第第頁專題22基因工程考點(diǎn)2DNA的粗提取與鑒定、PCR擴(kuò)增與電泳鑒定(2024山東，13，2分)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法正確的是()A.整個(gè)提取過程中可以不使用離心機(jī)B.研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應(yīng)充分搖勻再倒入燒杯中C.鑒定過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變D.僅設(shè)置一個(gè)對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍(lán)的干擾【答案】ADNA的提取過程中可以不使用離心機(jī)，可將研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，直接取上清液放入燒杯中，A正確，B錯(cuò)誤；鑒定過程需要沸水浴加熱，DNA分子在高溫下會解螺旋，雙螺旋結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，C錯(cuò)誤；加熱是唯一變量，設(shè)置一個(gè)對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍(lán)的干擾，D錯(cuò)誤。(2024黑、吉、遼，7，2分)關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是()A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C.在同一電場作用下，DNA片段越長，向負(fù)極遷移速率越快D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來【答案】A瓊脂糖凝膠濃度太高會影響DNA片段的遷移，濃度太低則會導(dǎo)致分辨率降低，因此瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小，A正確；凝膠載樣緩沖液中的指示劑可避免DNA分子遷移出凝膠，起到指示電泳進(jìn)程的作用，不能指示DNA分子的具體位置，B錯(cuò)誤；DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在同一電場作用下，DNA片段不一定向負(fù)極遷移，一般情況下，DNA片段越長移動速率越慢，C錯(cuò)誤；凝膠中的DNA分子通過染色后，可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，D錯(cuò)誤。(2024廣東，4，2分)關(guān)于技術(shù)進(jìn)步與科學(xué)發(fā)現(xiàn)之間的促進(jìn)關(guān)系，下列敘述正確的是()A.差速離心法的應(yīng)用促進(jìn)對細(xì)胞器的認(rèn)識B.電子顯微鏡的發(fā)明促進(jìn)細(xì)胞學(xué)說的提出C.光合作用的解析促進(jìn)花期控制技術(shù)的成熟D.RNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)PCR技術(shù)的發(fā)明【答案】A利用差速離心法可分離出不同細(xì)胞器，促進(jìn)了對細(xì)胞器的認(rèn)識，A正確；光學(xué)顯微鏡的發(fā)明促進(jìn)細(xì)胞學(xué)說的提出，B錯(cuò)誤；人工控制花期的主要途徑有溫度處理(通過調(diào)控溫度促進(jìn)或抑制花芽發(fā)育等)、光照處理(控制光照時(shí)間長短)、植物生長調(diào)節(jié)劑處理及栽培措施處理等，花期控制與光合作用的解析無關(guān)，C錯(cuò)誤；耐高溫的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)PCR技術(shù)的成熟，D錯(cuò)誤。(2024河北，13，2分)下列相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作正確的是()A.配制PCR反應(yīng)體系時(shí)，加入等量的4種核糖核苷酸溶液作為擴(kuò)增原料B.利用添加核酸染料的凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳后，在紫外燈下觀察結(jié)果C.將配制的酵母培養(yǎng)基煮沸并冷卻后，在酒精燈火焰旁倒平板D.將接種環(huán)燒紅，迅速蘸取酵母菌液在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落【答案】BPCR利用了DNA復(fù)制的原理，DNA的單體是脫氧核糖核苷酸，配制PCR反應(yīng)體系時(shí)，擴(kuò)增原料不能為4種核糖核苷酸，A錯(cuò)誤；瓊脂糖凝膠制備中加入的核酸染料能與DNA分子結(jié)合，凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，B正確；將配制的酵母培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌法滅菌并冷卻至50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰旁倒平板，C錯(cuò)誤；將接種環(huán)燒紅，待冷卻后(避免菌種被燙死)，迅速蘸取酵母菌液在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落，D錯(cuò)誤。(2024湖南，15，4分)（不定項(xiàng)）最早的雙脫氧測序法是在PCR反應(yīng)體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子鏈延伸時(shí)，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補(bǔ)配對原則，以加入ddATP的體系為例:若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個(gè)體的一段序列，結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是()A.上述PCR反應(yīng)體系中只加入一種引物B.電泳時(shí)產(chǎn)物的片段越小，遷移速率越慢C.5'-CTACCCGTGAT-3'，為對照個(gè)體的一段序列D.患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)镚【答案】AC利用雙脫氧測序法時(shí)，PCR反應(yīng)體系中加入的模板是待測的單鏈DNA，故只需加入一種引物，A正確；電泳時(shí)，產(chǎn)物的片段越大，遷移速率越慢，B錯(cuò)誤；分析電泳結(jié)果，以對照個(gè)體的一條鏈為模板復(fù)制的子鏈序列為5'-CTACCCGTGAT-3'，模板鏈序列為5'-ATCACGGGTAG-3'，同理患者的子鏈序列為5'-CTACCTGTGAT-3'，模板鏈序列為5'-ATCACAGGTAG-3'，對比可知，患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基G突變?yōu)锳，C正確，D錯(cuò)誤。