第四章常用分子生物學(xué)技術(shù)

ThePopularTechnologyinMolecularBiology:第1頁，共127頁。第一節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)PolymeraseChainReaction第2頁，共127頁。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是1983年由美國Cetus公司的KaryMullis建立的，是一種體外快速特異擴(kuò)增已知序列的特定DNA片段的技術(shù)，能在數(shù)小時內(nèi)將特定的DNA片段擴(kuò)增100萬倍。該技術(shù)的建立極大推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。KaryMullis由于發(fā)明了PCR技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。一、PCR的基本原理PCR的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，一對分別與模板5′端和3′端相互補(bǔ)的寡核苷酸為引物，以dNTP為原料，在適當(dāng)緩沖液中，由熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化，對一對寡核苷酸引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。第3頁，共127頁。基本反應(yīng)步驟包括三步:

⑴變性（denaturation）通過加熱至高于熔點溫度的條件下（94~95℃，30秒~1分鐘），使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA作為模板。

⑵退火（annealing）：將溫度降低至適當(dāng)溫度（55℃，30秒）時，引物與DNA模板互補(bǔ)區(qū)結(jié)合，形成雜交鏈。由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物的量大大多于模板DNA，使引物與其互補(bǔ)的DNA模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈間的互補(bǔ)機(jī)會較少；第4頁，共127頁。

（3）延伸（extension）將溫度升至72℃，1.5分鐘，DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列DNA為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，從而形成新的雙鏈DNA。

以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物又可作為下一循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，如此重復(fù)循環(huán)，經(jīng)過30個周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍。第5頁，共127頁。

PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第6頁，共127頁。5

Primer15

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TemplateDNA5

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一、基本工作原理目錄第7頁，共127頁。Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目錄第8頁，共127頁。（3）兩個引物之間尤其在3′末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，以免形成引物二聚體（dimerformation）。第56頁，共127頁。不易找到本底低的探針①耐高溫，在70℃反應(yīng)2h后，其殘留活性大于原來的90%，在93℃反應(yīng)2h后，其殘留活性是原來60%，在95℃反應(yīng)2h后，其殘留活性是原來的40%。第75頁，共127頁。為了擴(kuò)增出單一的、特異性的DNA片段，所設(shè)計的引物序列不能在模板序列中重復(fù)出現(xiàn)。①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。比較G、A+G、C+T、C各個泳道上放射自顯影結(jié)果，讀出測定的DNA序列。反義RNA的制備與導(dǎo)入細(xì)胞第84頁，共127頁。（2）水解反應(yīng)，即磷酸二酯酶作用。因為用一般的聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳方法對RNA進(jìn)行鑒定時，由于RNA二級結(jié)構(gòu)的影響，RNA并不嚴(yán)格按照其分子量大小分級。第75頁，共127頁。KaryMullis由于發(fā)明了PCR技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎。核酸分子雜交（Nucleicacidhybridization）是在DNA復(fù)性過程中，如果把不同來源的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。二、PCR體系

基本組成成分：模板DNA；特異性引物；耐熱DNA聚合酶；dNTPs；Mg2+模板影響PCR效應(yīng)主要有2方面因素。1.模板的純度：單鏈、雙鏈DNA以及通過反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA都可以作為PCR反應(yīng)模板。大多數(shù)用途的PCR反應(yīng)，對DNA模板的要求不太嚴(yán)格。

但不能有核酸酶及蛋白水解酶等有害于PCR反應(yīng)的物質(zhì)存在。2.模板DNA的量：模板DNA的用量，是依DNA性質(zhì)而定。對于質(zhì)粒克隆的DNA，一般用納克量ng；對于染色體DNA，一般要到微克級μg。（一）模板：第9頁，共127頁。（二）引物：PCR反應(yīng)中引物的濃度一般為0.1~1.0μmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，這兩者還由于競爭使用酶、底物和模板，會使合成產(chǎn)率下降。PCR的效率和特異性取決于兩個方面：一是引物與模板的特異結(jié)合，二是多聚酶對引物的有效延伸。由基因組DNA作為模板時，由于其數(shù)量的龐大及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除了特異擴(kuò)增外，往往很容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，引物設(shè)計的總原則就是提高擴(kuò)增的效率和特異性。第10頁，共127頁。引物設(shè)計一般遵循的原則：

（1）引物長度以15～

30bp左右為宜。引物過短時會使特異性降低，過長時則成本增加，也會降低特異性。

（2）引物堿基種類盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物的G+C含量宜在45～

55%左右。

（3）兩個引物之間尤其在3′末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，以免形成引物二聚體（dimerformation）。引物二聚體的形成不僅將導(dǎo)致PCR產(chǎn)物產(chǎn)量下降，還會引起引物比率失去平衡，從而導(dǎo)致非特異性DNA的合成（引物用量不對稱的PCR叫做不對稱PCR，其導(dǎo)致擴(kuò)增失敗的幾率比標(biāo)準(zhǔn)PCR多得多）。第11頁，共127頁。

（4）引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計時采用計算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。為了擴(kuò)增出單一的、特異性的DNA片段，所設(shè)計的引物序列不能在模板序列中重復(fù)出現(xiàn)。這就是所謂的引物序列的獨特性。

