DiagnosisofGeneticDisease第17章遺傳病的診斷[教學要求]

1．遺傳病的臨床診斷：病史采集；癥狀和體征；系譜分析。2．細胞遺傳學檢查：染色體檢查，FISH技術；性染色質檢查。3．生化檢查：代謝產物分析、酶和蛋白質分析。4．基因診斷：基因診斷的定義和特點；基因診斷的方法：限制性片段長度多態性分析、Southern印跡雜交、聚合酶鏈反應分析（已知點突變的檢測、未知點突變的檢測、基因缺失的檢測、RCR-RFLP）、DNA測序、DNA芯片、熒光原位雜交等的原理、操作和應用。產前診斷(prenataldiagnosis)

植入前診斷(preimplantationdiagnosis)癥狀前診斷(presymptomaticdiagnosis)現癥病人診斷

(symptomaticdiagnosis)臨床診斷實驗診斷病史采集癥狀和體征遺傳病系譜分析細胞遺傳學檢查生化檢查基因診斷第一節遺傳病的臨床診斷1

癥狀和體征

2

系譜分析

3病史采集一、病史采集家族史：有無同種病史；

婚姻史：婚齡、婚次、配偶健康情況及是否近親結婚；

生育史：生育年齡、生育子女數目及健康狀況，有無流產、死產和早產史。除應了解一般病史外，還應著重采集與遺傳病家族聚集現象有關的以下項目：二、癥狀和體征1.患者現有癥狀、體征，為診斷提供初步線索。如：①智力發育不全伴有特殊腐臭尿液苯丙酮尿癥②智力發育不全伴有白內障，肝硬化半乳糖血癥③智力低下伴有眼距寬、眼裂小、外眼角上斜先天愚型二、癥狀和體征1.患者現有癥狀、體征，為診斷提供初步線索。2.了解患者身體發育、智力增進、性器官及第二性征發育、皮紋等。三、系譜分析

12

1234

1ⅠⅡⅢ記錄遺傳病家族史最好的方法是繪制系譜。系譜分析的意義①有效記錄遺傳病家族史②確定遺傳病遺傳方式③遺傳咨詢中個體患病風險計算④基因定位中連鎖分析系統性、完整性和可靠性不規則顯性、延遲顯性、從性顯性等特殊現象新的基因突變顯性與隱性概念的相對性

注意問題

123

123

12312ⅠⅡⅢⅣ

12345ⅠⅡⅢ

12

1234042452132

12

12341ⅠⅡⅢ同一遺傳病采用的觀察指標不同而得出不同的遺傳方式，如鐮狀細胞貧血和鐮狀細胞癥狀。第二節細胞遺傳學檢查1性染色質檢查

2染色體檢查①不明原因的智力發育不全、生長遲緩者；②先天性畸形（包括兩性內外生殖畸形）；③性征發育異常及生育異常：原發性閉經和女性不孕癥；無精子癥和男性不育癥；有反復多次早期流產史的婦女及其丈夫；④家族史：家族中有染色體異常或先天畸形的個體。⑤有較長時間、較大劑量射線或致畸致突變物質接觸者；⑥惡性腫瘤，尤其是惡性血液病患者。

1.染色體檢查（核型分析）指征一、染色體檢查取材：視檢查對象和目的而有所不同，通常主要取自外周血、皮膚、骨髓、胸水、腹水、絨毛、羊水中胎兒脫落細胞和臍血等各種組織。體外細胞培養制片：秋水仙素處理，收獲細胞、低滲、固定、滴片等過程，制備染色體標本。顯帶核型分析一、染色體檢查2.染色體檢查（核型分析）步驟二、性染色質檢查

X染色質和Y染色質適應癥：兩性畸形或性染色體數目異常疾病的診斷，但仍需染色體檢查確認。第三節

生物化學檢查1、代謝產物分析

2、酶和蛋白質分析苯丙酮尿癥,PKUⅠ

酶活性檢查PAH肝臟血液濾片苯丙氨酸

血FeCl3顯色反應--綠色苯丙酮酸尿液第三節

生物化學檢查

材料主要來源于血液和特定的組織、細胞，如肝細胞、皮膚成纖維細胞、腎、腸粘膜細胞等。

產前診斷中常采集絨毛、羊水、臍帶血和皮膚。

新生兒的篩查最常用的標本是血和尿。1、代謝產物分析

2、酶和蛋白質分析

1978年，美國科學院院士美籍華裔科學家YWKan(簡悅威

)和Dozy應用液相DNA分子雜交成功地進行了鐮狀細胞貧血癥的基因診斷，標志著檢驗診斷進入基因診斷時代。第四節

基因診斷(genediagnosis)17第四節

基因診斷(genediagnosis)

