基因組學考點復習緒論基因組學的發(fā)展歷史和現(xiàn)實狀況（人類基因組計劃HGP）答:人類基因組計劃與20世紀80年代中期開始醞釀，1989年美國正式資助，6月宣布完畢人類基因草圖。人類基因組計劃是一項世界范圍的科研項目，有六個國家16個單位參與，中國是其中之一。人類基因組測序計劃原定于結束，由于采用某些新的技術提前3年完畢。國際人類基因組測序聯(lián)合體公布的人類基因組草圖覆蓋了整個基因組的86.8%，包括常染色質(zhì)區(qū)域的97%。截止.1.31，國際上已完畢的和正在進行的基因組測序計劃共12251個，包括真核生物，真細菌和古細菌。基因組學的研究內(nèi)容答:Genomics:Thestudiesofthestructureandfunctionofgenomes.Structureandsequenceofgenomes;Functionofgenomics;Appliedgenomics.什么是基因組Genome、轉錄組和蛋白質(zhì)組答：Genome：Theentiretyofanorganism'shereditaryinformation.ItisencodedeitherinDNAor,formanytypesofvirus,inRNA.轉錄組：RNAcopiesoftheactiveprotein-codinggenes。蛋白質(zhì)組：Thecell’srepertoireofproteins遺傳作圖遺傳作圖的分子標識類型（RFLP、STR/VNTR/Microsatellite、SNP）、分布特性和作圖措施答：RFLP：Restrictionfragmentlengthpolymorphisms,限制性片段長度多態(tài)性；VNTR：小衛(wèi)星序列STR:微衛(wèi)星序列SNP：單核苷酸多態(tài)性singlenucleotidepolymorphisms衛(wèi)星、小衛(wèi)星、微衛(wèi)星的區(qū)別答：衛(wèi)星的構成單位是短堿基序列，衛(wèi)星序列位于染色體的異染色質(zhì)區(qū)；小衛(wèi)星在染色體上分布于常染色質(zhì)區(qū)；微衛(wèi)星反復單位僅2-5bp，也位于常染色質(zhì)區(qū)。SNP的高通量檢測技術有哪些答：（1）、未知SNP的發(fā)現(xiàn)：即通過找尋未知的SNP，并對其分析以確定此SNP與遺傳疾病的關系；（2）已知SNP的遺傳分型：即對不一樣人群的SNP遺傳多樣性進行檢測或對已知致病基因的遺傳病進行診斷。個體基因身份鑒定的原理（STR）和應用（法醫(yī)、親子鑒定等）答：ThePCRproductsarethenseparatedbyeithergelelectrophoresisorcapillaryelectrophoresis.采用品有國際原則的13-16個關鍵STR位點進行DNA檢測，綜合這些位點信息，個人的個體識別率已超過仟億分之一，即1000億人之間不會有兩個個體的STR基因型發(fā)生反復，完全可以進行個人同一認定。在遭遇意外事故、失散、財產(chǎn)繼承、試管嬰兒、骨髓移植、克隆器官或克隆生命體等原因引起的需要進行個體識別和親權鑒定中，基因身份證將發(fā)揮至關重要的作用。遺傳圖譜偏高的原因（遺傳作圖的局限性）答：Mapresolutiondependson：samplesizeforcrossbreed；quantificationofpolymorphicmarkers.Limitedaccuracy：Recombinationhotspot；Exchangefrequencydifferencesbetweengenders；Numerousexchangesbetweentwolocus個體基因組中多態(tài)性的體現(xiàn)形式（SNP、Indel、STR、Structuralvariation）答：SNP：同一種體或不一樣個體基因組中等位位點上的單核苷酸堿基不一樣。對于二倍體生物，等位位點上的SNP有雜合、純合之分。物理作圖遺傳作圖和物理作圖在作圖原理、標識類型、標識措施、圖距單位上的差異和聯(lián)絡（1cM約相稱于1Mb）答：作圖原理：區(qū)別：遺傳作圖采用遺傳學分析措施將基因或其他DNA分子標識標定在染色體上構建連鎖圖；物理作圖采用分子生物學技術直接將DNA分子標識基因或克隆標定在基因組的實際位置所構建的位置圖。