1桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的檢測高效液相色譜法本文件描述了采用高效液相色譜測定桑葉中1-脫氧野尻霉素含量的原理、試劑與材料、儀器與設備、檢測方法、結果計算與表示、重復性、精密度和加標回收率。本文件適用于桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。芬甲氧羰酰氯(是一種氨基酸衍生化試劑，主要適用于伯胺和仲胺的衍生化，反應后的構，因此可以采用作為衍生化試劑對進行衍生，利用HPLC對1-脫氧野尻霉素進行定量檢測，檢測波長為254與芬甲氧羰酰氯的反應式見圖1。與笏甲氧羰酰氯的反應式5試劑或材料除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和符合GB/T6682一級的水。2)。硼酸鉀緩沖液5.2溶液配制芬甲氧酰氯乙腈溶液稱取精確至用乙腈溶解并定容至得到乙腈溶液乙腈溶液應現配現用。1-脫氧野尻霉素標準品，純度≥98%。5.41-脫氧野尻霉素標準儲備溶液稱取精確至脫氧野尻霉素標準品置于容量瓶中用鹽酸水溶液溶解并定容至刻度線，混勻。5.51-脫氧野尻霉素標準工作溶液將1-脫氧野尻霉素標準儲備溶液用鹽酸水溶液稀釋制備一系列標準溶液，標準液濃度分別為臨用時配制。有機相濾膜。6儀器與設備6.1分析天平：靈敏度萬分之一克。6.3高效液相色譜儀：包含紫外檢測器或二極管檢測器、色譜工作站。6.4恒溫水浴鍋。7檢測方法稱取桑葉提取物0.100g試樣，精確至0.001g,用0.010mol/L鹽酸水溶液超聲輔助溶解15min,冷卻至室溫后，定容至50mL,得到試樣溶液。7.2衍生化反應取標準品或試樣溶液100μL置于1.5mL的離心管中，依次加入0.4mol/L的硼酸鉀緩沖溶液和衍生化試劑乙腈溶液充分混合在恒溫水3浴下反應然后加入甘氨酸溶液用于中和過量的反應再有機相濾膜微濾，得到衍生后的樣品溶液。樣品溶液避光保存備用。按照制造商操作手冊運行高效液相色譜儀；以下色譜分析條件可供參考，采用其他條件應驗證其適用性。色譜條件如下：色譜柱流動相：乙腈-0.1%乙酸水溶液(32∶68,體積比流速7.4標準曲線繪制按7.3色譜條件檢測，分別吸取不同濃度標準工作溶液并按照7.2進行衍生化反應，吸取衍生后的樣品溶液10μL,進樣于高效液相色譜儀，以色譜峰的峰面積為縱坐標，對應的樣品溶液濃度為橫坐標，進行線性回歸得到標準曲線方程。1-脫氧野尻霉素標準品的HPLC色譜圖參見附錄A。7.5試樣測定按7.3的色譜條件，取7.2步驟中衍生后的樣品溶液進樣，得到試樣溶液的峰面積，根據保留時間和1-脫氧野尻霉素標準品色譜圖定性。從標準曲線上查得試樣溶液中1-脫氧野尻霉素的含量。試樣溶液中1-脫氧野尻霉素的響應值應在標準曲線的線性范圍內，超過線性范圍則應將試樣溶液稀釋后測定或增加提取物的質量重新檢測。8結果計算與表示桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量按式(1)進行計算：式中：X—樣品中1-脫氧野尻霉素的含量，單位為毫克每克(mg/g);c—樣品中1-脫氧野尻霉素的濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);V—最終定容后樣品的體積，單位為毫升(mL);m—試樣的質量，單位為克(g)。計算結果以重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，保留至小數點后兩位有效數字。49重復性在重復條件下獲得的5次獨立測定結果的相對標準偏差小于5%。10精密度取同一試樣，連續進樣5次，按7.3的色譜條件檢測其HPLC圖譜；比較1-脫氧野尻霉素對應色譜峰的峰面積，5次進樣的峰面積的相對標準偏差(RSD)不應超過5%。之間，相對標準偏差應小于5附錄A（資料性）色譜圖示例1-脫氧野尻霉素標準樣品及桑葉提取物的色譜圖示例見圖A.1和圖