第三章植物愈傷組織的誘導與分化培養

1第一節、植物愈傷組織誘導與繼代培養第二節、愈傷組織分化與植株再生第三節、試管苗的移栽與護理本章主要內容第三章2本章教學目的與要求掌握愈傷組織、外植體、脫分化、再分化、懸浮培養、器官發生、體細胞胚胎發生的概念掌握愈傷組織形成的三個時期的特點了解胚性愈傷與非胚性愈傷識別的區別掌握植株再生的兩種方式的區別掌握體細胞胚與合子胚、生殖細胞胚的區別第三章3第一節愈傷組織的誘導與繼代培養一、愈傷組織的誘導二、繼代培養三、懸浮培養第三章4幾個重要的概念植物細胞的全能性：植物的每個細胞都具有該植物的全部遺傳信息和發育成完整植株的能力。全能性實現的兩個必須滿足的條件：脫離母體組織要給予植物細胞一定的刺激第一節愈傷組織的誘導和繼代培養5外植體（explant):植物組織培養中用來進行無菌培養的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質體等根據外植體的不同，組織培養可分為植株培養、胚胎培養、器官培養(如植物的根、莖、葉、花藥、子房、胚珠、胚等)、組織培養（含愈傷組織）、原生體培養等第一節愈傷組織的誘導和繼代培養6胚乳原生質體芽胚軸胚種子果實花器葉莖根組織子葉子房苞片胚珠花藥花梗分生組織成熟組織花托葉柄幼苗花粉7脫分化（dedifferentiation）：使已分化的體細胞，在人工誘導的條件下回復到未分化的原始狀態并具有細胞全能性表達潛力的過程再分化（redifferentiation）：處于脫分化狀態的愈傷組織，再度分化成其他類型的細胞、組織、器官，甚至最終再生成完整植株的過程第一節愈傷組織的誘導和繼代培養8愈傷組織〔callus〕:

是指將植物上的某個部分切下，形成外植體，接種到適宜的培養基上培養，其外植體組織的增生細胞產生的一團不定形的疏松排列的薄壁組織植物愈傷組織誘導(callusinducing)：使那些已分化的體細胞包括離體的器官、組織和細胞在人工培養基上，經多次細胞分裂而失去原來的分化狀態，形成無結構的愈傷組織或細胞團的過程第一節愈傷組織的誘導和繼代培養一、愈傷組織的誘導9 從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個時期：誘導期分裂期形成期1、愈傷組織誘導的3個時期：第一節愈傷組織的誘導和繼代培養10Stage1.Induction（誘導期）:

第一節愈傷組織的誘導和繼代培養細胞準備進行分裂的時期，是愈傷組織形成起點機械損傷就是引起誘導組織細胞分裂的一種刺激因素外源激素也是一種能誘導細胞開始分裂的誘導劑11誘導期細胞內發生的變化氣體交換增加，如氧氣的吸收增加RNA含量增加（增加到300%）蛋白質量增加（每個細胞的總增加量為200%）酶活性增強第一節愈傷組織的誘導和繼代培養12Stage2.Celldivision（分裂期）外植體細胞經誘導脫分化，不斷分裂、增生子細胞的過程第一節愈傷組織的誘導和繼代培養13細胞的數目迅速增加,每個細胞平均鮮重下降細胞體積小，內無液泡細胞的核和核仁增大到最大細胞中RNA含量減少，而DNA含量保持不變隨著細胞不斷分裂和生長，細胞總干重、蛋白質和核酸量大大增加，新細胞壁合成極快分裂期細胞的主要表現:第一節愈傷組織的誘導和繼代培養14細胞分裂快，結構疏松，缺少有組織的結構，維持其不分化的狀態，顏色淺而透明。1mg/l2,4-D10mg/l2,4-D分裂期愈傷組織的共同特征：第一節愈傷組織的誘導和繼代培養15Stage3.Differentiation（形成期）指外植體的細胞經過誘導、分裂形成了具有無序結構的愈傷組織時期第一節愈傷組織的誘導和繼代培養16細胞大小不再發生變化細胞分裂部位和方向發生改變，以平周分裂為主出現瘤狀或片狀的分生組織結構，形成“泡狀”增殖狀態出現了各種類型的細胞：如管胞、纖維細胞、薄壁細胞、分生細胞、色素細胞等生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉化為黃色或褐色形成期細胞特點：第一節愈傷組織的誘導和繼代培養172、愈傷組織的形態和細胞學特征根據組織學觀察、外觀特征及其再生性、再生方式等，愈傷組織分成兩大類：胚性愈傷組織（embryoniccallus，EC）和非胚性愈傷組織（non-embryoniccallus，NEC）。愈傷組織在長期的培養中能夠形成分生組織區、管胞和色素細胞，或者形成體細胞胚，這種能夠形成體細胞胚的愈傷組織叫做胚性愈傷組織(embryogeniccallus)