基因診斷：利用分子生物學技術，從DNA/RNA水平檢測分析致病基因的存在、變異和表達狀態從而對疾病作出診斷的技術。一、基因診斷定義和特點A、特異性強B、靈敏度高特點C、應用范圍廣D、早期診斷基因診斷的一般流程前提條件：先證者要有明確的臨床診斷醫學遺傳咨詢門診相關臨床科室醫生診斷簽署基因診斷知情同意書

抽取外周血2-3ml

基因檢測咨詢臨床醫生對基因檢測結果的理解找到功能性突變：支持臨床診斷未找到功能性突變：不否定臨床診斷二、基因診斷基本方法1．Southern印跡雜交

2．聚合酶鏈反應分析

3．DNA測序5．熒光原位雜交

4.DNA芯片分子印跡雜交(Southernblotting)的基本方法：DNA標本用限制性內切酶消化→瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段→DNA轉印至硝酸纖維素濾膜→標記探針雜交→顯影→確定探針互補的每條DNA帶的位置，以確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

1．Southern印跡雜交

-+2．聚合酶鏈反應分析

PCR原理示意圖

變性→退火→延伸聚合酶鏈反應（Polymerase

Chain

Reaction，PCR）：體外酶促擴增特定DNA片段的技術。由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增。（1）產物探針檢測

——ASO探針

等位特異性的寡核苷酸(allele-specificoligonucleotide，ASO)探針:當某一致病基因的突變位點的性質以及突變位點兩側的堿基序列都明確的情形下，可以合成ASO探針。ASO探針檢測鐮狀細胞突變基因的示意圖

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

123已知點突變正常探針突變探針123（2）產物構象變化檢測-SSCPDNA單鏈構象多態性(singlestrandconformationpolymorphisms,SSCP)：相同長度的單鏈DNA可因堿基序列不同產生構象差異，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現為遷移率差別。提取DNA→PCR擴增→產物變性→電泳根據單鏈條帶位置的改變判斷該個體是否存在突變。并不是所有的堿基突變都會導致SSCP，因此該方法不能鑒別所有突變。

SSCP電泳檢測示意圖

未知點突變基因缺失時可導致靶DNA模板的缺失，使用特異性引物擴增時得不到相應的擴增產物，因此可以直接檢測缺失。

（3）PCR產物有無檢測正常基因異?；駿1E2E3E4E5E1E2E4E5L1L2L1目的基因引物PCR產物（電泳）L2基因缺失或點突變RFLP連鎖分析法（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）

由于堿基變異可能導致限制酶切點消失或新的酶切位點出現，引起不同個體DNA在用同一限制酶切割時，產生不同長度的DNA片段，稱RFLP。（4）產物酶切檢測-RFLP基因缺失或點突變RFLP的主要步驟:

DNA→酶切→Southern印記雜交分析DNA→PCR→酶切→電泳分析

RFLP主要有以下兩種類型：

點多態性序列多態性

正常人（HbA）和鐮狀細胞貧血患者（HbS）β珠蛋白基因的結構差異

正常人（HbA）和鐮狀細胞細胞貧血患者（HbS）β珠蛋白基因DdeⅠ限制酶切點示意圖β珠蛋白基因DdeⅠ限制酶切片段電泳結果例1:鐮狀細胞貧血

1

2

1

5‘3’16p13.2-pter人類α珠蛋白基因簇例2a地中海貧血缺失基因檢測BamH1BamH114kb10kb18kb

PCR-RFLP檢測基因缺失和插入的示意圖

10kb14kb18kb案例9-2基因診斷分析(P99)

地貧的基因缺失的RFLP基因診斷Ⅰ2正常對照ⅠⅡ12110kb14kb18kbaa/aa

Ⅰ1Ⅱ1aa/a-

aa/--

a-/--

1

2

1

5‘3’16p13.2-pter人類α珠蛋白基因簇例2a地中海貧血缺失基因檢測L1L2BamH1BamH114kb3．DNA測序DNA測序即測定DNA的一級結構中堿基的順序。包含特定位點的PCR產物再作DNA測序，比較正常基因與突變的序列，可檢測出突變的堿基類型和位點。DNA自動測序儀生成的序列DNA自動測序儀采用4種不同顏色的熒光分別標記4種雙脫氧核苷酸，基本實現了測序自動化。