聯(lián)絡：它們都是確定基因或DNA分子標識在染色體上的排列位置標識類型：遺傳作圖的標識類型有性狀、基因或DNA分子標識；物理作圖有限制性作圖、基于克隆的基因組作圖、熒光原位雜交作圖和序列標簽位點。聯(lián)絡：由于措施的局限性，遺傳圖和物理圖均會產(chǎn)生某些偏差，通過共同的做圖標識可以互相校正，由此獲得愈加精確的基因組連鎖圖。標識措施：區(qū)別：遺傳圖：RFLP\SSLP\SNP物理圖：Gene、Restrictionsite、STS、FISH圖距單位：遺傳圖：厘摩（CM）物理圖：依作圖措施而異。聯(lián)絡：都與互換率有關。物理作圖從尺度分為哪幾種答：Cytogeneticmapping、Restrictionmapping、FISH、RHmapping、Clonebasedmapping輻射雜交作圖的原理和合用性答：Radiationhybrid(RH)map:AgenomemapinwhichSTSsarepositionedrelativetooneanotheronthebasisofthefrequencywithwhichtheyareseparatedbyradiation-inducedbreaks.（作圖需要已知序列的STS和一套輻射雜種細胞系，作圖後得到STS之間的圖距。）Thefrequencyisassayedbyanalysingapanelofhuman–hamsterhybridcelllines,eachproducedbylethallyirradiatinghumancellsandfusingthemwithrecipienthamstercellssuchthateachcarriesacollectionofhumanchromosomalfragments.熒光原位雜交的原理答：ThepositionatwhichtheprobehybridizestothechromosomalDNAisvisualizedbydetectingthefluorescentsignalemittedbythelabeledDNA.限制性作圖原理：與RFLP的區(qū)別答：comparethefragmentsizesproducedwhenaDNAmoleculeisdigestedwithtwodifferentrestrictionenzymestodecidetherestrictionsiteofthetwoenzymesintheDNAmolecule.HGP原則克隆載體BAC的構造答：pBAC為mini-F的衍生質(zhì)粒。OriS和repE基因介導F因子的單向復制，parA和parB維持低水平質(zhì)粒拷貝數(shù)，每個基因組約1-2個拷貝。CosN為λ噬菌體末端酶專一性切割位點，loxP為P1Cre蛋白作用位點，均可將環(huán)狀BACDNA轉變?yōu)榫€型分子，便于物理圖繪制。HindIII和BamHI為外源DNA插入位置，兩側的NotI位點可用于直接檢測克隆的大分子DNA。什么是STS，哪些序列適合作為STS？答：STSareshortsequencesthatareoperationallyuniqueinthegenomeandareusedtogeneratemappingreagents.ESTs(expressedsequencetags)、SSLP、Randomgenomicsequeces基因組測序第一代基因組測序的方略：克隆重疊群法和鳥槍法第一代人類基因組測序測了多少條染色體（24條）克隆重疊群（Clonecontigs）和支架（Scaffold）的含義克隆重疊群：一群互相重疊的克隆或DNA序列，可以是草圖序列或精確序列，包括持續(xù)的或不持續(xù)的DNA序列支架：一組錨定在染色體上的重疊群，內(nèi)部含間隙或不含間隙怎樣運用克隆指紋構建contigs：由于BAC（細菌人工染色體）克隆DNA可以大規(guī)模機械化制備，酶切核電用凝膠分離，通過計算機對酶切片段的掃描識別，可對BAC克隆進行大范圍的指紋比對和排列，由此迅速構建指紋重疊群鳥槍法基因組測序的含義、局限性和合用性含義：將整個基因組DNA打斷成小片段後將其克隆到質(zhì)粒載體中，然後隨機挑取克隆對插入片段進行測序，并以獲得的測序序列構建重疊群，進而搭建序列支架，最終以分子標識為向導將序列錨定到基因組整合圖上。