第一節愈傷組織的誘導和繼代培養18非胚性愈傷組織：不同材料和誘導條件下表現不同，顏色有白色、綠色、黃綠色，質地疏松，水漬狀，增殖快；有的成硬塊，增殖慢。胚性愈傷組織：質地較堅實，顏色有乳白色、淡黃綠色或黃色，米粒狀、表面光滑、疏松結構的組織第一節愈傷組織的誘導和繼代培養HIA19第一節愈傷組織的誘導和繼代培養胚性愈傷組織由大小一致的球狀或近球狀細胞構成，細胞較小，細胞核大、原生質濃厚，無液泡，常富含淀粉粒，分裂活性強。非胚性愈傷組織細胞形狀不規則，不均勻，有長柱形、橢圓形等，細胞較大，細胞核小，有大液泡，含少量原生質。細胞學特征：201、繼代培養：愈傷組織培養一段時間后必須轉移到新鮮培養基上以保持培養物的繼續正常生長，更換一次培養基稱一次繼代培養(subculture)。為什么要繼代培養？補充養分避免毒害增殖、分化的需要二、愈傷組織的繼代培養第一節愈傷組織的誘導和繼代培養212、繼代頻率:

取決于愈傷組織的生長速度。一般情況下，在愈傷組織生長到直徑2－3cm時才將其與外植體分離，4－6周繼代一次。3、方法:

從單細胞產生的愈傷組織，同樣可以采用分割愈傷組織塊轉移到新鮮培養基上的方法進行反復繼代培養。第一節愈傷組織的誘導和繼代培養I22懸浮培養(suspensionculture):把游離的植物細胞或小塊生長旺盛的愈傷組織放入液體培養基中，進行振蕩培養，從而使愈傷組織塊變成良好分散性的細胞和小的細胞聚集體。第一節愈傷組織的誘導和繼代培養三、懸浮培養231、懸浮培養的用途(1)提供相對一致的細胞群體

（供生化、胚胎發生、胚的同步化研究等)(2)原生質體的良好細胞來源(3)突變體篩選(4)次生代謝物質的生產第一節愈傷組織的誘導和繼代培養24繼代，過30目篩繼代，過50目篩第一節愈傷組織的誘導和繼代培養2、懸浮培養體系的建立接種轉速120-150rpm2g/50ml253、成批培養(batchculture)指在除了氣體和揮發性代謝產物可以同外界空氣交換以外的密閉容器中，進行分散細胞的培養。成批培養的繼代方法：用吸量管或移液器吸取一定量的含有懸浮細胞的液體，然后轉接到含有新鮮液體培養基的容器中進行下一批的懸浮細胞培養。第一節愈傷組織的誘導和繼代培養26繼代第一節愈傷組織的誘導和繼代培養274、細胞增長S型曲線第一節愈傷組織的誘導和繼代培養培養時間培養細胞數目123延遲期1指數生長期2靜止期3285、連續培養(serialculture)連續培養是指在培養過程中，以不斷抽取懸浮培養物并注入等量新鮮培養基，使培養物在培養液中不斷得到營養物質補充和保持其恒定體積的培養。產生新細胞的速度正好補嘗了被排出的細胞，從而使細胞長久地保持在對數生長期中細胞的密度、生長速度、化學成份和細胞的代謝活性都維持恒定第一節愈傷組織的誘導和繼代培養29第二節愈傷組織分化與植株再生第三章細胞分化（differentiation），是指導致細胞形成不同結構，引起功能改變或潛在發育方式改變的過程一個細胞在不同的發育階段上可以有不同的形態和機能，這是在時間上的分化同一種細胞后代，由于所處的環境（如部位）不同而可以有相異的形態和機能，這是在空間上的分化

