B40DB1302唐山市質量技術監督局發布DB1302/T397—2014本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由唐山市質量技術監督局提出。本標準由唐山市農牧局歸口。本標準起草單位：唐山市畜牧水產品質量監測中心。本標準起草人：張建民、張鑫、李愛軍、蒙君麗、張雅會、龐學良、周鑫、肖琎、張鶴鵬、趙福國。1DB1302/T397—2014動物產品中動物源性成分檢測方法實時熒光PCR法本標準規定了動物產品中動物（豬、牛、羊、兔、馬、驢、雞、鴨、鵝、狗、貓、鼠、貉）源性成分檢測實時熒光PCR法。本標準適用于動物產品中動物（豬、牛、羊、兔、馬、驢、雞、鴨、鵝、狗、貓、鼠、貉）源性成分定性檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義、縮略語下列術語和定義、縮略語適用于本文件。3.1術語和定義3.1.1Ct值每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。3.1.2TaqMan探針寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’末端，淬滅劑連接在探針的3’末端。3.1.3豬源性成分豬種屬特異性DNA片段。3.1.4牛源性成分牛種屬特異性DNA片段。3.1.5羊源性成分羊種屬特異性DNA片段。3.1.6兔源性成分兔種屬特異性DNA片段。3.1.7馬源性成分馬種屬特異性DNA片段。3.1.8驢源性成分驢種屬特異性DNA片段。3.1.9雞源性成分雞種屬特異性DNA片段。3.1.10鴨源性成分鴨種屬特異性DNA片段。3.1.11鵝源性成分鵝種屬特異性DNA片段。2DB1302/T397—20143.1.12狗源性成分狗種屬特異性DNA片段。3.1.13貓源性成分貓種屬特異性DNA片段。3.1.14鼠源性成分鼠種屬特異性DNA片段。3.1.15貉源性成分貉種屬特異性DNA片段。3.2縮略語DNA：脫氧核糖核甘酸PCR：聚合酶鏈式反應4原理利用TaqMan探針實時熒光PCR技術，根據不同物種的特異性基因序列對不同動物源性成分進行鑒定。利用裂解液裂解細胞釋放DNA，再結合DNA制備膜技術提取DNA。以提取的DNA為模板，通過特異性引物和熒光物質探針進行動物源性成分實時熒光PCR擴增，根據PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的強弱判定，實現對動物產品中動物源性成分的定性分析。5材料與試劑5.1設備和材料5.1.1實時熒光PCR檢測系統5.1.2高速臺式冷凍離心機（最高轉速12000r/min以上）5.1.3剪刀、鑷子（經180℃±2℃,2h高溫滅菌）5.1.4微量可調移液器及配套吸頭（10μL、200μL、1000μL）5.1.5實時熒光PCR反應管5.1.6離心管（1.5mL、2.0mL）5.1.7紫外燈5.1.8水浴鍋5.1.9恒溫干燥箱5.1.10超純水機5.1.11分析天平：感量為0.00001g5.2試劑除特別說明以外試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。5.2.1無水乙醇（C2H6O）：優級純5.2.2基因組DNA提取試劑盒本試劑盒分試劑PartⅠ和PartⅡ兩部分。詳見表1，表2。3DB1302/T397—2014核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）表2PartⅡ組成5.2.3動物源性成分試劑盒豬、牛、羊、兔、馬、驢、雞、鴨、鵝、狗、貓、鼠、貉源性成分實時熒光PCR試劑盒，-20℃保存。6材料與試劑6.1樣品模板DNA的制備取2mg～25mg動物產品，至于2mL離心管中，用剪刀盡可能剪成碎塊，加入180μL的緩沖液GL、20μL的蛋白酶K和10μL核糖核酸酶A，于56℃水浴至組織完全裂解，水浴過程中將樣品取出振蕩2～3次。向裂解液中加入200μL緩沖液GB和200μL無水乙醇，充分吸打混勻。將離心柱安置于收集管上，將上述制備溶液移至離心柱中，12000r/min離心2min，棄去濾液。將500μL緩沖液WA加入至離心柱中，12000r/min離心1min，棄去濾液。沿離心柱管壁四周加入700μL的緩沖液WB，12000r/min離心1min，棄去濾液。再沿離心柱管壁四周加入700μL的緩沖液WB，12000r/min離心1min，棄去濾液。將離心柱安置于收集管，12000r/min離心2min。將離心柱安置于1.5mL離心管中上，在離心柱膜中央處加入100μL65℃的洗脫緩沖液，室溫靜置5min，12000r/min離心2min洗脫DNA。以上操作均在樣品配置區進行。6.2動物源性成分檢測6.2.1擴增試劑準備動物源性成分檢測試劑盒取出，4℃下融化。實時熒光PCR反應體系見表3。向每個實時熒光PCR反應管中各分裝18μL反應混合液，以上操作均在擴增區進行。進行樣品檢測時，應同時進行空白對照、陰性對照和陽性對照試驗。表3實時熒光PCR反應體系(20μL體系)4.02.02.04DB1302/T397—2014注:陽性對照用相應的組織DNA作為模板,陰性對照用不含相應成分的樣品作為模板,空白對照用等體積ddHO作為模6.2.2加樣在各設定的PCR反應管中分別加入制備好的2μL樣品DNA溶液,蓋緊蓋子,離心10s。以上操作均在PCR反應配置區進行。6.2.3實時熒光PCR檢測將6.2.2中離心后的實時熒光PCR反應管放入實時熒光PCR檢測系統內，記錄樣品擺放順序。循環條件設置：50℃保持2min；以1.6℃/s速度上升到95℃保持10min；保持在95℃下15s，以1.6℃/s速度下降到60℃保持45s，循環40次，在60℃收集熒光。檢測結束后，根據擴增曲線和Ct值判定結果。以上操作均在擴增產物分析區進行。7結果判定7.1結果分析條件設定直接讀取檢測結果。閾值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整。7.2結果判定與表述7.2.1結果判定空白對照：無擴增曲線出現，或Ct值＞40。陰性對照：無擴增曲線出現，或Ct值＞40。陽性對照：有典型的擴增曲線出現，Ct值≤35。7.2.2結果表述a）樣品：有典型的擴增曲線出現，Ct值≤35，結果陳述為“檢出豬源性成分”、“檢出牛源性成分”、“檢出羊源性成分”、“檢出兔源性成分”、“檢出馬源性成分”、“檢出驢源性成分”、“檢出雞源性成分”、“檢出鴨源性成分”、“檢出鵝源性成分”、“檢出狗源性成分”、“檢出貓源性成分”、“檢出鼠源性成分”、“檢出貉源性成分”。b）樣品：無擴增曲線出現，或Ct值＞40，結果陳述為“未檢出豬源性成分”、“未檢出牛源性成“未檢出雞源性成分”、“未檢出鴨源性成分”、“未檢出鵝源性成分”、“未檢出狗源性成分”、“未檢出貓源性成分”、“未檢出鼠源性成分”、“未檢出貉源性成分”。c）若樣品有擴增曲線出現，35＜Ct值＜40