局限性：1、假如基因組太大，構造過于復雜，序列組裝的起始階段工作量非常大，必須對所有已知小片段序列進行分析，找出共有序列組裝成很小的重疊群。序列組裝時也許會將反復基因過濾掉從而丟失許多重要信息；2、存在大量難以彌補的間隙，這些間隙所處的物理圖位置難以判斷，給序列彌補帶來很大麻煩合用性：鳥槍法長處在于測序速度快，并且無需提供有關的遺傳圖和物理圖，此外全基因組鳥槍法測序覆蓋面較大，有些在作圖法中遺漏的基因可在鳥槍法測序中發(fā)現(xiàn)。測序的覆蓋率（Coverage）和深度（Depth）測序深度：指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的壁紙。假設一種基因大小為2M，測序深度為10%，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。覆蓋度：指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、反復序列等復雜構造的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋所有的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap，例如一種細菌基因組測序，覆蓋度是98%，那么尚有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。第二代高通量基因組測序的三巨頭及其基本原理：Roche454GS：焦磷酸光點測序原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和ATP雙磷酸酶的作用下，將每一種dNTP的聚合與一次化學發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學發(fā)光信號的有無和強度，到達實時檢測DNA序列的目的。IlluminaGA：將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面（即Flowcell），這些DNA片段通過延伸和橋式擴增後，在Flowcell上形成了數(shù)以億計Cluster，每個Cluster是具有數(shù)仟份相似模板的單分子簇。然後運用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的邊合成邊測序（Sequencing-by-synthesis,SBS）技術看待測的模板DNA進行測序。ABISoLid：用連接法測序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨即的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同步校正測序錯誤，并可結合原始顏色序列的質(zhì)量信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點。基因組序列拼接的難點在于：反復序列和缺口（序列缺口和物理缺口）；兩類缺口的含義和彌補措施：序列間隙：指測序時遺漏的序列，這些序列仍然保留在尚未挑選到的克隆中。彌補：首先搜集所有已知間隙兩側的序列，由此設計專一性探針，從基因組文庫中篩選陽性克隆，再由篩選到的陽性克隆PCR擴增，進行克隆和測序。物理間隙：指構建基因組文庫時被丟失的DNA序列，它們從已經(jīng)有的克隆群體中永久性地消失。彌補：1、運用一種不一樣的載體重新構建一種基因文庫，以間隙兩側重疊群末端序列作為探針篩選第二個文庫；2、運用PCR措施，將不一樣重疊群末端序列作為引物兩兩配組擴增基因組DNA目前已完畢全基因組測序的物種大體有多少（多種）基因組概貌病毒基因組的構成和復制方略的多樣性（以、和為例）構成：核酸：DNA/RNA；基因組的形狀：線性、環(huán)形、片段；核酸鏈：雙鏈、單鏈、部分雙鏈（單鏈RNA有正反鏈的區(qū)別）復制方略多樣性：流感病毒FLU:流感病毒的基因組是多節(jié)段ss（-）RNA,復制時多種片段是作為一種整體一起復制的，反義鏈RNA先在RNA聚合酶作用下逆轉錄出正義RNA鏈，結合形成雙鏈DNA後整合到宿主染色體上擴增出子代病毒mRNA和子代核酸。乙肝病毒HBV：乙肝病毒的基因組是由兩條螺旋的DNA鏈圍成的一種環(huán)形構造。