（5）引物5′末端堿基：引物設(shè)計時可以在5′末端加上限制性內(nèi)切酶位點或其它短序列。第12頁，共127頁。

（6）引物3′末端堿基：原則上要求引物3′末端與模板DNA一定要配對。另外引物3′末端的末位堿基在很大程度上影響著TaqDNA聚合酶的延伸效率。引物3′末端堿基在錯誤配對時，不同堿基的引發(fā)鏈的合成效率存在很大差異。當(dāng)末位堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能引發(fā)鏈的合成，而末位堿基是T時，錯配時引發(fā)效率大大降低。G、C居于中間，所以3′末端的末位堿基最好選T、C、G，而不是A。第13頁，共127頁。（三）DNA聚合酶：在PCR反應(yīng)中，DNA聚合酶是關(guān)鍵的因素之一。TaqDNA聚合酶是從一種嗜熱水生菌ThermusaquaticusYT-1菌株中分離提純的。TaqDNA聚合酶基因全長2496個堿基，編碼832個氨基酸，其酶蛋白分子量為94kD。該酶在70~80℃時具有很高的生物學(xué)活性。合成速度150bp/秒.酶分子。90℃以上不變性。對Mg2+濃度非常敏感。第14頁，共127頁。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段的特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。①耐高溫，在70℃反應(yīng)2h后，其殘留活性大于原來的90%，在93℃反應(yīng)2h后，其殘留活性是原來60%，在95℃反應(yīng)2h后，其殘留活性是原來的40%。TaqDNA聚合酶具有以下特點：第15頁，共127頁。

與大腸桿菌DNA聚合酶Ι相比，TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′外切酶活性。因此，在PCR反應(yīng)中如果發(fā)生某些單核苷酸的錯配，這種酶是沒有校正功能的。使用TaqDNA聚合酶的PCR反應(yīng)出現(xiàn)堿基錯配的機(jī)率為2.1×10-4左右。在100μL反應(yīng)體系中，一般需要TaqDNA聚合酶的用量為0.5~5U。酶濃度的選擇主要根據(jù)擴(kuò)增片段的長短及其復(fù)雜程度不同而有所區(qū)別。使用酶濃度過高，可引起非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。第16頁，共127頁。dNTP溶液具有較強(qiáng)的酸性，使用時應(yīng)用NaOH將pH值調(diào)7.0-7.5，分裝小管，于-20℃存放。dNTP濃度應(yīng)在20～200μmol/L，濃度過高可加快反應(yīng)速度，同時還可增加堿基的錯誤摻入率和實驗成本。反之，濃度過低會導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高實驗的精確性。4種dNTP在使用時必須以等量濃度配制，以減少錯配誤差和提高使用效率。如果其中一種dNTP濃度明顯不同于其它幾種時，就會誘發(fā)錯誤摻入，降低合成速率。此外，由于dNTP可能與Mg2+結(jié)合，因此應(yīng)注意Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。（四）底物（4種dNTP）第17頁，共127頁。（五）PCR反應(yīng)的緩沖液：

在一般的PCR反應(yīng)中，

Mg2+的合適濃度為，Mg2+過量能增加非特異性擴(kuò)增并影響產(chǎn)率。PCR反應(yīng)中使用10～50mmol/LTris.HCl調(diào)節(jié)pH，使TaqDNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。在反應(yīng)體系中加入適量10%的二甲基亞砜，雖然對聚合酶活性有一定抑制作用，但可以減少模板二級結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。第18頁，共127頁。1、變性：變性溫度低時，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。三、PCR反應(yīng)條件優(yōu)化（一）循環(huán)參數(shù)：第19頁，共127頁。

2.退火：變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物與模板發(fā)生結(jié)合。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基的組成及其濃度，還有靶基因序列的長度。對于含20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，選擇55℃為最適退火溫度的起點較為理想。引物的合適復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物與模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。第20頁，共127頁。

3.延伸：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min足夠；3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。但是對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時間要稍長些。第21頁，共127頁。4.循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR的擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。第22頁，共127頁。反應(yīng)體系一般選用50~100μl體積，其中含有：

50mmol/LKCl10mmol/LTris.HCl（室溫下pH=8.4）

1.5mmol/LMgCl2100μg/mL明膠或牛血清白蛋白（BSA）

2個引物，各0.25μmol/L4種底物（dATP+dCTP+dGTP+dTTP），各200μmol/L

模板DNA（人基因組DNA）0.1μgTaqDNA聚合酶2.5U第23頁，共127頁。

其中模板DNA的用量必須根據(jù)分子量的多少加以調(diào)整，一般需要含102～105拷貝的DNA，封上石蠟油防止高溫反應(yīng)時液體的揮發(fā)，即可進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件一般為：94℃變性30秒，55℃退火30秒，70~72℃延伸30~60秒，共進(jìn)行30次左右的循環(huán)。在最后一個反應(yīng)循環(huán)結(jié)束時，應(yīng)該使PCR反應(yīng)在72℃進(jìn)一步延伸5分鐘，以提高產(chǎn)物的擴(kuò)增率。然后，將反應(yīng)混合物冷卻至4℃終止反應(yīng)。

第24頁，共127頁。（二）PCR反應(yīng)特點：1.特異性強(qiáng)：

決定PCR反應(yīng)的特異性因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；②堿基配對原則；③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸都是遵循堿基配對原則。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。第25頁，共127頁。2.靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-2)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。3、簡便、快速：PCR反應(yīng)利用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在PCR儀和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。第26頁，共127頁。

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測。4.對標(biāo)本的純度要求低：（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析：PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。對PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。第27頁，共127頁。1.凝膠電泳分析：PCR產(chǎn)物電泳后，用EB溴乙錠染色后，在紫外儀下觀察，可初步判斷產(chǎn)物的特異性。2.酶切分析：根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段。此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。3.分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR產(chǎn)物堿基突變的有效方法。4.核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。

第28頁，共127頁。（四）易出現(xiàn)的問題及解決方法:1.沒有產(chǎn)物形成：①是否加入TaqDNA酶，酶活性如何？②DNA解鏈?zhǔn)欠癯浞郑虎蹣悠分锌赡苡忻傅囊种苿?5℃加熱10分鐘將其失活；2.有非特異產(chǎn)物生成或產(chǎn)物在凝膠電泳中呈涂布狀①減少循環(huán)周期；②增加退火溫度、減少退火時間及延伸時間；③降低引物及TaqDNA酶濃度；④改變Mg2+濃度。3.假陽性結(jié)果的預(yù)防①PCR前、后所用的試劑器材分室存放，前后工序分室操作。②凡能耐高溫的器材、試劑均經(jīng)高壓滅菌。③試劑防止污染。第29頁，共127頁。四、PCR的類型（一）反轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)（RT-PCR）用途：克隆cDNA、檢測RNA病毒、合成cDNA探針。

