生物工程專業綜合實驗

第一部分

操作性實驗人參發根培養及皂苷含量分析

第一節發根的由來1.發根培養體系的建立

發根是由發根農桿菌Agrobacteriumrhizogenes,侵染植物創傷部位細胞，轉化并整合發根農桿菌Ri質粒上的一段基因到植物細胞中，這段基因的表達導致細胞分化形成發根。嚴格來說是一種植物疾病。它是一個革蘭氏陰性土壤細菌。

發根生長快，不依賴于激素，可被開發成生產植物次生代謝產物的有效資源。

此外，發根可以在一定條件下再生成對應的整株植物，而且發根的基因和代謝性狀比較穩定。圖1發根形成原理示意圖圖2人參發根發根誘導圖第二節

實驗流程、目的、原理及注意事項實驗內容概要圖3實驗內容概要1.人參發根培養1.1實驗的目的及意義（1）掌握植物組織（發根）的培養方法及生長數據的測定及曲線繪制方法。（2）了解植物組織（發根）的形成原理；（3）了解發根生長過程形態變化。1.2實驗原理人參發根是發根農桿菌誘導人參創傷組織而形成的無性系、不依賴于激素、可無限增殖的根組織，在MS培養基上發根可以利用其大量和微量元素及碳源快速成長并合成皂苷。1.3具體流程1.3.1培養基配制滅菌

采用1/2MS成品培養基，按藥品說明配制（2.47g1/2MS成品，30g蔗糖，定容到1000ml，充分溶解15-20min），用1mol/L的NaOH或HCl調酸堿度為pH5.8（用精密pH試紙或pH計），培養基分裝到500ml三角瓶100ml/瓶；封口膜封口后，116攝氏度高壓滅菌30min，冷卻至室溫備用。1.3.2接種

取1/2MS培養好的人參發根，手術刀于滅菌平皿中切取約1-2cm發根10根約0.5g，接種到滅菌冷卻后的500ml三角瓶中，25℃搖床110rpm培養。備注：若需固體培養保存發根，在液體培養基中加入12g/L瓊脂即可。1.3.3生長數據及曲線繪制

每組接種15瓶（視情況可適當縮減瓶數最少10瓶）視發根提供量靈活掌握，起始接種量不用精確，每隔5天（周期30-35天），取10（或6）瓶測定發根濕重（在無菌室或超凈臺上，用滅菌鑷子取出，在滅菌濾紙上吸干，于滅菌平皿或濾紙上稱量，注意去皮），稱量后繼續放回原三角瓶培養。若發根后期量大不好用鑷子取出則用滅菌移液器把液體抽出，稱重發根和三角瓶總重后再把培養液放回，這一步一定要注意在裝培養基前稱量三角瓶的重量并編號記錄。

數據用3次平均后記錄并以時間d為橫坐標發根濕重為縱坐標繪制生長曲線(理論上培養3瓶即可，多測定幾瓶主要考慮的是操作染菌裕度）。并依據含水率繪制干重曲線。圖4生長曲線例圖1.3.4儀器及試劑試劑耗材備注儀器備注1/2MS培養基、蔗糖

三角瓶500ml及封口膜和繩

酒精棉球

平皿90

圓形濾紙和平皿配套

手術刀及刀架

稱量紙、滅菌包裹用紙，如報紙或錫紙

醫用鑷子、玻璃棒、容量瓶、膠頭滴管、移液管、試劑瓶

pH試紙精密含5.8

精密電子秤

蒸餾水、無水乙醇

搖床

口罩

無菌室或超凈臺、酒精燈、打火機

滅菌鍋

吹洗瓶

標簽、鉛筆，標記筆等標記工具

表1.1發根培養所需試劑儀器2.人參發根總皂苷提取及含量分析2.1實驗的目的意義（1）掌握植物組織（發根）生物活性物質皂苷提取的基本步驟；（2）掌握分光光度儀測定生物活性物質皂苷的基本操作。2.2實驗原理（1）利用皂苷可溶于有機溶劑酒精，把皂苷從發根中通過回流提取到酒精中。（2）香草醛比色原理：高氯酸將甙元的酚羥基氧化為羧基,增加1個雙鍵結構,再經雙鍵位移,雙分子縮合等反應生成共軛雙鍵系統,又在酸的作用下形成陽碳離子鹽而顯色，從而用比色法測定。1.4.1皂苷提取（1）發根用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干發根表面水分；烘箱烘干至恒重60oC（約3h），粉末置于干燥器中干燥保存備用。備注：這一步最好與前一部分最后實驗銜接好時間。（2）干燥的發根研缽細細研磨成粉末，精確稱取1g粉末，置入試管，配置并加入70%酒精20mL，70oC水浴回流提取3h。（3）放置冷卻至室溫，800rpm離心3min，取上清液，雙層濾紙過濾，用70%酒精和容量瓶重新定容到20mL。（4）取2ml提取液置入試管或比色管水浴80oC揮去乙醇后（約30-60min，成膏狀即可），按標準曲線里的比色法測定皂苷含量，依據回歸方程計算含量。同時另取2ml同法揮去乙醇，用甲醇重定容到1ml，為最后一部分的色譜分析提供待測樣品。（做3組平行數據平均，也就是取3次2ml進行實驗）2.2標準曲線制作（1）精準稱量人參皂苷Re標準品10mg，后加甲醇定容至5mL，加水稀釋成0.5mg/mL標準液。（昂貴藥品5組做1次即可）（2）精準稱量標準品溶液0mL、0.04mL、0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.20mL放在比色管或具塞試管中揮干（50度-20-30min）。（3）取準備好的5%(5g/100ml)的香草醛冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，并將其移取至6支揮干的具塞試管之中，保持65℃的恒溫，加熱，取出用自來水降溫3min，加入冰醋酸5mL，混勻，放置5-10min。（4）在波長546nm處檢測吸光度。將吸光度（A）作為縱坐標，標準溶液Re的濃度（C）為橫坐標，繪制出標準曲線，得出回歸曲線方程。*****注意：3組平行數據的平均，和空白對照***。2.3試劑及儀器表2.1發根皂苷分析需試劑儀器試劑備注儀器備注無水乙醇