(2024新課標(biāo)，5，6分)某種二倍體植物的P1和P2植株雜交得F1，F(xiàn)1自交得F2。對個(gè)體的DNA進(jìn)行PCR檢測，產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖所示，其中①~⑧為部分F2個(gè)體，上部2條帶是一對等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，下部2條帶是另一對等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，這2對等位基因位于非同源染色體上，下列敘述錯(cuò)誤的是()A.①②個(gè)體均為雜合體，F(xiàn)2中③所占的比例大于⑤B.還有一種F2個(gè)體的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果有3條帶C.③和⑦雜交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與②⑧電泳結(jié)果相同D.①自交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與④電泳結(jié)果相同的占1/2【答案】D由題意可知，電泳結(jié)果中，上部2條帶為一對等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物(假設(shè)依次為A、a)，下部2條帶為另一對等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物(假設(shè)依次為B、b)，這兩對等位基因位于非同源染色體上，則可推知F1基因型為AaBb，AaBb自交所得F2中，①的基因型為AaBB，②的基因型為Aabb，二者均為雜合體，③基因型為AABb，占比為1/8，⑤基因型為AABB，占比1/16，A正確；④⑥⑦⑧的基因型分別為aaBB、AAbb、aabb和AaBb，故F2中還有一種基因型為aaBb的個(gè)體，其PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果有3條帶，B正確；③(AABb)與⑦(aabb)雜交子代的基因型為AaBb和Aabb，其中Aabb對應(yīng)圖中的②，AaBb對應(yīng)圖中的⑧，C正確；①(AaBB)自交子代(1/4AABB、1/2AaBB和1/4aaBB)的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與④(aaBB)電泳結(jié)果相同的占1/4，D錯(cuò)誤。(2024山東，5，2分)制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴(kuò)增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP)的反應(yīng)管①~④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補(bǔ)配對原則，且在本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有()A.①②B.②③C.①④D.③④【答案】D反應(yīng)管②和④雖然只有一種單鏈，但是單鏈含回文序列，可以同種單鏈之間發(fā)生互補(bǔ)，四個(gè)反應(yīng)管中單鏈DNA互補(bǔ)配對情況如圖所示:由圖分析可知，D正確。(2023廣東，11，2分)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的基本過程是:裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯(cuò)誤的是()A.裂解:使細(xì)胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B.分離:可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C.沉淀:可反復(fù)多次以提高DNA的純度D.鑒定:加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍(lán)色【答案】DDNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)中，通過研磨破碎細(xì)胞，使細(xì)胞裂解釋放DNA等物質(zhì)，A正確；粗提取的DNA中可能會含有蛋白質(zhì)、多糖、RNA等雜質(zhì)，通過分離可以去除混合物中的雜質(zhì)，B正確；根據(jù)DNA和蛋白質(zhì)等在95%的冷酒精中的溶解度不同，可反復(fù)多次沉淀來提高DNA的純度，C正確；DNA鑒定時(shí)，DNA溶液加入二苯胺試劑后，需要沸水浴加熱才會變藍(lán)，D錯(cuò)誤。(2023福建，4，2分)關(guān)于“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”(實(shí)驗(yàn)Ⅰ)和“DNA的粗提取與鑒定”(實(shí)驗(yàn)Ⅱ)的實(shí)驗(yàn)操作，下列相關(guān)敘述正確的是()A.實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，PCR實(shí)驗(yàn)所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進(jìn)行高壓滅菌處理B.實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，加樣前應(yīng)先接通電源C.實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNAD.實(shí)驗(yàn)Ⅱ中，將白色絲狀物直接加入二苯胺試劑中并進(jìn)行沸水浴，用于鑒定DNA【答案】C為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理，但移液器不需要，A錯(cuò)誤；在將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，應(yīng)先加樣，然后接通電源，B錯(cuò)誤；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，因此取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后，析出的白色絲狀物即粗提取的DNA，C正確；鑒定DNA時(shí)，需要把白色絲狀物溶解在2mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺試劑進(jìn)行沸水浴，D錯(cuò)誤。