又叫做RNA-PCR技術(shù)，是將mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR技術(shù)相偶聯(lián)的一種基因分離技術(shù)。通過mRNA反轉(zhuǎn)錄，得到與此mRNA相對應(yīng)的cDNA，然后利用特定的PCR引物，直接以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到所需的基因。反轉(zhuǎn)錄可用總RNA或總poly（A）RNA為模板進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后不需要將單鏈cDNA合成雙鏈cDNA。RT-PCR為經(jīng)cDNA分離特定的基因提供了一種通用、快速的手段。第30頁，共127頁。（二）幾種特殊的PCR1.錨定PCR（anchoredPCR）

通常采用的PCR反應(yīng)必須知道欲擴(kuò)增DNA或RNA片段兩側(cè)的序列，錨定PCR可以克服序列未知或序列未全知帶來的障礙。錨定PCR是以mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板，利用帶有特定限制性內(nèi)切酶位點的錨定引物，從任何cDNA上得到直接用于克隆的cDNA片段。第31頁，共127頁。

分離細(xì)胞總RNA或mRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA3′末端加上poly（dG）尾。與此pol（dG）相對應(yīng)的錨定引物是poly（dC），為保證擴(kuò)增的特異性，建議poly（dG）在12個堿基以上，5′端可帶某些限制性內(nèi)切酶序列。在與基因特異性配對的引物參與下，可以擴(kuò)增此帶同源多聚物尾巴的cDNA序列。過程：第32頁，共127頁。RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈cDNA3′GG….GG5′末端核酸轉(zhuǎn)移酶加poly(dG)尾3′GG….GGCC….CC5′CC…CCGG…GG3′5′擴(kuò)增引物第33頁，共127頁。2.修飾PCR：在引物上加上若干額外序列，從而使產(chǎn)物的末端加上一段額外DNA序列，可以是酶切位點，也可以是突變位點.3.多重PCR：是在一次反應(yīng)中加入多對引物，同時擴(kuò)增一份DNA樣品中不同序列的PCR過程。由于每對引物擴(kuò)增區(qū)位于模板DNA的不同部位，因而擴(kuò)增片斷長短不同，由此檢測是否存在某些基因片段的缺失或突變。常用于某些遺傳病的診斷。4.堿基替代PCR

利用PCR技術(shù)摻入某些堿基的修飾類似物。如當(dāng)PCR擴(kuò)增穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)或高G+C含量的模板DNA時會很困難，此時可采用摻入C7dGTP(7-脫氧-2-脫氧鳥苷三磷酸)的方法，以降低產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性，克服體外擴(kuò)增的困難。第34頁，共127頁。

目標(biāo)基因變性、復(fù)性5`5`3′3`acda3`端延伸bdKlenow聚合酶使用引物誘變的“左方”PCR使用引物誘變的“右方”PCR5.重組PCR:在研究基因的功能時，需要對基因進(jìn)行點突變，包括堿基替代、缺失或插入等，以觀察基因功能的改變。多種重組PCR方法可以引入突變，例如一步法PCR和重疊延伸法。第35頁，共127頁。

將組織固定，處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA，以其為模板進(jìn)行擴(kuò)增的PCR反應(yīng)稱為原位PCR。原位PCR技術(shù)不僅不需要從組織細(xì)胞中分離出模板DNA，而且能在細(xì)胞原位進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而大大提高了檢測的靈敏度。以組織切片或細(xì)胞懸液作為樣品，經(jīng)蛋白酶消化后，加入DNA酶降解DNA，還用生物素標(biāo)記dNTP，在專用的原位PCR儀上進(jìn)行，最后在顯微鏡下觀察結(jié)果。原位PCR已成為研究靶基因序列的細(xì)胞定位、組織分布和靶基因表達(dá)檢測的重要手段，廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)生學(xué)、胚胎學(xué)和病毒學(xué)的研究。6.原位PCR（insituPCR）第36頁，共127頁。

不對稱PCR是指在PCR擴(kuò)增循環(huán)中所用的兩個引物的濃度不同，從而得到單鏈DNA。典型的引物濃度比例是50：1或100：1。這樣在最初PCR循環(huán)（15循環(huán)左右）中，絕大多數(shù)的PCR產(chǎn)物是雙鏈并以指數(shù)式積累。但當(dāng)?shù)蜐舛鹊囊锉幌谋M后，在進(jìn)一步循環(huán)過程中，只有高濃度的引物介導(dǎo)PCR反應(yīng)，產(chǎn)生大量單鏈DNA，以線性方式積累。利用不對稱PCR可以產(chǎn)生特異性的單鏈DNA，用作DNA序列分析的模板等。7.不對稱PCR（asymmetricPCR）第37頁，共127頁。8.定量PCR（multiplexPCR）

該方法是應(yīng)用PCR技術(shù)檢測標(biāo)本中靶基因的拷貝數(shù)。將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于同一個試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后分成兩條區(qū)帶，比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物5′端標(biāo)上標(biāo)記物，通過檢測區(qū)帶的放射性強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度，可測出目的基因的拷貝數(shù)。9.膜結(jié)合PCR：

將模板DNA用一定方法固定于硝酸纖維膜或尼龍膜上，再進(jìn)行PCR。優(yōu)點：模板可重復(fù)用，可純化模板。缺點：擴(kuò)增效率低。第38頁，共127頁。

