三、Northern

印跡雜交技術

二、Southern印跡雜交技術

一、核酸分子雜交的基本原理本章概要分子雜交技術職業教育醫學生物技術專業教學資源庫四、Western印跡雜交技術

五、生物芯片技術

基本原理核酸探針影響核酸分子雜交的因素0203核酸分子雜交基本原理目錄011.核酸的變性與復性職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（一）基本原理

（1）變性

當有酸、堿、熱及某些變性劑（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等變性因素存在時，DNA分子雙鏈間的氫鍵斷裂，解離成兩條無規則的卷曲狀單鏈DNA，此現象稱為變性（denaturation）。1.核酸的變性與復性職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（一）基本原理

（2）復性

變性DNA在適當條件下緩慢除去變性因素，可使兩條彼此分開的鏈重新配對結合成雙螺旋結構的過程。

退火：熱變性DNA在緩慢冷卻時，可以復性，這種復性稱為退火。

雜交：將來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補形成雜化雙鏈的過程。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（一）基本原理2.核酸分子雜交原理探針對靶序列進行特異性的檢測雜交的方式

案例：李然咳嗽、咳痰半月以上，痰中帶血或咯血，前往市人民醫院就診，醫生懷疑為肺結核，開具檢驗單對其痰液進行檢測，判斷是否感染結合分枝桿菌。請利用核酸分子雜交技術檢測該痰液中是否有結核分枝桿菌感染。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（一）基本原理職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（二）核酸探針(probe)1.定義：指能與特定的靶序列（DNA或RNA）發生特異性互補結合，并帶有可檢測標記的已知序列的核酸片段。2.分類（1）根據標記物不同，核酸探針可分為放射性探針、非放射性探針（2）根據性質及來源不同，核酸探針可分為DNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（二）核酸探針(probe)3.標記物分類（1）放射性標記物：放射性同位素是目前應用最廣的標記物，優點是靈敏度高，缺點是會造成放射性污染和身體傷害。目前核酸探針標記常用的同位素種類有：32P應用最多，放射性強，靈敏度高，缺點是半衰期短35S放射性較低，半衰期長，靈敏度較高，適用于核酸序列分析和原位雜交等實驗。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（二）核酸探針(probe)3.標記物分類（2）非放射性標記物

非放射性標記常用生物素或地高辛（半抗原）、熒光素類、酶類等標記。優點是無放射性污染，較穩定，缺點靈敏性稍低。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（二）核酸探針(probe)4.核酸探針的檢測（1）放射性同位素探針的檢測——放射自顯影利用放射線在X線片上成影作用來檢測雜交信號，稱為放射自顯影。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（二）核酸探針(probe)4.核酸探針的檢測（2）非放射性標記探針的檢測直接檢測法（用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶直接標記探針）—雜交體通過顯色反應直接觀察結果。職業教育醫學生物技術專業教學資源庫（二）核酸探針(probe)4.核酸探針的檢測（2）非放射性標記探針的檢測間接檢測法（用生物素或地高辛標記探針）—雜交體與酶發生偶聯反應后，通過顯色反應再來觀察結果。1.探針的長度：負相關2.探針的濃度：正相關

3.雜交體系離子強度：正相關4.雜交溫度：低于Tm值20~25℃、高濃度鹽