(2023遼寧，19，3分)(不定項(xiàng))基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵酶。MMP2和MMP9可以降解明膠，明膠可被某染液染成藍(lán)色，因此可以利用含有明膠的凝膠電泳檢測這兩種酶在不同條件下的活性。據(jù)圖分析，下列敘述正確的是()A.SDS可以提高M(jìn)MP2和MMP9活性B.10℃保溫降低了MMP2和MMP9活性C.緩沖液用于維持MMP2和MMP9活性D.MMP2和MMP9降解明膠不具有專一性【答案】B由題意知，MMP2和MMP9能降解明膠，明膠可被某染液染成藍(lán)色，所以白色條帶越細(xì)，酶的分解能力越弱，與37℃保溫+緩沖液組相比，SDS+37℃保溫+緩沖液組MMP2和MMP9對應(yīng)的白色條帶變細(xì)，說明MMP2和MMP9活性降低，A錯(cuò)誤；據(jù)圖可知，10℃保溫下，白色條帶最細(xì)，說明MMP2和MMP9活性降低，B正確；緩沖液是為了維持電泳系統(tǒng)pH相對穩(wěn)定，C錯(cuò)誤；MMP2和MMP9降解明膠專一性的檢測缺乏其他酶或底物的對照，不能證明有無專一性，D錯(cuò)誤。(2022山東，13，2分)關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)，下列說法錯(cuò)誤的是()A.過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C.在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)【答案】B由于在低溫條件下DNA酶的活性較低，因此過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進(jìn)行是為了防止DNA降解，A正確；DNA存在于上清液中，離心研磨液是為了使蛋白質(zhì)等沉淀，B錯(cuò)誤；沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色，C正確；并非所有蛋白質(zhì)都可溶于冷酒精，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)，D正確。(2022北京，13，2分)下列高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果不要求精確定量的是()A.探究光照強(qiáng)度對光合作用強(qiáng)度的影響B(tài).DNA的粗提取與鑒定C.探索生長素類調(diào)節(jié)劑促進(jìn)插條生根的最適濃度D.模擬生物體維持pH的穩(wěn)定【答案】B教材實(shí)驗(yàn)中，探究光照強(qiáng)度對光合作用強(qiáng)度的影響需利用盛圓形小葉片的燒杯與光源的距離來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度，觀察并記錄同一時(shí)間段內(nèi)各實(shí)驗(yàn)裝置中圓形小葉片浮起的數(shù)量，A不符合題意；利用95%的冷酒精將DNA與蛋白質(zhì)分離，可粗提取DNA，用二苯胺試劑定性鑒定DNA，B符合題意；探索生長素類調(diào)節(jié)劑促進(jìn)插條生根的最適濃度需要精確定量生長素類調(diào)節(jié)劑的濃度，C不符合題意；模擬生物體維持pH的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)中，需準(zhǔn)確測定加入酸或堿后不同實(shí)驗(yàn)材料pH的變化，D不符合題意。(2021山東，13，2分)粗提取DNA時(shí)，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過濾后所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是()A.加入適量的木瓜蛋白酶B.37~40℃的水浴箱中保溫10~15分鐘C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L【答案】A加入適量的木瓜蛋白酶能分解濾液中的主要雜質(zhì)——蛋白質(zhì)，有助于提高白色絲狀物的DNA相對含量，A符合題意；37~40℃達(dá)不到破壞蛋白質(zhì)所需的溫度，所選溫度應(yīng)該是60~75℃，此溫度能夠破壞濾液中主要雜質(zhì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而去除這些雜質(zhì)，有助于提高白色絲狀物的DNA相對含量，B不符合題意；與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精是題干中的“特定試劑”，C不符合題意；加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0.14mol/L，經(jīng)過以上處理后DNA析出，過濾后DNA主要存在于紗布上的過濾物中，在濾液中含量極少，經(jīng)過D項(xiàng)處理后應(yīng)過濾去除溶液中的雜質(zhì)，再用物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液溶解DNA，有助于提高白色絲狀物的DNA相對含量，D不符合題意。(2024浙江1月選考，22，13分)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某種植物根部細(xì)胞特異性表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)膜，具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境中Zn2+的功能。為研究該植物2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Zn2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。回答下列問題:(1)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N克隆。以該植物為材料提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR每個(gè)循環(huán)第一步是進(jìn)行熱變性處理，該處理的效果類似于生物體內(nèi)的作用效果。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，DNA分子因?yàn)楹鴰ж?fù)電荷，凝膠點(diǎn)樣孔端應(yīng)靠近電泳槽負(fù)極接口；當(dāng)2個(gè)PCR產(chǎn)物相對分子質(zhì)量接近時(shí)，若延長電泳時(shí)間，凝膠中這2個(gè)條帶之間的距離會。回收DNA片段，連接至克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測序驗(yàn)證。