圓底燒瓶、研缽、洗瓶

人參皂苷Re

冷凝回流管及配套膠管和圓底燒瓶配套冰醋酸

水浴鍋、分光光度儀、電子秤

香草醛

燒杯

高氯酸

比色管或具塞試管、試管架

甲醇

容量瓶5ml，20ml

蒸餾水

移液管、移液槍

烘箱、干燥器、及干燥劑

小型抽濾裝置及漏斗和配套濾紙

3.皂苷液相色譜分析3.1實驗目的意義（1）掌握液相色譜分析生物活性物質皂苷的基本原理及操作3.2實驗原理

利用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入待測樣品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分移動速度不同而被分離，分離后依次進入檢測器進行定性或定量檢測，從而實現對試樣的分析。圖5液相色譜分析流程3.3具體流程（1）稱取0.5mg皂苷Re甲醇定容至1mL；用0.45μm膜過濾（注射式）；（2）準備流動相乙腈：水（19：81，v/v）300mL；用0.45μm膜過濾；（3）開機，流動相接入排氣，2min沖洗5.0ml/min；（4）按色譜條件設定參數，柱溫：25℃，檢測波長：203nm，流速：1.0mL/min；（5）上樣10μL，自動數據采集，注意觀察Re的峰值，此外做一組空白對照(甲醇10μL)分析；依據空白對照，找出Re峰，并記錄標準峰出峰時間和峰面積。（6）取前述2ml提取液揮干物質，甲醇重定容1ml，膜過濾后取10μL上樣，對照標準峰，計算皂苷含量。（7）用純甲醇試劑沖洗系統，1.0ml/min沖洗40分鐘后，關機。含量計算：

標準品濃度C1，進樣量體積V1，得到一定的液相峰面積S1；待測樣品進樣量體積V2，得到一個峰面積S2。圖6色譜峰3.4試劑儀器表3.1發根皂苷色譜分析需試劑儀器試劑備注儀器備注乙腈

注射過濾器

甲醇

微膜大量過濾器0.45μm膜

0.45μm膜

色譜柱和液相色譜儀

人參皂苷Re

電子秤

4.注意事項（1）嚴格遵守實驗室規章，儀器設備操作要按照實驗室老師的要求和規程進行。操作過程要仔細認真。（2）安全：操作過程要仔細謹慎避免試劑特別是有毒試劑（如本實驗中的甲醇、乙腈）誤入口中或撒濺到眼睛、皮膚或衣服上，試劑瓶上都標有毒性級別，應注意。應佩戴口罩。廢棄物處理要科學規范。無菌室或超凈臺必須關閉紫外線后再行操作，烘箱需有人值守避免起火。（3）發根培養是無菌培養，要注意每個操作環節的無菌要求，避免染菌。（4）提前預習，每次實驗前規劃好細化的實驗步驟、方法,并把握實驗每一細節。班長負責分組，組長負責各人分工，配合協作完成任務。（7）數據記錄及處理：每個實驗節點的實驗數據、實驗現象（最好圖片記錄）都要實時、實事求是的記錄；養成科學嚴謹的態度。不得捏造和篡改實驗數據，發現者直接計零分。

皂苷分析必須做空白對照Control。&實驗數據應為3次或以上的平均值。第二部分設計性實驗1.設計性實驗題目及主要步驟1.1設計性實驗的題目：（1）植物發根誘導；（2）培養條件對植物發根主要活性物質含量的影響。兩個題目任選其一，完成《設計性實驗項目申請書》,字數不少于3000。1.2步驟概要：

（1）查閱相關文獻選定具體題目：如“桔梗發根誘導”、Tween-80對柴胡發根皂苷含量的影響”等。（2）充分閱讀文獻，設計實驗方案，按實驗教學中心提供的項目申請書模板充實相關內容。（3）

按格式完成實驗項目申請書（結合申請書模板講解）。

特別說明：參考文獻要按國標引用和列出。

可以用參考文獻管理軟件，如