàn)附錄A。6方法步驟6.1取樣檢測(cè)樣品的分樣和保存，應(yīng)符合GB/T3543.2的規(guī)定，從中隨機(jī)取100粒以上種子，取其父母本材料各10份。在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度約3mm的棉花或?yàn)V紙，用水浸濕后均勻地撒上檢測(cè)樣品，再于表面覆蓋一層紗布，置于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為16h35℃光照培養(yǎng)，8h28℃暗培養(yǎng)，待種子長(zhǎng)出子葉后備用。取單株幼苗子葉，放入1.5mL離心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL離心管中。將DNA提取液預(yù)熱到65℃，每管放入400μL混合樣品，將離心管置于65℃金屬浴或水浴鍋中，保溫30min后取下，向離心管中加入400μL24:1氯仿-異戊醇（V:V），振蕩混勻。10000g離心10min。將上清液200μL轉(zhuǎn)入另一支1.5mL離心管，加入400μL-20℃預(yù)冷無(wú)水乙醇沉淀DNA。10000g離心1min，棄上清液，加入500μL乙醇——乙酸銨溶液，6000g離心5min收集沉淀。加入100μLTE（pH8.0）溶液溶解DNA。將DNA適當(dāng)稀釋或濃縮，使其OD260值在0.1～0.8的區(qū)間內(nèi)，測(cè)定并記錄其在260nm和280nm的吸光度。以1個(gè)OD260值相當(dāng)于50mg/LDNA濃度來(lái)計(jì)算純化DNA的濃度，并進(jìn)行DNA凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。DNA溶液的OD260/OD280值應(yīng)在1.7～2.0之間，或質(zhì)量能復(fù)合檢測(cè)要求。2DB12/T838—2018用22對(duì)核心引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增雙親及送檢樣品各10份DNA，篩選帶型清晰，雙親間差異大，互補(bǔ)性好的引物作為純度鑒定的SSR分子標(biāo)記。6.4PCR擴(kuò)增6.4.1反應(yīng)體系總體積10μL，包括5μL超純水、1μL含Mg的10×PCR緩沖液、0.8μLdNTPs（2.5mmol/L）、2+0.6μLSSR引物（10μmol/L）、1μLTaqDNA聚合酶（2.5U/μL）、1μLDNA（30～50ng/μL），混勻。6.4.2反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，按附錄B推薦的引物退火溫度退火45s，72℃延伸45s，循環(huán)35次；72℃延伸10min；-20℃保存?zhèn)溆谩?.5變性聚丙烯酰氨凝膠電泳按照附錄C規(guī)定的方法，進(jìn)行4.5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。7純度計(jì)算以篩選出來(lái)的SSR分子標(biāo)記為引物擴(kuò)增送檢樣品的DNA，通過(guò)帶型統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子粒數(shù)的百分率表示純度，計(jì)算公式如下：3DB12/T838—2018AA附錄A（規(guī)范性附錄）溶液配制A.1DNA提取液含有200mmol/LTris-HCl（pH8.0），250mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA，0.5%SDS，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用。A.2引物稀釋按照引物合成單的說(shuō)明先配制100μmol/L的儲(chǔ)存液，取適量?jī)?chǔ)存液稀釋40倍，配制濃度為2.5mmol/L的使用液。A.36×變性上樣緩沖液去離子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，溴酚藍(lán)0.125g，二甲苯青0.125g。A.410×電泳緩沖液Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液37mL，定容至1000mL。1mL剝離硅烷，49mL三氯甲烷。0.1g過(guò)硫酸銨溶于1mL超純水中。現(xiàn)用現(xiàn)配。4DB12/T838—2018A.10A.11A.12固定液200mL冰醋酸，定容至2000mL。染色液4g硝酸銀，定容至2000mL。顯影液2000mL蒸餾水中加入40g氫氧化鈉和10mL甲醛。5DB12/T838—2018BB附錄B（規(guī)范性附錄）22對(duì)核心引物22對(duì)核心引物見(jiàn)表B.1。表B.122對(duì)核心引物表序號(hào)引物引物序列（5’—3’）退火溫度℃擴(kuò)增片段大小范圍（bp）F:AGCCATGGCAGAATTGGAAGR:TTCAGCAGGTTCTGGTTCTGGTF:CGCATCTACATCAAGAATCAACCAR:GATGTAGAACAAGGAAGCAGGGF:GAUGAATTTTGGAGCCACACACR:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGAF:CAAAACCAAATAGGTCCCCCR:CGCGCAATAATTCAATATCGF:TGCGAGTACCGAGTTCTTTCTAGR:GGCAGTCCTGGGACAACTCGF:ATGTCGCTCGCAATTTCACTR:CGTAGGGAGGAGCGATAGAGF:CGGCCAAATTATTTTTCCCAGTR:TTCCCATAGTTGAAGAUCCTGCF:TACGGTTCCTCATCCCAGAAGAR:AGGATGACCAATGTTTTGCCTCF:CCCTTCCCTTTTCTCCCTTCTTR:CAGAAACAGCCATTGATGATGF:GCGGCCTTTTGATTCATACAATR:CGTTTTACTGCCCTATCTGCTTGF:GCACGAGUCAACAAAAGAGAATR:CGCTGAUCGAGACAGAGAGAGF:TCCCATTTCGCAAGAAAGAAAAR:TCCGATACAGCTGCAGTAGAAAAF,TCAGCGATTAAGAATGCGATTGR:CCAAATTGCCCTCTCTCTTCCTF:TGTAATTAATTGAGGTGCGCUAR:TCTCTGGTTGACAATTAGGCCCF:TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACCR:TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGCF:CCACAAAGGGTTTAAGCAGCR:AAGGCAGGAGCAGAGTTCAAF:AATGCGGAGGAAGAAGAGGAAGR:TAGTCCTTATCACCGACACGGC12LJ-1LJ-25454526058605453545653545253656054555654545897~121150~15485~1173LJ-34LJ-4274~34281~1015LJ-56LJ-6106~118136~145138~151142~157155~165118~121119~135116~12284~1027LJ-7142~160126~14373~94F:ACGAGGTCCACTTCCCCATTATR:TTAGAGAAGGAATAACCGGCAGCF:CGCGATTCGATTGCTAAATCTCR:CTAATTTCCCAGTTGCGTCTGCF:TTCGGCTATTTGAACAGAAGCAR:TGATCCCTTCTTGTTTGATTTTTGF:TTTTGGGGTTCAATAAAGCTGTGR:TTCAACAAGATCATCAATTCACCA106~124237~255140~168150~150289~3186DB12/T838—2018CC附錄C（規(guī)范性附錄）制膠過(guò)程C.1凝膠制作將玻璃板洗凈，用無(wú)水乙醇擦兩遍，晾干。在長(zhǎng)板上涂1%親和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作過(guò)程中防止兩塊玻璃板互相污染。待玻璃板徹底干燥后，將其組裝好，用水平儀調(diào)平。取4.5%丙烯酰胺膠80mL，加入TEMED80μL和10%過(guò)硫酸銨400μL，迅速混勻后灌膠。灌膠過(guò)程中防止氣泡產(chǎn)生。灌膠結(jié)束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1h以上。C.2預(yù)電泳待膠凝固后，拔出梳子，將電泳槽組裝好，80W恒功率下預(yù)電泳15min～20min。C.3變性在20μLPCR產(chǎn)物中加入4μL6×變性上樣緩沖液，混勻后