第二十六章基因工程藥物基因工程藥物概論基因工程藥物含義基因工程藥物就是指采用基因工程技術(shù)研制得,能預(yù)防和治療某種疾病但含量極微而難以用傳統(tǒng)方法制取得特殊藥物。一、基因工程藥物種類蛋白細(xì)胞因子藥物蛋白類激素溶血栓藥物治療用酶可溶性受體和黏附分子其它核酸DNA藥物反義RNA藥物RNAi藥物核酶重組蛋白質(zhì)類藥物細(xì)胞因子藥物:干擾素、集落因子、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、生長因子、凝血因子蛋白質(zhì)類激素藥物:生長激素、胰島素、胰島素樣生長因子、促卵泡素、甲狀旁腺素、降鈣素、胰高血糖素、促黃體生成素、甲狀腺刺激素和心鈉素等。溶血栓藥物:組織型纖溶酶激活劑、尿激酶型纖溶原激活物、蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑、鏈激酶和葡激酶等。治療用酶:超氧化物歧化酶、羧肽酶、尿酸氧化酶、葡糖腦苷脂酶、脫氧核糖核酸酶和胸苷激酶等。可溶性受體和黏附分子:可溶性補(bǔ)體受體Ⅰ型其她:血紅蛋白、白蛋白等。核酸類藥物核酸類藥物主要就是在核酸水平(DNA和RNA)上發(fā)揮作用,她通過糾正突變得基因并使之重新獲得適當(dāng)?shù)霉δ軄碇委熁蝾A(yù)防疾病。特點(diǎn)就是:能將基因表達(dá)得產(chǎn)物得作用局限于病變組織周圍,從而使治療更具針對性;只要轉(zhuǎn)化細(xì)胞不被清除,轉(zhuǎn)化得式因不被抑制,基因表達(dá)得產(chǎn)物就可以持續(xù)發(fā)揮作用。基因工程藥物得特點(diǎn)從根本上解決了某些藥物得生物原料適應(yīng)證不斷延伸技術(shù)含量高加速疑難病癥新藥物得開發(fā)二、研制基因工程藥物得關(guān)鍵技術(shù)確定研制基因工程藥物得技術(shù)路線基本技術(shù)路線1:獲得具有預(yù)防和治療作用得蛋白質(zhì)得基因

組入表達(dá)載體

受體細(xì)胞高效表達(dá)

動物試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)

申報(bào)新藥證書

基本技術(shù)路線2:基因組

未知功能得人類基因全長cDNA群

組入表達(dá)載體

受體細(xì)胞瞬間表達(dá)

功能初篩

功能驗(yàn)證

重組蛋白表達(dá)

體內(nèi)外藥效分析

臨床前研究

臨床驗(yàn)證

申報(bào)新藥證書優(yōu)點(diǎn):目得明確。缺點(diǎn):發(fā)現(xiàn)新藥得機(jī)率低,在人體內(nèi)表達(dá)量較高得蛋白質(zhì)才有較大可能被開發(fā)。建立在龐大人類基因資源基礎(chǔ)上得,具有巨大得開發(fā)潛力,縮短新藥開發(fā)得時(shí)間,可大規(guī)模增加新藥得數(shù)量。

目得基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線基因工程得操作流程1、分:分離目得基因2、切:對目得基因和載體適當(dāng)切割3、接:目得基因與載體連接4、轉(zhuǎn):重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞5、篩:篩選出含有重組體得受體細(xì)胞6、表:目得基因在受體細(xì)胞中表達(dá),受體細(xì)胞成長為基因改造生物基因工程制藥得基本過程獲得目得基因

↓

構(gòu)建重組質(zhì)粒

↓

組建基因工程細(xì)胞

↓

工程菌培養(yǎng)