著色互補(bǔ)PCR

又稱為熒光PCR。就是將PCR的引物5′端用熒光物質(zhì)標(biāo)記而進(jìn)行的PCR。其原理是用不同的熒光染料，如紅色的羅丹明（POX）和綠色熒光素（FAM）等分別標(biāo)記于不同的寡核苷酸引物上，同時擴(kuò)增多個DNA區(qū)段，反應(yīng)完畢后，利用分子篩除去多余的引物。用紫外線照射擴(kuò)增產(chǎn)物，就能顯示出某一種或幾種熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)段缺失，就會缺乏相應(yīng)的顏色，據(jù)此可以很快診斷是否某種基因缺失，或是發(fā)現(xiàn)某些感染的病毒等。著色互補(bǔ)PCR可以進(jìn)一步發(fā)展，為臨床自動化診斷打下基礎(chǔ)。10.著色互補(bǔ)PCR（colorcomplementationPCR）第39頁，共127頁。

反向PCR技術(shù)是對一個已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增研究。反向PCR方法有三個步驟：

⑴用限制性內(nèi)切酶切割已知序列以外的DNA序列。

⑵被酶切后的DNA片段連接形成環(huán)狀DNA分子。

⑶選擇與已知序列DNA片段兩末端序列相互補(bǔ)，并且3′端相互反向的引物進(jìn)行PCR，這樣可以有效擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列。用反向PCR可以對染色體DNA進(jìn)行染色體步查（chromosemewalking）、擴(kuò)增末端特異性的DNA片段、位點特異性突變等。11.反向PCR（InversePCR）第40頁，共127頁。已知序列未知序列限制酶切點（X)限制酶切點（X)限制酶（X)酶切連接PCR未知序列引物1引物2第41頁，共127頁。12.實時PCR

實時PCR是近年發(fā)展的一種核酸微量分析技術(shù)。

實時PCR的基本原理是引入了熒光標(biāo)記分子，使得PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號與PCR產(chǎn)物量成正比。因此，對每一反應(yīng)時刻的熒光信號進(jìn)行實時分析，從而計算出PCR的產(chǎn)物量。第42頁，共127頁。實時熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation第43頁，共127頁。SYBRGreen法優(yōu)缺點

對DNA模板沒有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

-----不必設(shè)計復(fù)雜探針非常靈敏便宜優(yōu)點

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對引物特異性要求較高缺點第44頁，共127頁。與目標(biāo)序列互補(bǔ)實時熒光定量PCR方法2-------TaqMan法TaqMan---水解型雜交探針5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第45頁，共127頁。TaqMan法工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光第46頁，共127頁。TaqMan法優(yōu)缺點

對目標(biāo)序列的高特異性

------陰性結(jié)果確定設(shè)計相對簡單

------與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu)點

只適合一個特定的目標(biāo)委托公司標(biāo)記，價格較高不易找到本底低的探針缺點第47頁，共127頁。實時熒光定量PCR方法3-------Molecularbeacon法(分子信標(biāo))標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素淬滅劑發(fā)夾型雜交探針第48頁，共127頁。Molecularbeacon(分子信標(biāo))應(yīng)用范圍

起始模板的定量基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析第49頁，共127頁。Molecularbeacon(分子信標(biāo))優(yōu)缺點高特異性：對目標(biāo)序列檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu)點

只能用于一個特定目標(biāo)設(shè)計困難價格比較高缺點第50頁，共127頁。五、PCR的主要用途1.遺傳性疾病的基因診斷

到目前為止已發(fā)現(xiàn)的遺傳病有4000多種，以地中海貧血為例，主要是由基因缺失、插入、置換而造成的基因的不表達(dá)或表達(dá)水平低下。可以提取DNA，用PCR進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。2.檢測癌基因

目前已發(fā)現(xiàn)了大量的癌基因，其中ras基因是研究的最徹底的一種。PCR方法可以選擇性擴(kuò)增ras基因，大大提高了靈敏度，可以快速檢測ras基因的點突變情況。第51頁，共127頁。3.PCR技術(shù)檢測艾滋病

病毒性疾病的早期診斷對疾病的防治尤為重要。感染的早期，病毒僅侵入人體的少量細(xì)胞，PCR方法能從具有大量宿主核酸存在的條件下，特異性擴(kuò)增病毒的核酸序列而加以檢測。目前已經(jīng)應(yīng)用于艾滋病毒、乙肝病毒等疾病的診斷。4.PCR技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用，除了疾病的基因診斷、病原體和癌基因的檢測，還有DNA序列測定、基因的點突變、缺失或插入、基因克隆和表達(dá)等方面。第52頁，共127頁。5．在法醫(yī)學(xué)上應(yīng)用PCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用主要是個人識別和親子鑒定。最早在法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用1985年，英國遺傳學(xué)家從人基因文庫中篩選出幾種小的衛(wèi)星DNA探針，從而制備除了具有個體特異性的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)圖譜（RFLP）稱為DNA指紋（DNAfingerprint）。并成功用于個人識別和親子鑒定。目前這項技術(shù)已在20多個國家使用。第53頁，共127頁。第二節(jié)

核酸分子雜交Nucleicacidhybridization第54頁，共127頁。一、基本原理

核酸分子雜交（Nucleicacidhybridization）是在DNA復(fù)性過程中，如果把不同來源的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交實質(zhì)是雙鏈DNA的變性和具有同源序列的兩條單鏈的復(fù)性過程。第55頁，共127頁。DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復(fù)性不同來源的DNA分子第56頁，共127頁。第57頁，共127頁。復(fù)性RNADNA第58頁，共127頁。第59頁，共127頁。

探針(probe)：是一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸。將其與固定在NC（硝酸纖維素濾膜）膜上的核酸互補(bǔ)結(jié)合，可判斷是否有同源的核酸分子存在。探針的選擇與標(biāo)記是雜交技術(shù)成功與否的關(guān)鍵。