(2)重組表達(dá)載體構(gòu)建。分別將含M、N基因的重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切處理，然后利用連接，將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用PCR快速驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化是否成功。此反應(yīng)可以用大腸桿菌懸液當(dāng)模板的原因是。

(3)酵母菌轉(zhuǎn)化。取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，直接在固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，活化后接種至液體培養(yǎng)基，采用以擴(kuò)大菌體數(shù)量，用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母菌。檢測M、N基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)水平，無顯著差異。

(4)轉(zhuǎn)基因酵母功能鑒定。分別將轉(zhuǎn)化了M、N基因的酵母菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液用法逐級稀釋至OD600為0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液。用涂布器均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天，菌落生長如圖。該實(shí)驗(yàn)中陰性對照為。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步推測:轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N中，轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)的是，依據(jù)是。

注:OD600為波長600nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高；空載體為未插入M或N基因的表達(dá)載體。【答案】(1)根解旋酶磷酸基團(tuán)變長(2)DNA連接酶熱變性使大腸桿菌細(xì)胞破裂，DNA流出(3)劃線振蕩培養(yǎng)(4)梯度稀釋鋅吸收缺陷型酵母+空載體N轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量多解析(1)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某種植物根部細(xì)胞特異性表達(dá)，說明鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在該種植物根部細(xì)胞可轉(zhuǎn)錄出mRNA，再以mRNA為模板翻譯出鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所以進(jìn)行鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N克隆時(shí)，可以該植物根為材料提取并純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR中熱變性處理時(shí)溫度超過了90℃，雙鏈DNA解旋為2條單鏈，該處理的效果類似于生物體內(nèi)解旋酶的作用效果。DNA分子含磷酸基團(tuán)故帶負(fù)電荷。在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA分子的大小等有關(guān)，當(dāng)2個(gè)PCR產(chǎn)物相對分子質(zhì)量接近時(shí)，電泳時(shí)間過短會導(dǎo)致2個(gè)PCR產(chǎn)物分離不完全，而延長電泳時(shí)間可使2個(gè)PCR產(chǎn)物即凝膠中相應(yīng)2個(gè)條帶之間的距離變長。(2)構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，先分別將含M、N基因的重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切處理，以得到相同的黏性末端或平末端，再利用DNA連接酶連接。將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用PCR快速驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化是否成功，此反應(yīng)可以用大腸桿菌懸液當(dāng)模板的原因是若轉(zhuǎn)化成功，則大腸桿菌的DNA中含有M、N基因，熱變性會使大腸桿菌細(xì)胞破裂，DNA流出。(3)菌株一般低溫保存于固體培養(yǎng)基上故取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，可直接在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)。有氧條件下，酵母菌可以大量繁殖，故活化后接種至液體培養(yǎng)基，可采用振蕩培養(yǎng)以擴(kuò)大菌體數(shù)量。(4)可采用梯度稀釋法對菌液逐級稀釋。該實(shí)驗(yàn)中陰性對照為鋅吸收缺陷型酵母+空載體，其不含M、N基因。由“OD600為波長600nm下的吸光值，該值越大，菌液濃度越高”及題圖中相同吸光值下(OD0.006和OD0.0006)，鋅吸收缺陷型酵母+N基因表達(dá)載體組酶母菌數(shù)量明顯多于鋅吸收缺陷型酵母+M基因表達(dá)載體組，可知，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N中，轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)的是N。(2023江蘇，22，12分)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答下列問題:圖1(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有，擴(kuò)增程序中最主要的不同是。