其中一條較長負鏈已經(jīng)形成完整的環(huán)狀；另一條長度較短的正鏈，呈半環(huán)狀。在感染肝細胞之後，這條半環(huán)狀的DNA鏈要以負鏈為模板，在乙肝病毒DNA聚合酶的作用下延長，最終形成完整的環(huán)狀，然後再以此為模板進行DNA復制。艾滋病毒HIV：其基因組是ss（+）RNA，復制時先有正義鏈逆轉錄形成反義鏈，再由RNA酶降解親代正義鏈，由新合成的反義鏈為模板逆轉錄出新的正義鏈，結合形成dsRNA整合到宿主細胞進行復制原核生物基因組的大小、基本特點（操縱子、單倍性、持續(xù)性等）原核生物基因組較小，只具有一種染色體，呈環(huán)狀或線狀，只有一種復制起點，一種基因組就是一種復制子。特點：1、基因體現(xiàn)和調(diào)控的一種完整單位，包括構造基因、調(diào)控基因和被調(diào)控基因產(chǎn)物所識別的DNA調(diào)控原件（啟動子等）。2、中間不被非編碼次序所打斷。3、其基因數(shù)目越靠近用DNA分子量所估計的基因數(shù)。4、功能親密有關的基因常高度集中，越簡樸的生物，集中程度越高絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)，構造基因多為單拷貝6、構造基因中無重疊現(xiàn)象。7、基因組中存在可移動的DNA序列，如轉座子和質(zhì)粒等原核生物基因組元件存在側向基因轉移（Lateralgenetransfer）側向基因轉移：Transferofagenefromonespeciestoanother.菌種之間有大量橫向基因轉移：幾百到幾仟kb;細菌與古細菌之間也存在橫向基因轉移。Thepicturethatisemergingisoneinwhichprokaryoteslivinginsimilarecologicalnichesexchangegeneswithoneanotherinordertoincreasetheirindividualfitnessforsurvivalintheirparticularenvironment.Ways：Transformation；Transduction；Conjugation真核生物基因組的基本特性1、CpG島：CpG島常常出目前真核生物的管家基因的調(diào)控區(qū)，在許多基因的啟動子或“起始”區(qū)域周圍，甲基化常常被克制，這些區(qū)域包括濃度相對較高的CpG對，與此段區(qū)域對應的染色體區(qū)段一起被稱作CpG島，其長度一般在幾百到幾仟核苷酸的長度內(nèi)變化；2、假基因：假基因具有與功能基因相似的序列，但由于有許多突變以致失去了原有的功能，因此假基因是沒有功能的基因，常用ψ表達。存在C值矛盾：C值的大小與物種的構造構成和功能的復雜性沒有嚴格的對應關系的現(xiàn)象。由于真核生物基因組染色體上存在不一樣數(shù)目的反復序列；4、反復序列：構成基因組的DNA序列，根據(jù)其反復的頻度可分為三類。一是基因組只有一種復制序列的單一DNA，二為高度反復序列（highlyrepetitivesequence），由較短的序列105—107次直線連結而成，其中含隨體DNA等。第三為中等程度的反復序列（moderatelyrepetitivesequence），為有300—500個核苷對的大體相似的序列假基因形成的原因（常規(guī)的和加工的）1、常規(guī)假基因：DNA復制和突變引起，常位于同源基因有功能拷貝的附近，具有內(nèi)含子。無意突變：基因內(nèi)部出現(xiàn)終止密碼子；啟動子突變失活；剪接信號缺陷；偶爾也也許通過一種有利突變而激活；2、加工的假基因：功能基因的mRNA通過逆轉錄產(chǎn)生cDNA插入基因組形成，無內(nèi)含子。無啟動子，來源于RNA聚合酶III轉錄物的假基因除外，由于它們的啟動子位于mRNA序列內(nèi)部，如Alu序列。