2.2.2動物細胞融合與單克隆抗體“生物導彈”追蹤癌細胞抗體植物體細胞雜交植物細胞融合植物組織培養溫故而知新：植物體細胞雜交技術跨越不同種植物之間生殖隔離的屏障，克服遠緣雜交不親和的障礙，培育出新的作物類型。

有沒有技術讓不同種動物的體細胞雜交，培育出集不同細胞優勢于一身的動物細胞呢？實例：1970年人-鼠細胞融合融合實驗回顧--必修一：細胞膜的結構請同學們快速閱讀課本P48頁回答以下問題

1.什么是動物細胞融合技術（概念）？原理是什么？2.所形成的雜種細胞有什么特點？3.誘導動物細胞融合的方法有哪些？4.動物細胞融合技術的意義和應用有哪些？一、動物細胞融合技術1、概念：指兩個或多個動物細胞結合形成一個細胞的技術。4、結果：形成雜交細胞。即融合后形成的原來兩個或多個細胞遺傳信息的單核細胞。2、原理：細胞膜的流動性3、誘導方式物理法：電融合法化學法：聚乙二醇（PEG)融合法生物法：滅活病毒誘導法（動物細胞融合特有）5.意義：突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能6.應用：用于制造單克隆抗體仙臺病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細胞）保留融合活性（誘導細胞融合）1、什么是病毒的滅活？

滅活是指用物理或化學手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結構。病毒表面的糖蛋白和一些酶與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合。2、滅活病毒誘導細胞融合的原理（二）拓展：3、滅活病毒誘導細胞融合過程：4、動物細胞融合技術全過程:正在融合的淋巴細胞與骨髓瘤細胞5、動物細胞融合實例：動物細胞融合完成的標志？細胞核的融合

意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。

應用：成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。特別是利用雜交瘤技術制造單克隆抗體。

6、細胞融合技術的意義和應用：植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能2025/3/127、動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較【問題2】19世紀30年代，科學家曾在患肺結核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中，觀察到多核細胞。如何解釋這一現象？病人體內的病毒等誘導多個體細胞融合形成了多核細胞。誘導

融合傳統抗體制備方法及缺陷缺陷：產量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。不能無限增殖產生大量抗體動物體內抗原注射漿細胞抗體

B淋巴細胞增殖分化二、單克隆抗體及其應用

１）體內產生的特異性抗體種類多達百萬種以上２）每個B淋巴細胞只分泌一種特異性的抗體1、科學家發現：單克隆抗體如何獲得大量、單一的抗體？體外培養時，一個B淋巴細胞不能無限增殖2、需解決問題：3、遺憾：如何解決這一難題？二、單克隆抗體及其應用一個B淋巴細胞細胞群抗體克隆

二、單克隆抗體及其應用由單個B淋巴細胞經過無性繁殖（克隆），形成基因型相同的細胞群，這一細胞群所產生的化學性質單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。單克隆抗體：單克隆抗體制備過程米爾斯坦科勒由于發明了單克隆抗體的制備技術，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學或醫學獎一種B淋巴細胞（只產生一種特定抗體）能在體外大量增殖的骨髓瘤細胞動物細胞融合雜交瘤細胞動物細胞培養大量的特定抗體既能迅速大量增殖，又能產生專一抗體二、單克隆抗體及其應用用抗原注射小鼠從患骨髓瘤的小鼠體內取骨髓瘤細胞的培養已免疫多種B淋巴細胞骨髓瘤細胞誘導融合多種雜交細胞小鼠的脾臟中獲取2、單克隆抗體的制備過程置于選擇性培養基上培養

2雜交瘤細胞13第一次篩選多種雜交瘤細胞融合的細胞骨髓瘤細胞自身融合B細胞自身融合雜交細胞132未融合的B淋巴細胞未融合的骨髓瘤細胞未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長。克隆化培養抗體檢測第二次篩選(抗原-抗體雜交技術)多種雜交瘤細胞能分泌所需抗體的雜交瘤細胞陽性細胞注射到小鼠體內體外培養分離、提純單克隆抗體體內或體外培養能分泌所需抗體的雜交瘤細胞細胞培養工程師在工作2102