(2)有關(guān)基因序列如圖2。引物F2-F、F1-R應(yīng)在下列選項(xiàng)中選用。

圖2A.ATGGTGCAACCA C.GACGAGCTGCAGB.TGGTTGCACCAT D.CTGCAGCTCGTC(3)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有。

(4)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有。

A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平板30~300個(gè)菌落B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長出的單菌落無需進(jìn)一步劃線純化圖3(5)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1-F和F2-R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1~P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有。

(6)對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測序確認(rèn)，原因是。

【答案】(1)模板、PCR引物反應(yīng)時(shí)間(2)CD(3)限制酶、DNA連接酶(4)ABC(5)P3、P4(6)電泳只能測定DNA長度，不能確定堿基序列是否產(chǎn)生突變解析(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有:模板分別是片段F1、片段F2；引物分別是F1-R和F1-F、F2-R和F2-F，最主要的不同是反應(yīng)時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間與模板長短有關(guān))。(2)由題中信息，畫出F1與F2片段相接的序列如圖所示:F2-F和F1-R應(yīng)與F1片段的下游和F2片段的上游序列(F1與F2片段相接處)相同或互補(bǔ)，C、D所給序列符合要求；而A項(xiàng)序列左右兩端分別與F1片段上游序列和F2片段下游序列相同，B項(xiàng)序列左右兩端分別與F2片段下游序列和F1片段上游序列互補(bǔ)，故A、B不符合要求。(3)重組酶可以依據(jù)PCR擴(kuò)增序列和線性載體兩端的同源序列進(jìn)行同源重組，不需要使用限制酶和DNA連接酶構(gòu)建基因表達(dá)載體。(4)該過程的目的不是計(jì)數(shù)，所以無需控制每個(gè)平板30~300個(gè)菌落，A錯(cuò)誤；抗性平板上未長出菌落，一般因?yàn)闆]有導(dǎo)入含抗性基因的質(zhì)粒，B錯(cuò)誤；含有抗生素的培養(yǎng)基可篩選出成功轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，不會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯(cuò)誤；單菌落一般是由單個(gè)微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物，在抗性平板上長出的單菌落一般無需進(jìn)一步劃線純化，D正確。(5)EGFP長度為720bp，AnB1長度為390bp，二者的總長度為720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其長度接近于P1、P2的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4。(6)電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測DNA分子的長度，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列是否發(fā)生突變，因此對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過基因測序確認(rèn)。(2022江蘇，24，12分)纖毛是廣泛存在的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，功能異常可引發(fā)多種疾病。因此，研究纖毛形成的作用機(jī)制具有重要意義。請回答下列問題。圖Ⅰ(1)纖毛結(jié)構(gòu)如圖Ⅰ所示，由細(xì)胞膜延伸形成的纖毛膜主要由組成。基體由中心體轉(zhuǎn)變而來，中心體在有絲分裂中的功能是。

(2)某病人腎小管上皮細(xì)胞纖毛異常，為了分析纖毛相關(guān)基因X是否發(fā)生了變異，對基因X進(jìn)行了PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物測序。從細(xì)胞樣品中分離DNA時(shí)，可通過交替調(diào)節(jié)鹽濃度將與核蛋白結(jié)合的DNA分離出來，溶液中添加NaCl至2.0mol/L的目的是。PCR擴(kuò)增時(shí)，需在催化下，在引物的端進(jìn)行DNA鏈的延伸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物用于測序。