真核生物基因組中轉座子的類型（LINE、SINE、Alu序列）及其生物學意義LINE(longinterspersednuclearelements，長分散核因子):containsreversetranscriptase.SINE（shortinterspersednuclearelement，短分散核因子）:itstranspositiondependsonreversetranscriptaseprovidedbyotherautonomousretroelements.ALU：Alu反復序列是哺乳動物基因組中SINE家族的一員，約有50萬份拷貝，由于這種DNA序列中有限制性內(nèi)切核酸酶Alu的識別序列AGCT，因此稱為Alu反復序列生物學意義：目前轉座子元件是植物分子生物學操作和植物基因工程中分離克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大類—反轉錄轉座子具有分布廣、異源轉座高和受組織培養(yǎng)誘導激活等優(yōu)勢，因此它的發(fā)現(xiàn)和運用又為轉座子標簽的應用提供了更廣闊的前景。此外通過對既有轉座元件的改造以及轉座元件作為載體改造的工具，也將大大加速植物基因和功能序列的分離與研究。真核生物細胞器基因組（線粒體、葉綠體）的特點1、葉綠體：大小：物種間變化不大，構成相似，大小相近（100~200kb），包括約200個基因，如rRNA、tRNA、核糖體蛋白質(zhì)基因、光合作用有關基因；數(shù)目：綠藻中約1000個拷貝，高等植物中每個細胞約200個拷貝；特性：有兩段較大的反向反復序列(IR區(qū))，編碼rRNA，可以防止分子內(nèi)重組，保持穩(wěn)定的構成。2、線粒體：人類：基因組較小（16.6kb），構造緊湊，間隔序列很少，具有個別重疊基因；酵母（低等真核生物和高等植物）：基因組較大（75kb），有較長的間隔序列和較多內(nèi)含子，有的內(nèi)含子中包括基因，功能為RNA剪接，高等植物線粒體基因組中散布有許多短反復序列，常導致重排，使線粒體基因組變化很大(200~2500kb),并在同一種體中不均一分布。重要的7種模式生物（大腸桿菌Escherichiacoli、酵母Saccharomycescevevisiae、線蟲Caenorhabditiselegans、果蠅Drosophilamelanogaster、擬南芥Arabidopsisthaliana、小鼠Musmusculus、人Homosapien）的代表性和基因組構造特性模式生物的必要條件：易培養(yǎng)、繁殖、觀測；成年個體小；世代周期短，後裔多；在進化上有一定代表性；模式生物基因組一般復雜性比較高，反復序列比例低；建立了成熟的培養(yǎng)措施；建立了多種遺傳突變種系；遺傳背景積累的資料豐富。大腸桿菌：原核生物。22分鐘一代。基因組全長465381bp，含4283個構造基因或ORF，其中62%都可基于比較基因組學的分析而確定其功能；酵母：酵母是最簡樸的真核生物，是研究真核生物基因的構造、功能、體現(xiàn)和調(diào)控的模型。16條染色體，基因組全長12068kb，5885個ORF，ORF平均長度1450bp，即基因密度平均為2Kb，蛋白質(zhì)編碼序列占基因組的72%,有將近31％編碼蛋白質(zhì)的酵母基因或者開放閱讀框與哺乳動物編碼蛋白質(zhì)的基因有高度的同源性；線蟲:線蟲是細胞分化和組織發(fā)育研究的最重要的材料。它是唯一一種身體中的所有細胞能被逐一盤點并各歸其類的生物。G≈80Mb，n=6，基因密度為7~8Kb，存在重疊基因和多順反子轉錄現(xiàn)象;果蠅：從經(jīng)典遺傳學的連鎖律確實立到細胞遺傳學中多線染色體的發(fā)現(xiàn)，以至分子遺傳學最重要的發(fā)現(xiàn)之一，同源盒（HOX）基因的發(fā)現(xiàn)，都離不開對果蠅的研究。G=165Mb,n=4；擬南芥：擬南芥的全基因組測序工作于年完畢，成為植物界第一種被完整測序的物種。與其他某些高等植物相比，擬南芥的基因組很小，5條染色體總共含約1.15億個堿基對，盡管基因組小，擬南芥的2.5萬多基因在功能類別上卻和其他開花植物大體相似，因而，擬南芥作為試驗材料有助于其基因的克隆和飽和突變體庫的建立。此外，擬南芥生命周期很短，從播種到種子收獲僅需要6~8周；擬南芥?zhèn)€體較小，適合于試驗室內(nèi)種植；小鼠：由于小鼠繁殖快，喂養(yǎng)管理費用低，因此成為生物醫(yī)學研究中廣泛使用的模式生物，也是當今世界上研究最詳盡的哺乳類試驗動物。目前全世界每天約有2500萬只小鼠被用于生物醫(yī)學研究，以小鼠為對象的研究已經(jīng)獲得了17項諾貝爾獎。G=3.3Gb,復雜性和人相似；人：人類基因組由23對染色體構成，其中包括22對體染色體、1條X染色體和1條Y染色體，人類基因組具有約30億個DNA堿基對。