1魚類貝類環(huán)境DNA（eDNA）識(shí)別技術(shù)規(guī)范GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格具三胚層、真體腔的軟體動(dòng)物，為底棲動(dòng)物從生物生活環(huán)境中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含動(dòng)植物脫落的細(xì)胞或游離的DNA，可2為高通量測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣點(diǎn)來(lái)源的物種基因序列，對(duì)擴(kuò)增引物5’端增加的序列特異性短片段標(biāo)除非另有說(shuō)明，均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?，試?yàn)用水為新制備的超3——乙酸銨（CH3COONH4——乙酸鈉（CH3COONa·3H2O——脫氧核糖核苷三磷酸：脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥嘌呤三磷酸、脫氧胸苷三磷酸、脫氧胞苷三5.2主要器具——PCR儀：溫控范圍0-100℃,升溫速度6℃/s，配套PCR管200μL；4岸開(kāi)闊水域，并考慮不同植被覆蓋、水文條件和底質(zhì)特征設(shè)置m處采集。采樣人佩戴一次性乳膠手套，將1L的滅菌采樣瓶瓶口向上游來(lái)水方向采集表層水樣。離岸樣點(diǎn)：魚類eDNA樣品在水深<10m處采集表層水樣，水深≥10m處采樣瓶裝滿后應(yīng)密封并做好標(biāo)記，置于車載冰箱4℃冷藏運(yùn)連接真空泵和抽濾器，用鑷子取0.45μm孔徑的混合纖維素酯濾膜置于玻璃取1L滅菌超純水進(jìn)行抽濾，完成后用滅菌鑷子從邊緣夾起濾膜并折疊放入所有水樣應(yīng)于采集當(dāng)天完成抽濾，4℃冷藏存放不超過(guò)24h。5d)轉(zhuǎn)移上清液到對(duì)應(yīng)編號(hào)的1.5mL新離心管中，加j)使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度和質(zhì)量，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完也可采用符合5.1中要求的動(dòng)物組織細(xì)胞DNb)向混合液中加入2.5倍體積的無(wú)水也可采用符合5.1中要求的柱式PCR產(chǎn)上游引物F：GGWACWGGWTGAACWG6123456789PCR擴(kuò)增體系包括PCR聚合酶、聚合酶緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、經(jīng)8.1和8.2提對(duì)PCR擴(kuò)增樣品進(jìn)行第二代高通量測(cè)序，利用分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除測(cè)序過(guò)程7e)去除由于測(cè)序讀長(zhǎng)限制導(dǎo)致的末端序列不穩(wěn)定的a)經(jīng)篩選與處理的測(cè)序數(shù)據(jù)需使用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件基于97%序列相似度進(jìn)行聚類，獲c)去除低相似度和覆蓋度的結(jié)果，保留相似度和覆蓋度均大于85%的OTUs；d)提取物種的分類信息，包括界、門、綱、目、科、屬、種等，即可展示待識(shí)界門綱目科屬種123…c)運(yùn)輸和待測(cè)期間嚴(yán)格按照要求保存樣品，確保不c)DNA提取和純化所用器具按規(guī)范滅菌，耗材一次性使用8a)擴(kuò)增過(guò)程保證試劑使用量規(guī)范，模9[1]HJ710.8-2014生物多樣性觀測(cè)技術(shù)導(dǎo)[3]DB43/T432-20[4]黃祥飛，陳偉民，蔡啟銘.《湖泊生[5]孟偉，張遠(yuǎn)，渠曉東等.《河流生態(tài)調(diào)查技術(shù)方法》.科學(xué)出版社.2011年4