概念：基因芯片技術是DNA雜交探針與半導體工業技術相結合的產物。將各種探針固定于支持物上后與帶有熒光標記的DNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號，進而獲取被測樣品中DNA分子的數量和序列信息。該技術可用于大規模篩查由基因突變引起的疾病。4.DNA芯片檢測原理和步驟：

（1）制作芯片：根據疾病基因中的突變位點區域的核苷酸序列，合成20個核苷酸長的探針，將其固定于芯片上，芯片上可固定成千上萬個探針。（2）從被測對象的細胞中提取DNA，用酶切成較小的片段，對DNA作熒光標記，并熔解成單鏈。（3）將樣品滴加到芯片上并與芯片上的探針雜交，凡是與探針互補的酶切片段會固定于特定位置上，不能互補的片段會被洗脫掉。（4）對芯片上的熒光作掃描和分析。GenescreeningusingaDNAmicroarray.非放射性原位雜交方法用特殊熒光素標記DNA探針，在染色體、細胞和組織切片標本上進行DNA雜交，檢測細胞內DNA或RNA的特定序列存在與否。

6．熒光原位雜交（FISH）

案例19-1

羅xx，女，34歲，曾生育過一個智力低下患兒，現再次妊娠，因懼怕再生同病患兒前來咨詢。其患兒，男，6歲，智力低下，IQ值42。染色體核型分析為46，XY，-14，+t(14q;21q)。檢查患兒父親的核型正常；而母親是平衡易位攜帶者，核型為45，XX,-14,-21,+t(14q;21q)。臍血FISH分析結果如圖。21q探針對臍血間期細胞FISH分析結果

基因異常方法探針、引物或限制酶基因缺失基因組Southern印跡雜交PCR擴增缺失基因的探針引物包括缺失或在缺失部位內點突變RFLP分析ASO雜交PCR產物的多態性分析（RFLP、SSCP）突變導致其切點消失的限制酶正常和異常的ASO探針引物包括突變部位基因已知但異常不明基因內或旁側序列多態性（RFLP、AMP－FLP，SSCP）連鎖分析基因內或旁側序列探針或引物基因未知與疾病連鎖的多態性，如SSCP、AMP－FLP連鎖分析RFLP位點單體型連鎖分析與疾病連鎖的多態位點探針或引物

遺傳疾病的基因診斷方法[教學要求]

1．遺傳病的臨床診斷：病史采集；癥狀和體征；系譜分析。2．細胞遺傳學檢查：染色體檢查，FISH技術；性染色質檢查。3．生化檢查：代謝產物分析、酶和蛋白質分析。4．基因診斷：基因診斷的定義和特點；基因診斷的方法：限制性片段長度多態性分析、Southern印跡雜交、聚合酶鏈反應分析（已知點突變的檢測、未知點突變的檢測、基因缺失的檢測、RCR-RFLP）、DNA測序、DNA芯片、熒光原位雜交等的原理、操作和應用。1．核酸雜交的基本原理是()A．變性與復性B．DNA復制C．轉錄D．翻譯E．RNA剪切2．性染色質檢查可以對下列哪種疾病進行輔助診斷()A．Turner綜合征B．21三體綜合征C．18三體綜合征D．苯丙酮尿癥E．貓叫綜合征3．通過PCR-RFLP分析，某常染色體隱性遺傳病的分子診斷結果如下：父親（正常）200bp/100bp；母親（正常）300bp/400bp；兒子（患者）100bp/400bp；現檢測到第二胎結果是100bp/300bp，現判斷這個胎兒是()A．正常B．攜帶者C．患者D．需性別確定后才能判斷E．現無法判斷4.對孕婦及胎兒損傷最小的產前診斷方法是()A.羊膜穿刺術B.胎兒鏡檢查C.絨毛取樣D.B型超聲掃描E.X線檢查A.孕7~9周B.孕8~12周C.孕16~20周D.孕17~32周E.孕20周以后5.羊膜穿刺的最佳時期是（）6.絨毛取樣的最佳時期是（）7.臍帶穿刺的最佳時期是（）A.核型分析B.性染色質檢查C.ASO探針D.生化檢測E.基因診斷8.Klinfelter綜合征除了做染色體檢查外，還可用來進行輔助診斷的是（