雜交的雙方是待測核酸序列及探針。待測核酸序列可以是基因組DNA,細(xì)胞總RNA或克隆的基因片段等。將標(biāo)記的已知核酸片段作為探針(probe)，與待測樣本核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)，即可觀察到樣本核酸中相應(yīng)的序列。二、探針的種類與標(biāo)記第60頁，共127頁。1.基因組DNA探針：是指長度在幾百個堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。是從基因組文庫中篩選得到一個特定基因（或基因片段）的克隆后，大量擴(kuò)增、純化，切取插入片斷，分離純化，即可作為探針使用。基因組DNA探針含有內(nèi)含子序列，但也可僅僅使用某一外顯子序列作為探針，或僅僅使用某一內(nèi)含子序列作為探針。（一）探針的種類

根據(jù)標(biāo)記方法不同探針可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針等幾類，DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。第61頁，共127頁。①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，都能用于同位素和非同位素標(biāo)記。DNA探針（包括cDNA探針）的主要優(yōu)點：2.cDNA探針：利用mRNA反轉(zhuǎn)錄合cDNA后，經(jīng)PCR擴(kuò)增可制備大量cDNA探針。也可將cDNA克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cDNA大量擴(kuò)增。提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶消化，將cDNA片斷切割下來，分離純化，即可作探針使用。第62頁，共127頁。3.RNA探針：可從細(xì)胞中直接提取mRNA或利用DNA合成儀合成小片段的RNA作為探針。由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。因此，RNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點。

4.人工合成寡核苷酸探針：人工設(shè)計，在DNA合成儀上合成。人工合成的寡核苷酸探針具有一些獨特的優(yōu)點：①由于鏈短，其序列復(fù)雜程度低，分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短②可識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③可一次大量合成（1～10mg），使得這種探針價格低廉。

第63頁，共127頁。

核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵。最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法是放射性同位素標(biāo)記。常用的放射性同位素有32P和35S，前者能量高，信號強(qiáng)，最常用。放射性同位素標(biāo)記探針雖然敏感度高，但卻存在輻射危害和半衰期的限制（32P半衰期為14.3天，35S半衰期為87.1天，125I的半衰期為60天），3H的半衰期長達(dá)12.3年，但它釋放β射線能量太低（0.018Mev），只能用于組織原位雜交。

（二）探針的標(biāo)記方法第64頁，共127頁。

1.

放射性核素的標(biāo)記（1）切口平移法：

該技術(shù)由Kelly等于1970年創(chuàng)立。是目前最常用的一種脫氧核糖核酸的探針標(biāo)記法。是利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的多種酶促活性將標(biāo)記的dNTP摻入到新形成的DNA鏈中去，從而合成高比活的均勻標(biāo)記的DNA探針。線狀、超螺旋及帶缺口的雙鏈DNA勻可作為模板。第65頁，共127頁。

如果在反應(yīng)液中含有一種或多種標(biāo)記的核苷酸（如32P—dCTP），則這些標(biāo)記的核苷酸將替代原來的核苷酸殘基，從而形成高放射性活性的DNA探針。

首先，用極微量的DNaseⅠ在Mg2+的存在下，在DNA鏈上隨機(jī)形成單鏈切口。利用大腸桿菌DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性在切口處將從舊鏈5′—末端逐步切除。同時，在DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合酶活性的催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈模板，順序?qū)⑼凰貥?biāo)記的dNTP連接到切口的3′末端—OH上，合成新的DNA單鏈。第66頁，共127頁。5′3′3′5′DNA酶ⅠMg2+DNA聚合酶Ⅰ[α-32P]-dNTP雙鏈DNA帶切口的雙鏈DNA32P部分標(biāo)記的單鏈DNA片斷變性5′3′3′5′5′5′3′3′第67頁，共127頁。（2）隨機(jī)引物法(randompriming)

隨機(jī)引物是人工合成的長度為6個核苷酸的寡聚核苷酸片段的混合物，它們的順序是根據(jù)計算機(jī)分析了生物基因組DNA六核苷酸排列的多種可能性而設(shè)計的。這些隨機(jī)引物可以隨機(jī)的結(jié)合到任意一個用作探針的DNA片斷上，起到DNA合成引物的作用。將這些隨機(jī)引物與變性后的DNA單鏈結(jié)合，以此隨機(jī)引物為引物，變性后的DNA單鏈為模板，在Klenow片段的催化下，4種dNTP（其中一種為標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP）為原料，合成與探針DNA互補(bǔ)的帶有標(biāo)記物的DNA探針。第68頁，共127頁。5’3’3’5’5’3’5’3’變性Klenow聚合酶；[32P]-dCTP;dNTP隨機(jī)引物變性標(biāo)記探針第69頁，共127頁。

（3）末端標(biāo)記法：該法需要DNA分子末端帶有羥基。如果要標(biāo)記的DNA分子的5′端為磷酸基團(tuán)，必須用堿性磷酸酶催化切除5′末端的磷酸基團(tuán)，然后才能標(biāo)記。其原理是利用多核苷酸激酶將[r

-32P]ATP分子上r位磷酸基轉(zhuǎn)移至寡核苷酸鏈的5′末端，也可在3′端標(biāo)記。2.

非放射性的標(biāo)記法

按標(biāo)記方法不同，可分為兩類：一類是將標(biāo)記物預(yù)先連接在NTP或dNTP上，與放射性核素標(biāo)記的核苷酸一樣用酶促聚合方法摻入到核酸探針上，如生物素、地高辛等。另一類是直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而連接在核酸上，即化學(xué)標(biāo)記法。第70頁，共127頁。

（1）生物素標(biāo)記探針：生物素標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸有：dUTP、dATP、dCTP等，生物素可與dUTP、dATP、dCTP共價結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，標(biāo)記的dUTP可代替dTTP，標(biāo)記的dATP可代替dATP，標(biāo)記的dCTP代替dCTP摻入到DNA探針中。生物素探針的監(jiān)測系統(tǒng)主要有抗生物素蛋白和鏈親和素，它們被標(biāo)上了過氧化物酶或堿性磷酸酶。當(dāng)摻入探針DNA分子中的生物素與抗生物素蛋白或鏈親和素特異結(jié)合時，標(biāo)在上面的酶就可催化底物發(fā)生顏色變化，從而指示探針?biāo)谖恢谩？捎糜谕庠椿虻臋z測。