但人類基因組中的基因數(shù)量比原先預期的少得多，其中的外顯子，也就是可以制造蛋白質(zhì)的編碼序列，只占總長度的1.5%。什么是基因組印跡：基因組印跡又稱基因組印記、親代印跡或配子印跡，是指在配子或合子發(fā)生期間，來自親本的等位基因或染色體在發(fā)育過程中產(chǎn)生專一性的加工修飾，導致後裔體細胞中兩個親本來源的等位基因有不一樣的體現(xiàn)活性的現(xiàn)象。甲基化對基因體現(xiàn)的影響：DNA的甲基化一般會克制基因的體現(xiàn)、克制轉座因子的活性。組蛋白乙酰化對基因體現(xiàn)的影響：乙酰化也許通過對組蛋白電荷以及互相作用蛋白的影響，來調(diào)整基因轉錄，組蛋白乙酰化有助于基因體現(xiàn)。人基因組中大體有多少基因（0~25000）為何人類基因組的基因數(shù)量并不多，卻可以完畢非常復雜的生物學功能（可變剪接、基因體現(xiàn)調(diào)控的多層次）：1、可變剪接：有些基因的一種mRNA前體通過不一樣的剪接方式(選擇不一樣的剪接位點)產(chǎn)生不一樣的mRNA剪接異構體，這一過程稱為可變剪接。可變剪接是調(diào)整基因體現(xiàn)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機制,是導致人類基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因。2、基因體現(xiàn)調(diào)控的多層次：分為轉錄水平上的基因體現(xiàn)調(diào)控和翻譯水平上的基因體現(xiàn)調(diào)控。1.轉錄水平的調(diào)控：包括DNA轉錄成RNA時的與否轉錄及轉錄頻率的調(diào)控，DNA的序列決定了DNA的空間構型，DNA的空間構型決定了轉錄因子與否可以順利的結合到DNA的調(diào)控序列上，例如結合到TATA等序列上；2.翻譯水平的調(diào)控：翻譯水平的調(diào)控又可以提成翻譯前的調(diào)控和翻譯後的調(diào)控。a、翻譯前的調(diào)控重要是RNA編輯修飾。生物體對RNA進行編輯剪切，例如核糖體RNA剪切後變成28S/16S/5S.尚有某些甲基化修飾等等。b、翻譯後調(diào)控重要是蛋白的修飾，蛋白修飾後可以成為有功能的蛋白或者有隱藏功能的蛋白。搜尋基因怎樣預測基因組序列中的基因同源性比對、ORF搜尋（長度篩選、內(nèi)含子剪接特性、密碼子偏愛）、基因構造信號輔助（CpG島、啟動子）、EST拼接不指導預測基因及其可變剪接形式等。基因功能預測重要采用軟件分析措施，根據(jù)已經(jīng)有的基因功能推測基因組中具有相似構造的基因的功能。計算機預測基因功能的重要根據(jù)仍然是同源性比較，同源基因都擁有一種共同的祖先基因，在漫長的進化歲月中，他們?nèi)匀槐３衷械纳飳W功能。同源基因一般不會有完全一致的核苷酸序列，由于這兩個基因，在出現(xiàn)後獨立的發(fā)生隨機突變，但他們有相似的序列構成，大部分未突變的核苷酸位置是相似的，當一種新的基因序列被確認後，根據(jù)同源性可從數(shù)據(jù)庫中查找已知序列的同源基因。根據(jù)進化的有關性可從已知的同源基因推測新基因的功能。ORF及其含義：ORF是生物個體的基因組中，也許是蛋白質(zhì)編碼序列的部分。基因中的ORF包括并位于開始編碼與終止編碼之間。由于一段DNA或RNA序列有多種不一樣讀取方式，因此也許同步存在許多不一樣的開放閱讀框架。Homology（同源性）：指來源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的序列之間的關聯(lián)性。Similarity（相似性）：指同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例。Identity（一致性）：指同源DNA序列的同一堿基位置上相似的堿基組員，或者蛋白質(zhì)中同一氨基酸位置相似的氨基酸組員的比例，可用比例表達。什么是EST：ESTs是cDNA分子所測得部分序列的短段DNA(一般300~500bp)。從cDNA文庫所得到的許多體現(xiàn)序列標簽集合構成體現(xiàn)序列標簽數(shù)據(jù)庫，代表在一定的發(fā)育時期或特定的環(huán)境條件下，特定的組織細胞基因體現(xiàn)的序列。