(3)為研究蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的定位，構(gòu)建綠色熒光蛋白GFP與X的融合蛋白，融合蛋白具有綠色熒光，可指示其在細(xì)胞內(nèi)位置。將X-GFP基因融合片段M導(dǎo)入如圖Ⅱ所示載體質(zhì)粒Y，構(gòu)建Y-M重組質(zhì)粒(在EcoRⅤ位點(diǎn)插入片段)。請完成下表。圖Ⅱ圖Ⅲ分步實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)簡易操作、結(jié)果、分析PCR鑒定正向重組質(zhì)粒Y-M①選擇圖Ⅱ引物；②PCR目的產(chǎn)物約為bp

確保M及連接處序列正確③質(zhì)粒測序，圖Ⅲ中正確的是(選填序列編號)

檢測融合蛋白定位④對照質(zhì)粒Y-GFP(僅表達(dá)GFP)與實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒Y-M分別導(dǎo)入細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光而實(shí)驗(yàn)組熒光集中在纖毛基部，說明

(4)為研究另一纖毛病相關(guān)基因Z表達(dá)的變化，采用熒光定量PCR法檢測健康人與病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平。采集樣本、提取總RNA，經(jīng)形成cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在總cDNA模板量相等的條件下，健康人Ct值為15，而病人Ct值為20(Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的PCR循環(huán)數(shù))。從理論上估算，在PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的倍。

【答案】(1)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)出星射線，形成紡錘體(2)溶解DNATaqDNA聚合酶(或耐高溫的DNA聚合酶)3'(3)①a、b②1100③Q4④蛋白X定位于纖毛基部(4)逆轉(zhuǎn)錄32解析(1)纖毛膜由細(xì)胞膜延伸形成，細(xì)胞膜的組成成分主要是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)；在低等植物和動物細(xì)胞有絲分裂的前期，中心體發(fā)出星射線，形成紡錘體。(2)DNA在2.0mol/L的NaCl溶液中溶解度很高，常用該濃度的NaCl溶液溶解DNA。PCR是體外大量擴(kuò)增DNA分子的技術(shù)，PCR過程需要TaqDNA聚合酶(或耐高溫的DNA聚合酶，可催化DNA子鏈的延伸)、引物(在PCR過程中為TaqDNA聚合酶提供3'-OH，使該酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸)、四種游離的脫氧核苷酸(合成DNA子鏈的原料)、緩沖液(提供液體環(huán)境及離子條件)、DNA母鏈(DNA復(fù)制的模板)。(3)片段M正向拼接和反向拼接結(jié)果如圖:用PCR鑒定是否為正向重組質(zhì)粒Y-M，可選用引物a和引物b，目的產(chǎn)物約為1100bp。若M與載體質(zhì)粒Y正確連接，則上游連接處含有HindⅢ+EcoRⅤ的識別序列，即5'…AAGCTT…GATATC…3'，即Q4，下游含有EcoRⅤ+BamHⅠ的識別序列，即5'…GATATC…GGATCC…3'，即質(zhì)粒測序正確的是Q4。本實(shí)驗(yàn)的目的是借助綠色熒光蛋白檢測蛋白質(zhì)X在細(xì)胞中的位置，則實(shí)驗(yàn)組導(dǎo)入的是質(zhì)粒Y-M(M為X-GFP基因融合片段)，表達(dá)X-GFP，對照組導(dǎo)入僅表達(dá)GFP的質(zhì)粒Y-GFP，依據(jù)實(shí)驗(yàn)組綠色熒光集中在纖毛基部，而對照組整個(gè)細(xì)胞均有綠色熒光，可知蛋白X定位于纖毛基部。(4)提取細(xì)胞的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，cDNA作為熒光定量PCR的模板。熒光定量PCR過程中，特定PCR循環(huán)次數(shù)下產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與模板量呈正相關(guān)，雖然限定了總cDNA模板量相等，但要注意由于健康人和病人基因Z的轉(zhuǎn)錄水平不同，相應(yīng)的mRNA含量不同，因此基因Z的cDNA含量并不相同，設(shè)健康人基因Z的cDNA模板量為x，病人的為y，由“健康人Ct值為15，而病人Ct值為20”知，x×215=y×220，PCR擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物中，健康人樣品的目的產(chǎn)物大約是病人的(x×220)÷(y×220)=(x×220