第71頁，共127頁。

（2）地高辛標(biāo)記核酸探針：地高辛是一種固醇類的半抗原，通過不穩(wěn)定的酯鍵連接到dUTP上。用地高辛標(biāo)記過的dUTP可代替dTTP摻入DNA探針，可用酶或熒光色素結(jié)合的地高辛配基抗體直接檢測，或間接使用免疫熒光法進(jìn)行檢測。

（3）辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記探針：將HRP與聚乙烯亞胺結(jié)合，然后與DNA結(jié)合，產(chǎn)生酶標(biāo)記的探針，與靶基因雜交后，利用酶促反應(yīng)使底物顯色即可指示探針位置。第72頁，共127頁。

液相雜交：是將變性的待測核酸單鏈與標(biāo)記的探針在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后計算雜交分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。三、核酸分子雜交技術(shù)類型：液相雜交和固相雜交。

固相雜交：（solid-phasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。第73頁，共127頁。

印跡方法：

1)可直接將核酸樣品點樣于固相支持物上，稱為斑點技術(shù)及狹縫印跡雜交(dot/blothybridization);2)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法的優(yōu)點是簡單,不需要用其它儀器。缺點是轉(zhuǎn)移時間較長,轉(zhuǎn)移后雜交信號較弱。

3)電轉(zhuǎn)移法：利用電場作用轉(zhuǎn)移。

4)真空轉(zhuǎn)移法：利用真空抽濾作用轉(zhuǎn)移。第74頁，共127頁。（一）Southern轉(zhuǎn)移印跡雜交法

中和第75頁，共127頁。分子雜交實驗①②③目錄第76頁，共127頁。

原理：將電泳分離的RNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上，從而用于雜交反應(yīng)以鑒定其中特定的mRNA分子量的大小。（二）Northern雜交

基本操作流程：⑴RNA變性電泳；⑵RNA轉(zhuǎn)膜；⑶轉(zhuǎn)膜后的RNA片段與標(biāo)記的探針雜交三個步驟。第77頁，共127頁。

因為用一般的聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳方法對RNA進(jìn)行鑒定時，由于RNA二級結(jié)構(gòu)的影響，RNA并不嚴(yán)格按照其分子量大小分級。但采用RNA變性電泳處理后，二級結(jié)構(gòu)解體，泳動時便能嚴(yán)格按照其分子量大小分級。為什么要用RNA變性電泳？

常見的RNA變性電泳有聚乙二醛和二甲基亞砜變性電泳、甲醛變性電泳、甲基氫氧化汞電泳等。

被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。第78頁，共127頁。但是在一反應(yīng)體系中除了存在四種dNTP以外，再加入2′和3′雙脫氧的脫氧核苷三磷酸（2′,3′ddNTP）。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。②天然存在的核酶，根據(jù)構(gòu)象分為錘頭狀、發(fā)夾狀、斧頭狀。第105頁，共127頁。PCR反應(yīng)條件一般為：94℃變性30秒，55℃退火30秒，70~72℃延伸30~60秒，共進(jìn)行30次左右的循環(huán)。以上三步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物又可作為下一循環(huán)的模板。不易找到本底低的探針一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。核酸序列分析：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。但不能有核酸酶及蛋白水解酶等有害于PCR反應(yīng)的物質(zhì)存在。對于未知DNA序列的測定，是要確定一個未知序列的準(zhǔn)確長度和核苷酸的排列順序。三種印跡技術(shù)的比較第79頁，共127頁。放射自顯影照片目錄第80頁，共127頁。

斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以得到半定量的結(jié)果。（三）斑點雜交

優(yōu)點：簡便、快速、經(jīng)濟(jì)。缺點：目的序列與非目的序列未分離,因此，不能了解目的序列的長度。尤其當(dāng)本底干擾較高時,難以區(qū)分目的序列信號和干擾信號。第81頁，共127頁。

原位雜交的基本流程:組織細(xì)胞的固定→預(yù)雜交→雜交→沖洗→放射自顯影或免疫酶法顯示。

1.細(xì)胞內(nèi)原位雜交：在載玻片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在細(xì)胞內(nèi)的空間位置。例如：對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定序列的位置；與細(xì)胞內(nèi)RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。（四）原位雜交第82頁，共127頁。

⑴能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究，而不受同一組織中其它成分的影響。⑵由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性。⑶可以完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。2.菌落原位雜交：原位雜交的優(yōu)點：第83頁，共127頁。第84頁，共127頁。第三節(jié)核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis第85頁，共127頁。DNA序列分析技術(shù)是分子生物學(xué)中一項極為重要的技術(shù)，DNA序列分析技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)從手工操作發(fā)展到自動分析。一、原理：

1.利用復(fù)制終止法或化學(xué)斷裂等方法，產(chǎn)生具有不同長度的DNA片段，其長度之間的最小差異是一個堿基，且被特定的標(biāo)記化合物標(biāo)記，便于檢測。

2.用變性的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，變性膠的分辨率為一個堿基。

3.對完成的測序膠進(jìn)行放射自顯影、銀染或在自動測序儀上通過自動記錄標(biāo)記在不同堿基上的不同熒光信號讀取DNA的序列。第86頁，共127頁。

目前DNA測序的具體方法很多，但其原理都是來源于兩個基本的方法，即1977年Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈終止法（一般稱為酶法）及由Maxam和Gilbert在1977年發(fā)明的化學(xué)降解法。由于Sanger的測序技術(shù)操作比較簡單，目前絕大多數(shù)實驗室采用該法，而DNA序列自動分析也是以Sanger測序法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的。二、常用測序方法第87頁，共127頁。1.雙脫氧鏈終止測序法的原理：