↓

產(chǎn)物分離純化大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜Freetemplatefro13三、基因工程制藥實(shí)例人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GMCSF)就是一個(gè)具有多項(xiàng)潛能得造血生長因子,她不僅能夠促進(jìn)造血前體細(xì)胞得增殖、分化和成熟,而且對其她得細(xì)胞,如抗原遞呈細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、皮膚粘膜細(xì)胞等,均有著不同程度得刺激作用。GMCSF對某些疾病,如腫瘤患者放療、化療以后得白細(xì)胞減少癥、再生障礙性貧血和骨髓移植得治療有重要作用,以及在抗病素、抗真菌感染等得治療中也有良好得療效。1985年Sieff等發(fā)表了第一篇有關(guān)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子得文章后,這些年來有關(guān)rhGMCSF研究報(bào)道得文獻(xiàn)每年均在千篇左右。GMCSF就是糖蛋白,相對分子質(zhì)量為22000,基因定位在第5條染色體長臂上,基因約2、5kb,含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。其mRNA包括編碼成熟蛋白質(zhì)得127個(gè)氨基酸殘基和信號肽得17個(gè)氨基酸殘基得密碼子。重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子產(chǎn)品1、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子得制備利用表達(dá)分泌型GMCSF工程菌W3100/pGMCSF可以表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)和生物活性得GMCSF,表達(dá)量高,易于純化,無需復(fù)性,純化得GMCSF比活高于包含體型,但其發(fā)酵表達(dá)技術(shù)較難掌握。分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF發(fā)酵工藝發(fā)酵甘油保存菌劃平皿,挑取單菌落,接種于LB種子培養(yǎng)基中,18h,再擴(kuò)大培養(yǎng)12h,接種于30L發(fā)酵罐,30℃培養(yǎng),過程中流加50%得葡萄糖、酵母浸出液及酷素水解物。培養(yǎng)20h左右時(shí)開始表達(dá),28h表達(dá)就是高峰,之后細(xì)菌開始死亡,雜蛋白增加。培養(yǎng)過程中,尤其就是對數(shù)期,用葡萄糖得加量來控制細(xì)菌生長速度,以免溶氧量下降過快。發(fā)酵產(chǎn)物為分泌型GMCSF,占菌體總蛋白得25%以上。發(fā)酵產(chǎn)物收集、純化離心離子交換層析或親和層析純化超濾濃縮,分子篩除菌過濾、分裝、凍干近年應(yīng)用較多得還有融合蛋白表達(dá)GMCSF得方法。采用ＰＣＲ方法改建人粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子得ｃＤＮＡ,３′換用ＴＡＡ終止密碼,將其克隆入多種不同表達(dá)融合蛋白得載體中,并在ｃＤＮＡ與上游細(xì)菌蛋白基因之間嵌入凝血酶接頭,導(dǎo)入適當(dāng)宿主后均獲得高效表達(dá),表達(dá)融合蛋白經(jīng)凝血酶消化后釋放出Ｎ－末端與天然成熟蛋白一級結(jié)構(gòu)(糖基化除外)完全相同得ｒｈＧＭＣＳＦ,經(jīng)層析純化可得到適宜人體應(yīng)用得活性蛋白。2、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求半成品檢定

主要包括下列項(xiàng)目:蛋白質(zhì)含量測定,活性測定,比活性測定,相對分子質(zhì)量測定,純度測定,核酸含量測定,鼠IgG含量測定,等電點(diǎn)測定,無菌試驗(yàn),熱原質(zhì)等。成品檢定

主要包括下列項(xiàng)目:外觀檢查,活性測定,水分測定,無菌試驗(yàn),安全毒性試驗(yàn),熱原質(zhì)試驗(yàn),肽圖測定等。二、干擾素干擾素(interferon,IFN)就是人體細(xì)胞分泌得一種活性蛋白質(zhì),具有廣泛得抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性,就是人體防御系統(tǒng)得重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性得差異分為α、β、γ、ω等4個(gè)類型。α型干擾素再分為α1b、α2a、α2b等亞型,其區(qū)別表現(xiàn)為個(gè)別氨基酸得差異。早期干擾素就是用病毒誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生得,產(chǎn)量低、價(jià)格昂貴,不能滿足需要。1、基因工程菌得組建人染色體上得干擾素基因只有1、5%,拷貝量極少,所以不能直接從人體得染色體上分離干擾素基因。組建干擾素工程菌得流程誘生得白細(xì)胞提取全RNA通過寡dT-纖維素柱獲得mRNA5%～23%蔗糖密度梯度離心提取12S得mRNA自mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA雙鏈cDNA用末端DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或dG尾pBR322質(zhì)粒pBR322質(zhì)粒DNA得PstⅠ酶切割加上dA或dC

退火獲得雜交質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12擴(kuò)增雜交質(zhì)粒篩選抗四環(huán)素但對氨芐青霉素敏感得細(xì)菌克隆

用已知干擾素得DNA片段作為探針挑選富有干擾素cDNA得克隆

將干擾素cDNA克隆入表達(dá)載體在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)

2、基因工程干擾素得制備制備基因工程α-干擾素工藝流程如下:啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提半成品檢定半成品制備精提

分裝凍干成品檢定成品包裝2、基因工程菌得發(fā)酵生產(chǎn)人干擾素a-2b得基因工程菌為SW-IFNa-2b/E、coli—DH5a。

質(zhì)粒使用PL啟動子,含有四環(huán)素抗性基因。

種子培養(yǎng)液含1%蛋白胨、0、5%酵母提取物、0、5%NaCl

↓

基因工程菌接種到4個(gè)1000ml三角燒瓶之中,每個(gè)燒瓶內(nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基,30℃搖床培養(yǎng)10小時(shí),作為發(fā)酵罐得種子↓

用15L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵,裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L

發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下(1%蛋白胨、0、5%酵母提取物、0、05%NaCl、0、01%NH4Cl、0、6%Na2HPO4、0、001%CaCl2、0、3%KH2PO4、0、01%MgSO4、0、4%葡萄糖、50mg/ml四環(huán)素、少量防泡沫劑,PH=6、8。)↓

攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1:1v/v*min、溶氧量為50%

30℃發(fā)酵8小時(shí)(細(xì)菌增殖階段)

42℃誘導(dǎo)2-3小時(shí)(產(chǎn)物生產(chǎn)階段)↓

鑒控手段:每隔不同時(shí)間,取2毫升發(fā)酵液,10000r/min離心除去上清液,稱量菌體濕重。3、干擾素得制備發(fā)酵物質(zhì)4000r/min離心30min,除去上清液,得濕菌,從其中取100g。懸浮于20mmol/L磷酸緩沖液(PH=7、0)500ml之中,冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎。

↓

4000r/min離心30min,除去上清液。沉淀部分用100ml提取液在室溫條件下,進(jìn)行攪拌抽提2小時(shí),提取液組成配方[8mol/L尿素、20mmol/L磷酸緩沖液(PH=7、0)、0、5mmol/L二巰基蘇糖醇]。

↓

提取液15000r/min離心30min,下層不溶棄去。取上清液,用20mmol/L磷酸緩沖液(PH=7、0)稀釋至尿素濃度0、5mol/L

↓

加入0、1mmol/L二巰基蘇糖醇,4℃攪拌15小時(shí)。15000r/min離心30min,除去不溶物。上清液用截流量=10000相對分子質(zhì)量得中空纖維超濾器濃縮

↓

濃縮液采用SephadexG50層析柱分離,層析柱2cm*100cm、先用20mmol/L磷酸緩沖液(PH=7、0)平衡固定相,上柱之后,用同一緩沖液洗脫分離

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收集人干擾素a-2b部分,用SDS檢查。再經(jīng)DE-52柱進(jìn)行純化

層析柱2cm*50cm、上柱之后,分別采用含有0、05mol/L、0、10mol/L、0、15mol/L得NaCl得20mmol/L磷酸緩沖液(PH=7、0)洗滌。

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收集含有收集人干擾素a-2b部分。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。

[得率要求:全過程蛋白質(zhì)回收率為20-25%,產(chǎn)品不含雜蛋白質(zhì)、DNA、熱原質(zhì)檢測合格。]4、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求(1)半成品檢定(2)成品檢定(1)半成品檢定--13項(xiàng)指標(biāo)1、干擾素效價(jià)測定采用細(xì)胞病變抑制法,用Wish細(xì)胞、VSV病毒作為基本檢測系統(tǒng),對照國家標(biāo)準(zhǔn)、或者國標(biāo)參考品。2、蛋白質(zhì)含量測定用福林-酚法,以中國藥品生物制品檢定所提供得標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為對照3、比活性測定干擾素效價(jià)國際單位÷蛋白質(zhì)含量得毫克數(shù)4、純度測定(1)銀染顯色法測定應(yīng)為單一顯色區(qū)帶,(2)掃描儀測定純度應(yīng)在95%以上,(3)SDS電泳測定允許少量聚合體存在,但不超過10%,(4)高效液相色譜測定應(yīng)呈一個(gè)吸收峰狀態(tài),主峰應(yīng)占峰總面積得95%,(5)GPC柱純度測定也應(yīng)呈一個(gè)吸收峰狀態(tài),主峰應(yīng)占峰總面積得95%。5、相對分子量測定用還原型SDS法,加樣不低于5ug,用已知分子質(zhì)量得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化系列作對照,遷移率為橫坐標(biāo)、相對分子質(zhì)量得對數(shù)作為縱坐標(biāo),計(jì)算相對分子質(zhì)量,其誤差不得高于10%。6、殘余外源性DNA含量測定用放射性核素或生物素探針法測定,每一劑量中得殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。7、殘余抗生素活性測定凡就是菌種傳代中使用過抗生素得基因工程產(chǎn)物,必須進(jìn)行殘余抗生素活性測定,半成品中不得檢出殘余抗生素活性。8、紫外光譜掃描用全自動掃描紫外分光光度計(jì)測定光譜圖,其最大吸收值應(yīng)為280nm∝2nm。9、肽圖測定用CNBr裂解法測定,每一批次之間應(yīng)該保持一致。10、等電點(diǎn)測定等電點(diǎn)聚焦電泳法,每一批次之間應(yīng)該保持一致。11、無菌試驗(yàn)微生物學(xué)檢測法。12、熱原質(zhì)試驗(yàn)鱟試劑法。(2)成品檢定--7項(xiàng)指標(biāo)1、物理性狀外觀為折色、微黃色疏松體,加入注射用蒸餾水之后,不得含有肉眼可見得不溶物。2、鑒別試驗(yàn)(1)ELISA試驗(yàn)、(2)中和試驗(yàn)3、水分測定用卡氏水分測定儀,水分含量應(yīng)低于3%。4、無菌試驗(yàn)