30一、器官發生與植株再生第二節愈傷組織分化與植株再生器官發生：是指培養條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。31第一階段是外植體經過誘導形成愈傷組織第二階段是“生長中心”形成。這一階段若干部位成叢出現類似形成層的細胞群，稱之為“生長中心”，是愈傷組織中形成器官的部位第三階段是器官原基及器官形成(如莖尖、根尖分生組織培養)第二節愈傷組織分化與植株再生1、器官分化過程：三個生長階段322、器官發生再生植株：四種方式（1）愈傷組織僅有根或芽器官的分別形成，即無根的芽或無芽的根（2）先長芽，后長根（3）先長根，再從根的基部長芽。這種情況較難誘導芽的形成，尤其對于單子葉植物（4）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結合起來形成一株植株第二節愈傷組織分化與植株再生33愈傷組織芽分化小麥的形態發生試管苗第二節愈傷組織分化與植株再生34棉花的器官發生及植株再生35外植體愈傷組織芽根再生植株脫分化再分化高生長素(2,4-D)高(生長素/細胞分裂素)低(生長素/細胞分裂素)第二節愈傷組織分化與植株再生3、器官發生的模式圖36二、體細胞胚胎發生與植株再生體細胞胚胎發生：在離體培養條件下，植物體細胞形成胚性細胞，然后經過一系列形態學及生物化學的變化形成類似合子胚結構的過程第二節愈傷組織分化與植株再生371、由外植體經胚狀體形成完整植株的過程：外植體脫分化愈傷組織體細胞胚再生植株第二節愈傷組織分化與植株再生38胡蘿卜體細胞胚胎發生(引自Zimmerman,1993)392、植物體細胞胚的產生方式及結構特征胚狀體起源于外植體表面已分化的細胞形成層細胞或薄壁細胞轉變成迅速分裂的細胞，形成擬分生組織的細胞團和小塊愈傷組織，進而產生體細胞胚從愈傷組織的表面產生胚狀體在懸浮培養時,游離細胞產生細胞團,這些細胞團長大變成胚性細胞復合體,進而產生體細胞胚單個游離細胞發育成體細胞胚第二節愈傷組織分化與植株再生40413、體細胞胚1)、不同于合子胚2)、不同于生殖細胞胚3)、不同于器官發生方式形成的幼苗第二節愈傷組織分化與植株再生42胚狀體與合子胚的比較:合子胚體細胞胚來源受精卵體細胞胚柄有，明顯即使有也不明顯形態合子胚的子葉是相當規范的，體積相對較小子葉常不規范，常有兩個以上的子葉，體積較大變異率低高發育在胚胎發育完全進入子葉期后，經過一系列的物質積累和脫水就進入休眠沒有休眠而體細胞胚則直接形成植株第二節愈傷組織分化與植株再生433、體細胞胚1)、不同于合子胚2)、不同于生殖細胞胚3)、不同于器官發生方式形成的幼苗第二節愈傷組織分化與植株再生44體細胞胚：由普通植物體（孢子體）的各種器官等雙倍體的體細胞產生的胚狀體生殖細胞胚：來源于大小孢子細胞都有兩個特點：兩極性，即在其發生的最早階段就具有根端（胚根）和莖端（胚芽）與母體植物或外植體的維管束系統無直接連系區別于生殖細胞胚：453、體細胞胚1)、不同于合子胚2)、不同于生殖細胞胚3)、不同于器官發生方式形成的幼苗第二節愈傷組織分化與植株再生46兩種形態發生的結構特點胚狀體途徑形成的植株細胞內出現方向相反的兩極分化，具有根端和芽端兩個分生中心

不定胚維管組織與外植體維管組織不相連具有典型的胚胎形態發生過程形成的幼苗具有子葉胚狀體發育的苗，根和芽齊全器官途徑形成的植株單向極性，單個分生中心直接分化為器官不定芽和不定根與愈傷組織的維管相連無胚胎形態不定芽的苗無子葉先長芽后長根，或先長根后長芽 47三、影響胚狀體發生和發育的內部因素

1、植株基因型的影響2、外植體的年齡(生理狀態)與來源少數植物如胡蘿卜，幾乎所有的器官都可誘導產生胚狀體同一植物不同部位外植體，其細胞的分化能力有相當大的差別植物胚與幼齡組織器官比老化組織、器官更容易去分化第二節愈傷組織分化與植株再生48第二節愈傷組織分化與植株再生493、培養時間和細胞倍性變化的影響一般由初分離或誘導的或僅經過短時期培養的愈傷組織，最易產生胚狀體隨著培養時間的延長，形成胚狀體的能力下降以至完全消失培養細胞倍性的變化可能對胚狀體的形成有一定影響第二節愈傷組織分化與植株再生50四、影響胚狀體發生和發育的外部條件1、植物生長調節劑a.生長素類物質外植體細胞的脫分化、愈傷組織的誘導、胚性細胞或細胞團的形成，培養基必須含有生長素類物質，主要是2，4-D胚狀體的形成和發育，必須在降低2，4-D濃度或完全去除2，4-D的培養基上才能進行第二節愈傷組織分化與植株再生51b.細胞分裂素類物質不僅沒有誘導的作用(單獨使用不能誘導愈傷),而且對已完成誘導的愈傷組織中胚狀體的發生還有抑制作用。但在除去，胚狀體發生能力還可能部分地恢復。c.其它激素一般ABA、GA抑制胚狀體發育，但有人認為，ABA對柑桔的胚狀體發生有明顯的促進作用第二節愈傷組織分化與植株再生522、無機營養成分含氮化合物

*

NH4+與NO3-的作用不同

*

NH4+/NO3-的比例

*氨基酸、酰胺等有機氮第二節愈傷組織分化與植株再生53NH4NO3對不同品種胚分化的影響第二節愈傷組織分化與植株再生54

KNO3

對胚分化的作用第二節愈傷組織分化與植株再生55氯化鉀(mg/L)質地顏色

胚分化率0疏松顆粒狀淡黃色14.5±3.6500疏松顆粒狀淡黃色28.5±4.5100