EST研究基因體現(xiàn)譜的優(yōu)勢和局限性：局限性：1.ESTisshortandnotthewholeexpressionproduct;2.Lowabundancegenesaredifficulttocheck;3.Single-runsequencinghashigherrorfrequencyof2~5%；4.ContaminatedsequencesincludingvectorDNA,mitochodrialexpressionproductsand5.genomeDNAetc.6.Somechimeraclone.Highredundancyleadstotremendousamountofcomputation優(yōu)勢：1.mRNA可直接反轉錄為cDNA，并很輕易構建cDNA文庫。2.只需一次cDNA測序即可獲取EST的序列，500bp的cDNA序列足以鑒定所代表的基因。3.不必反復檢測EST序列的精確性。怎樣從EST獲得全長（RACE）：aPCR-basedtechniqueformappingtheendofamRNAmolecule.RACE是重要通過RT-PCR技術由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5'和3'端，包括單邊PCR和錨定PCR。基因克隆的基本方略：基因克隆技術包括把來自不一樣生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然後送入受體生物中去體現(xiàn)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉移和重新組合。怎樣定位于染色體上的基因？答：Cytogeneticabnormality；Genomescanning(全基因組掃描):Lookingforthemarkersclosesttothediseasegene.(采用DNA分子多態(tài)性標識，以較大間距在大量樣本、家系或同胞對中進行全基因組掃描，通過連鎖分析或關聯(lián)分析將有關基因定位到某些染色體區(qū)域；在這些區(qū)域再選擇高密度的遺傳標識，做精細分析，深入縮小定位區(qū)域；查找該定位區(qū)域內(nèi)的所有基因，從中選擇也許的候選基因進行基因變異檢測。)怎樣對疾病基因進行定位克隆（流程）：1）發(fā)現(xiàn)連鎖或關聯(lián)：byLinkageanalysisorassociationstudy.2）精細定位：Findcosegregatingmarkerinsmallregion（105~106bp）.3）對候選區(qū)域內(nèi)的基因序列進行分析，尋找目的基因。通過數(shù)據(jù)庫搜索和基因預測可以提高在基因座上尋找目的基因的效率。4）獲得區(qū)域內(nèi)的體現(xiàn)序列。5）對候選基因設計試驗干擾其體現(xiàn)來驗證究竟哪個基因與疾病有關。連鎖分析：運用家系遺傳信息中的重組率計算兩位點之間的染色體圖距。根據(jù)疾病有無合適的遺傳模式，可分別進行參數(shù)分析和非參數(shù)分析。參數(shù)分析：需要設定遺傳模式，基因頻率和外顯率，計算優(yōu)勢對數(shù)分數(shù)（LOD）值。可高效發(fā)現(xiàn)疾病基因的連鎖標識，但假如模型設定錯誤，也許導致結論錯誤。重要合用于已知遺傳模式的單基因遺傳病基因定位。非參數(shù)分析：對患病家系中的成對患病組員，比較其基因組同一座位上獲得來自共同祖先的同一等位基因的頻率，假如與孟德爾獨立分離預期頻率差異明顯，則認為該等位標識與致病基因之間存在連鎖不平衡。可合用于多基因疾病，可發(fā)現(xiàn)多種連鎖不平衡位點，但不能得到其與疾病基因之間的圖距。LOD值得含義和聯(lián)鎖關系的取值判斷：Lod值是在一定重組率下兩個位點相連鎖的似然性與兩個位點不連鎖的似然性比值的對數(shù)值。關聯(lián)分析：基于觀測標識位點等位基因和疾病基因之間的與否存在連鎖不平衡（linkagedisequilibrium,LD）的分析法。標識位點與致病基因之間越近、突變率越低、雜合率越高，用標識檢出致病基因位點的幾率就越高。群體關聯(lián)分析（病例對照研究）：在無親緣關系的病例和對照樣本中隨機選用兩組，比較一種座位的某等位基因在患病組和對照組中出現(xiàn)的頻率，如前者明顯不小于後者，則認定LD。