在有DNA模板、引物和4種dNTP及合適的緩沖液存在下，DNA聚合酶可以從引物的3′端開始按模板鏈的堿基排列順序，根據(jù)堿基配對的原則延伸合成復(fù)制鏈。但是在一反應(yīng)體系中除了存在四種dNTP以外，再加入2′和3′雙脫氧的脫氧核苷三磷酸（2′,3′ddNTP）。（一）雙脫氧鏈終止測序法

第88頁，共127頁。

由于2′,3′ddNTP與普通dNTP不同之處在于其脫氧核糖的3′位置缺少一個羥基。它們雖然可以在DNA聚合酶作用下通過其5′三磷酸基團(tuán)摻入到正在延長的DNA鏈中，但由于沒有脫氧核糖的3′羥基，不能與后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在復(fù)制的DNA鏈不能再延伸。這樣，鏈延伸將由于2′,3′雙脫氧核苷三磷酸的摻入隨即終止。第89頁，共127頁。

在測序反應(yīng)中，通常設(shè)置四組獨立的反應(yīng)體系，在每個反應(yīng)體系中，都加入DNA模板、引物、DNA聚合酶Ⅰ、dNTP，其中一種帶有32P或35S放射性標(biāo)記。另加入四種雙脫氧核苷酸（ddATP、ddGTPddCTPddTTP）中的一種。由于ddNTP的參與，結(jié)果將產(chǎn)生四組核苷酸片段，分別隨機(jī)終止于模板鏈的A、C、G、T。然后將四組反應(yīng)混合物，按A、C、G、T的順序分別加入到變性聚丙烯酰胺凝膠的樣品槽中進(jìn)行高壓電泳，最后，通過放射自顯影等方法直接讀出DNA上的核苷酸序列。第90頁，共127頁。

2.基本過程：①制備單鏈模板；②在4只試管中逐個加入適當(dāng)?shù)哪０濉NA聚合酶Ⅰ、帶3′-OH的引物和4種dNTP（其中一種帶放射性標(biāo)記）及4種不同的ddNTP，③經(jīng)反應(yīng)合成各種隨機(jī)長度的產(chǎn)物；

④各反應(yīng)體系在不同的泳道上電泳，⑤經(jīng)放射自顯影可得出直讀圖。由于在4組獨立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的每一個A、每一個G或每一個T、C的位置上。第91頁，共127頁。第92頁，共127頁。目錄第93頁，共127頁。

化學(xué)降解法是1977年由Maxam和Gilbert創(chuàng)建的以化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的DNA序列分析法。

1.基本原理：用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片斷，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有各種不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離后，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上顯示相應(yīng)的帶譜，可直接讀出DNA鏈的序列。（二）化學(xué)降解法第94頁，共127頁。DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C

化學(xué)法測序的基礎(chǔ)是堿基特異性的裂解反應(yīng)，包括三個步驟：①對特定的堿基（或特定類型堿基）進(jìn)行化學(xué)修飾；②堿基消除；③用特定試劑使修飾堿基從糖環(huán)上脫落下來，修飾堿基的5’和3’磷酸二酯鍵斷裂。第95頁，共127頁。

化學(xué)法的特異性修飾

堿基特異的修飾方法

G在pH8.0下,用硫酸二甲酯對N7進(jìn)行甲基化，使

C8-C9鍵被堿裂解。

A+G在pH2.0下,哌啶甲酸可以使嘌呤環(huán)的N原子質(zhì)子化,導(dǎo)致脫嘌呤,削弱A、G的糖苷鍵

C+T肼使嘧啶環(huán)開環(huán)，并重新形成五元環(huán)，后者不穩(wěn)定，易被剔除。

C在一定NaCl濃度存在下，肼只對胞嘧啶起作用。

在每種情況下，這些反應(yīng)要控制在確保每個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾，其后用哌啶裂解修飾堿基的3’和5’位置，得到一組長度從1至數(shù)百個核苷酸不等的末端標(biāo)記分子。比較G、A+G、C+T、C各個泳道上放射自顯影結(jié)果，讀出測定的DNA序列。第96頁，共127頁。①標(biāo)記目的DNA片段的一端；②將標(biāo)記DNA分成4份，用不同化學(xué)試劑進(jìn)行4種特定裂解反應(yīng)，每種反應(yīng)只斷裂某一種或某一類堿基，控制反應(yīng)程度，使得平均每個DNA分子只有一個位置被隨機(jī)降解，從而使4種反應(yīng)體系中分別產(chǎn)生一組起始于標(biāo)記末端,終止于某一種或某一類堿基的不同長度的DNA片段；2.測序的基本過程：③將4種反應(yīng)體系的降解產(chǎn)物在不同泳道上同時電泳，經(jīng)放射自顯影即可讀出DNA序列。第97頁，共127頁。5′-GATCACTACTG-3′5′-﹡GATCACTACTG-3′5′-﹡GATCACTACTG5′-﹡GATCACTACTG5′-﹡GATCACTACT5′-﹡GATCACTAC5′-﹡G5′-﹡GATCACTA5′-﹡GATCACTAC5′-﹡GATCAC5′-﹡GATCA5′-﹡GATCACT5′-﹡GATC5′-﹡GA5′-﹡GATCAC5′-﹡G5′-﹡GATC5′-﹡GATGG+A硫酸二甲酯甲酸肼C+TC肼加鹽第98頁，共127頁。5′-﹡GATCACTACTG5′-﹡GATCACTACT5′-﹡GATCACTAC5′-﹡GATCACTA5′-﹡GATCACT5′-﹡GATCAC5′-﹡GATCA5′-﹡GATC5′-﹡GAT5′-﹡GA5′-﹡GGATC++GC5′3′第99頁，共127頁。