單克隆抗體及其應用

注射特定抗原

從脾臟中獲取B淋巴細胞

骨髓瘤細胞培養骨髓瘤細胞目的是獲得產生特定抗體的B淋巴細胞骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合誘導融合第一次篩選多種雜交細胞選擇培養基培養篩選雜交瘤細胞既能迅速大量增殖又能產生抗體特點雜交瘤細胞克隆化培養和抗體檢測96孔板培養和篩選篩選抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞既能迅速大量增殖又能產生特異性抗體特點第二次篩選2、單克隆抗體的制備過程2、單克隆抗體的制備過程技術手段：動物細胞融合和動物細胞培養原理：細胞融合—細胞膜的流動性；動物細胞培養—細胞增殖（1）第一次篩選的目的__________________________（2）如何篩選____________________________（3）篩選原理____________________________________________________________________________________（4）雜交瘤細胞的特點____________________________篩選獲得雜交瘤細胞用特定的選擇培養基進行篩選在選擇培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長既能迅速大量增殖，又能產生抗體二、單克隆抗體及其應用（5）第二次篩選的目的________________________________________________________（6）如何篩選____________________________________________________________________________________（7）選擇抗體檢測呈___性的雜交瘤細胞，即_______________________（8）抗體檢測原理__________________________________獲得足夠數量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞用96孔板培養，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下，進行克隆化培養和抗體檢測（進行多次篩選）陽分泌的抗體能與特定的抗原結合抗原和抗體能夠特異性結合(分子水平的鑒定）二、單克隆抗體及其應用陽性孔補充資料2：抗體檢測的方法——抗原-抗體雜交法在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的目的和方法是不相同的。將雜交瘤細胞群稀釋，約每孔1個細胞進行培養（克隆化培養）一段時間后，檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結合的培養孔為陽性孔多孔細胞培養板抗體檢測板分泌抗體能跟特定抗原結合的細胞即為所需雜交瘤細胞26體外培養體內或體外培養能分泌所需抗體的雜交瘤細胞注射到小鼠腹腔項目體內培養體外培養優點缺點易于控制培養條件（如無需提供無菌環境等），操作簡單，成本較低規模小，產量少可大規模培養，大量生產需要人為控制培養條件，成本相對較高02

單克隆抗體及其應用2、單克隆抗體的制備過程單克隆抗體優點：特異性強，靈敏度高，可大量制備單克隆抗體的應用資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準確率在90%以上。資料2使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體-藥物偶聯物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成，它的作用機制如下圖所示。單克隆抗體的應用（1）作為診斷試劑——最廣泛的應用優點：血型檢測試劑方法：抗原-抗體雜交法準確、高效、簡易、快速抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體比原來診斷方法提前了10d左右，準確率在90﹪以上。（2）用于運載藥物（3）用于治療疾病如：制成“生物導彈”“生物導彈”＝單克隆抗體＋藥物注意：“生物導彈”——單抗導向，藥物為彈頭優點：位置準確、療效高、副作用小結合同位素的單抗抗體藥物接頭ADC被細胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細胞凋亡1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論

抗體主要發揮靶向運輸作用，即通過特異性結合靶細胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細胞；

藥物發揮治療效應，如殺傷靶細胞，促使靶細胞凋亡2.除了細胞毒素，還有哪些物質理論上可以作為ADC偶聯的藥物？3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應用上各具有什么優勢？①可以用放射性同位素標記單克隆抗體進行靶向放療；②一些作用于細胞信號轉導通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結合進行治療。①單克隆抗體診斷試劑盒：特異性強和靈敏度高，可大量制備；②ADC能夠協同發揮抗體特異性識別的靶向作用和細胞毒素對腫瘤細胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優點一、概念檢測1.下列有關動物細胞融合與植物體細胞雜交比較的敘述，錯誤的是（）A.它們的原理都涉及細胞膜的流動性B.都可以用電融合法或PEG融合法誘導融合C.融合前都需用纖維素酶或果膠酶處理細胞D.前者主要為了獲得細胞產品，后者主要為了獲得雜種植株練習與應用C2.科學家以SARS病毒的核衣殼蛋白為抗原，制備出了單克隆抗體。下列相關敘述正確的是（）A.利用該單克隆抗