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文檔簡介
雙向電泳2-dimentionalgelelectrophoresis
高分辨的雙向電泳是由O’Farrell’s和Klose三十多年前各自創建的。1975年O’Farrell’s對E.coli提取物進行雙向電泳后,成功地分離約1000個E.coli蛋白,從此拉開了雙向電泳在蛋白組學中的研究序幕。雙向電泳其原理簡明,第一向沿水平方向按等電點不同進行分離(等電聚焦),不同等電點的蛋白質沿pH梯度分離,到達各自的等電點;隨后第二向沿垂直的方向按分子量進行分離,它是目前蛋白質組學研究的核心技術。
(一)等電聚焦電泳技術
(isoelectricfocusing,IEF)
是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質,進行分離等電點不同的蛋白質電泳技術。1、等電聚焦原理
等電點聚焦就是在電泳槽中放入載體兩性電解質,然后將蛋白質混合物放進此體系,當通以直流電時,兩性電解質即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度,而等電點不同的蛋白質即移動到或聚焦到與其等電點相當的pH位置上,從而得到分離。測出蛋白分子聚焦位置的pH值,便可以得到它的等電點。+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH101-DIsoelectricFocusingTheory2、優點1)分辨率可達0.01pH單位,因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分;2)等電聚焦能抵消擴散作用,使區帶越走越窄;3)樣品不管加在什么部位,都可聚焦到其等電點,而且很稀的樣品也可進行分離。4)可以測量被測物質的等電點3、pH梯度的形成(1)人工pH梯度:
當兩個不同pH的緩沖液互相擴散時,在其混合區間即形成pH梯度,稱為“人工pH梯度”。因為緩沖液是電解質,在電場中它的離子移動會引起pH梯度的改變,所以不穩定。(2)天然pH梯度:
是在正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物,這種梯度是由電流本身所引起并保持的,因此比較穩定。pH梯度的選擇常用方法:先寬后窄,先線性后非線性,先短后長,預試驗確定。4、兩性電解質載體與支持介質
1)兩性電解質介質
理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩沖能力及電導,前者保證pH梯度的穩定,后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導系數從而使整個體系的電導均勻。兩性電解質的分子量要小,易于應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開,而且不應與被分離物質發生反應或使之變性。
2)常用的支持載體
聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等,其中聚丙烯酰胺凝膠為最為常用。電泳后,不可用染色劑直接染色,因為常用的蛋白質染色劑也能和兩性電解質結合,因此應先將凝膠浸泡在5%的三氯醋酸中去除兩性電解質,然后再以適當的方法染色。
兩維間的平衡
一維結束后可馬上進行二維電泳,也可保存在兩片塑料膜間于-80°保存數月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡,以便于被分離的蛋白質與SDS完整結合,從而在SDS是電泳能順利進行。建議方案是:用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris(pH8.8)緩沖液先平衡15min,再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。(二)、聚丙烯酰胺凝膠電泳
(Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)
一)基本原理聚丙烯酰胺凝膠由單體的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2
Acrylamide)和甲叉雙丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2)2N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成.化學聚合和光聚合化學聚合通常是加入催化劑過硫酸銨(AP)以及加速劑四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化過硫酸銨產生自由基:以R
代表自由基,M代表丙烯酰胺單體,則聚合過程可以表示為:
單體和雙體在凝膠中的總濃度(T)a代表單體的重量(g);b代表雙體的重量(g);m代表溶液中的體積(ml)交聯度(c)雙體占總濃度的百分含量PAG濃度T%C=2-6%分離物分子量范圍(KDa)PAG濃度T%C=5%分離物分子量范圍(KDa)530-200560-7001015-1001022-2801510-501510-200202-15205-150表PAG濃度與蛋白質分離物分子量之間的關系二)聚丙烯酰胺凝膠的優點:可以隨意控制“T”和“C”,從而得到不同的有效孔徑。高的靈敏度:10-9
~10-12
mol/L。電泳時不會產生“電滲”。使用高純度的單體原料,因而電泳分離的重復性好。透明度好,便于照相和復印。機械強度好,有彈性,不易碎,便于操作和保存。無紫外吸收,不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
1967年,Shapiro等人首先發現,如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統中加入一定量的十二烷基硫酸鈉(SDS),則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質的分子量大小。電泳的樣品中加入含有SDS和
-巰基乙醇的樣品處理液,SDS即十二烷基磺酸鈉(CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+),是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內和分子間的氫鍵,破壞蛋白質分子的二級和三級結構,強還原劑
-巰基乙醇可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質的四級結構。SDS與蛋白質結合后,蛋白質-SDS復合物上帶有大量的負電荷,平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子,這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質本身電荷上的差異。電泳樣品加入樣品處理液后,要在沸水浴中煮3-5min,使SDS與蛋白質充分結合,以使蛋白質完全變性和解聚,并形成棒狀結構。十二烷基磺酸鈉原態蛋白質當蛋白質的分子量在15,000-200,000之間時,樣品的遷移率與其分子量的對數呈線性關系,符合如下方程式:lgMW=-b
mR+K
其中,MW為蛋白質的分子量,mR為相對遷移率,b為斜率,K為截距。當條件一定時,b與K均為常數。因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較,就可以得出未知蛋白的分子量。
雙向電泳實驗流程
樣品制備(Samplepreparation)
固相預制膠條的水化(IPGstriprehydration)
第一向等電聚焦(IEF)
膠條的平衡(IPGstripequilibration)
第二向SDS電泳(SDSelectrophresis
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