將目的DNA片段純化后，隨機(jī)斷裂并亞克隆，隨機(jī)收集亞克隆然后測序，既不需努力確定這些亞克隆在靶DNA中的位置，也不必設(shè)法查明究竟測出的是哪一條鏈的序列，只要把積累資料貯存起來，最后用計算機(jī)處理從而獲得整個DNA序列。（三）隨機(jī)法（或鳥槍測序法）

根據(jù)上一組測序的反應(yīng)獲得的核苷酸序列，再設(shè)計新的寡核苷酸作為下一組反應(yīng)的引物，逐步向前推進(jìn)，最終則測得目的DNA的全部序列。（四）引物延伸法第100頁，共127頁。三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激發(fā)光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。A1.LFexpressTM全自動激光熒光核酸測序儀ALFexpressTM全自動激光熒光核酸測序儀是由德國海德堡歐洲分子生物學(xué)實驗室WilhelmAnsorge和BrianSproat設(shè)計的。該儀器設(shè)計獨特，提供快速可靠的測序和片段分析，在人類基因組大規(guī)模測序中起到了重要的初篩作用。第101頁，共127頁。

.ABI最新型全自動DNA測序儀在1987年P(guān)E（PerkinElmer）公司推出自動DNA測序儀，其專利是分別采用4種不同熒光染料進(jìn)行標(biāo)記而在同一個泳道測序，具有很大優(yōu)越性測序策略多數(shù)情況下，測序是對已知序列的亞克隆進(jìn)行鑒定，只需直接克隆到M13或質(zhì)粒載體中進(jìn)行測序。對一個較大片段DNA的鑒定，可利用通用引物分別從兩端開始雙向測序，再通過中間重疊部分拼出全序列。對于未知DNA序列的測定，是要確定一個未知序列的準(zhǔn)確長度和核苷酸的排列順序。對較小的DNA片段（小于400bp），可以直接克隆到M13或質(zhì)粒載體中進(jìn)行測序。如果是數(shù)千個堿基的DNA大片段，就要將其切割成適當(dāng)大小的片段，再進(jìn)行克隆測序。第102頁，共127頁。DNA自動測序結(jié)果舉例目錄第103頁，共127頁。第四節(jié)

生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique第104頁，共127頁。生物芯片技術(shù)基因芯片（DNA芯片）蛋白質(zhì)芯片細(xì)胞芯片組織芯片其它芯片（如樣品制備芯片、核酸擴(kuò)增芯片等）

生物芯片技術(shù)是在20世紀(jì)發(fā)展起來的一項新的規(guī)模化生物信息分析技術(shù)。已被應(yīng)用于生命科學(xué)的眾多領(lǐng)域，包括：基因表達(dá)檢測、基因突變檢測、基因診斷、功能基因組研究、基因組作圖和新基因發(fā)現(xiàn)等多個方面。生物芯片的種類：第105頁，共127頁。是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，通過計算機(jī)系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)第106頁，共127頁。基因芯片的特點

基因芯片可在同一時間內(nèi)分析大量的基因，高密度基因芯片可以在1cm2面積內(nèi)排列20000個基因用于分析，從而實現(xiàn)了基因信息的大規(guī)模檢測。第107頁，共127頁。基因芯片的應(yīng)用基因芯片特別適用于分析不同組織細(xì)胞或同一細(xì)胞不同狀態(tài)下的基因差異表達(dá)情況，其基本原理是基于雙色熒光探針雜交。該系統(tǒng)是將兩個不同來源樣品的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA時，用不同熒光分子（如正常用紅色，腫瘤用綠色）進(jìn)行標(biāo)記。兩種不同熒光分子標(biāo)記的cDNA等量混合后與基因芯片進(jìn)行雜交，在兩組不同的熒光下檢測，獲得兩個不同樣品在芯片上的全部雜交信號。呈現(xiàn)綠色熒光的位點代表該基因只在腫瘤組織表達(dá)，呈現(xiàn)紅色信號的位點代表該基因只在正常組織表達(dá)，呈現(xiàn)兩種熒光互補(bǔ)色—黃色的位點表明該基因在兩種組織中均有表達(dá)。第108頁，共127頁。基因芯片工作流程示意圖第109頁，共127頁。是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)第110頁，共127頁。蛋白質(zhì)芯片作用原理是蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)，例如抗原-抗體或受體-配體之間的特異性結(jié)合。最常用的探針蛋白是抗體。在用蛋白質(zhì)芯片檢測時，首先要將樣品中的蛋白質(zhì)標(biāo)記上熒光分子；標(biāo)記的蛋白質(zhì)一旦結(jié)合到芯片上就會產(chǎn)生特定的信號；通過激光掃描系統(tǒng)檢測信號即可對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。第111頁，共127頁。蛋白質(zhì)芯片的特點及應(yīng)用特點：蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有快速和高通量等特點，它可以對整個基因組水平的上千種蛋白質(zhì)同時進(jìn)行分析，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要手段之一。應(yīng)用：蛋白質(zhì)芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜、蛋白質(zhì)功能和蛋白質(zhì)間的相互作用的研究。在臨床疾病的診斷和新藥開發(fā)的篩選上也有很大的應(yīng)用潛力。第112頁，共127頁。第五節(jié)

反義核酸技術(shù)第113頁，共127頁。

一、基本原理：反義核酸技術(shù)是指人工合成或生物合成的DNA或RNA，能與mRNA互補(bǔ)，是抑制與疾病發(fā)生相關(guān)的基因表達(dá)的一種手段，它能封閉基因表達(dá)，具有特異性且操作簡單，可用于治療由于基因突變或過度表達(dá)所致的腫瘤和遺傳疾病。

其簡單的原理是：根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則設(shè)計出能夠與靶基因特異結(jié)合RNA或DNA序列，以其影響靶基因表達(dá)，抑制其功能。第114頁，共127頁。

根據(jù)核酸種類和作用方式的不同，反義技術(shù)主要分為反義RNA、反義DNA、核酶（ribozyme）三類