連鎖不平衡的含義和原因：連鎖不平衡是指在研究樣本群中，兩個或者多種位點的非隨機關聯(lián)性，這些位點既也許在同一條染色體上，也可以在不一樣的染色體上。連鎖不平衡是等位基因或者遺傳標識在一種人群眾體現(xiàn)出高于或低于由等位基因的隨機頻率而預測的單模標本的頻率。連鎖不平衡的程度取決于多方面的原因，包括遺傳連鎖、選擇、重組的概率、遺傳漂變、選型交配以及群體構造。單倍體/單體型（Haplotype）：單體型（Haplotype）是指在統(tǒng)一染色體上進行共同遺傳的多種基因座上等位基因或SNP的組合。什么是基因芯片：基因芯片又稱DNA芯片、生物芯片，是固相載體上的寡核苷酸陣列。基因芯片的測序原理是雜交測序措施，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的措施，在一塊基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標識的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。什么是cDNA微陣列（cDNAmicroarray）：cDNA微陣列是通過平面微細加工技術在固相表面構建的微流體分析單元和系統(tǒng)，它不僅可高敏感地定量、定性檢測基因體現(xiàn)水平，且其最大長處是徹底變化了老式的對單個或幾種基因體現(xiàn)水平的研究，而可同步研究同一組織或不一樣組織中成百上仟個基因的體現(xiàn)實狀況況。怎樣運用cDNA微陣列研究基因體現(xiàn)差異：只要事先除去高度及中等反復序列，任何DNA都可以被用于Microarray。若把某畢生物體內(nèi)所有已知基因（原位合成或從文庫中提取）用機械手點樣（極微量nanoliters）到玻片或其他載體上，照射UVlight使之固定，再用不一樣發(fā)育階段的cDNA作探針與之雜交，就能理解基因在不一樣生長發(fā)育階段的體現(xiàn)差異。基因功能研究Homology、OrthologyandParalogy答：Homology（同源性）：Homologousgenesareonesthatshareacommonevolutionaryancestor,revealedbysequencesimilaritiesbetweenthegenes.Orthology（直系同源性）：Orthologousgenesarethosehomologsthatarepresentindifferentorganismsandwhosecommonancestorpredatesthesplitbetweenthespecies.Paralogy（旁系同源性）：Paralogousgenesarepresentinthesameorganism,oftenmembersofarecognizedmultigenefamily,theircommonancestorpossiblyorpossiblynotpredatingthespeciesinwhichthegenesarenowfound.基于同源重組的基因失活——基因敲除：條件性基因敲除的原理答：對于重要功能基因進行完全基因敲除會導致胚胎死亡，影響基因功能研究。因此常用Cre/loxP和FLP/FRT系統(tǒng)進行組織特異性敲除。根據(jù)試驗需要，設計在不一樣發(fā)育時期、不一樣的空間任意敲除任何一種靶基因，而在不滿足條件時靶基因功能正常。轉錄後基因沉默方式——RNA干擾（siRNA）答：RNAi的定義：RNAinterference(RNAi)isahighlyevolutionallyconservedprocessofpost-transcriptionalgenesilencing(PTGS)bywhichdoublestrandedRNA(dsRNA),whenintroducedintoacell,causessequence-specificdegradationofhomogolousmRNAsequences.是指在生物體細胞內(nèi)，dsRNA引起同源mRNA的特異性降解，因而克制對應基因體現(xiàn)的過程。一種轉錄後水平的基因沉默生物體內(nèi)普遍存在的機制，克制外源性進入機體內(nèi)的有害RNA。RNA干擾（siRNA）：RNA干擾是一種雙鏈RNA分子