3T/XXXXXXX—XXXX人肝前體細胞本文件規定了人肝前體細胞制備的原材料和輔料、制備的一般要求、技術要求、檢驗方法、檢驗規則、標簽、包裝、儲存及運輸和廢棄物處理要求。本文件適用于人肝前體細胞的制備和檢測。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。《中華人民共和國藥典》（2020年版）GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB19815離心機安全要求GB/T26497電子天平YY/T0588流式細胞儀JJF1665流式細胞儀校準規范3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1人肝前體細胞由肝細胞在特殊條件下轉化而得，可再次分化為肝細胞，在肝再生過程中起到重要作用的一類細胞。3.2主細胞庫由細胞種子經培養至特定倍增水平或傳代水平，并經一次制備獲得并分裝的同質和均一的懸液。注：細胞種子是指已通過鑒定證明適用于生物制品生產或檢測的，來傳代穩定的細胞群體，或經過克隆培養以及基因工程構建的3.3工作細胞庫由主細胞庫的細胞經培養至特定倍增水平或傳代水平，并經一次制備獲得的同質和均一的懸液。4縮略語下列縮略語適用于本文件。FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）ALB：白蛋白（Albumin）AFP：甲胎蛋白（Alpha-Fetoprotein）ASGR1：去唾液酸糖蛋白受體1（AsialoglycoproteinReceptor1）CD：分化簇（ClusterofDifferentiation）CFSE：羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CarboxyfluoresceinSuccinimidylEster)ELISA：酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）FGF7：肝前體細胞生長因子7（FibroblastGrowthFactor7）HGF:肝細胞生長因子（HepatocyteGrowthFactor）HLA-DR,DP,DQ：人白細胞抗原DR,DP,DQ（HumanLeukocyteAntigen-DR,DP,DQ）HNF4α：肝細胞核因子4α（HepatocyteNuclearFactor4Alpha）4T/XXXXXXX—XXXXIL-2：白介素-2（Interleukin-2）MMP1:基質金屬蛋白酶-1（MatrixMetalloproteinase-1）MMP2:基質金屬蛋白酶-2（MatrixMetalloproteinase-2）PBMC：外周血單核細胞（PeripheralBloodMononuclearCells）PHA：植物血凝素（Phytohemagglutinin）LAC：白細胞活化混合液（LeukocyteActivationCocktail）Fix/PermKit：固定/通透化試劑盒（Fixation/PermeabilizationSolutionKit）RPMA：反相蛋白質微陣列技術（ReversePhaseProteinMicroarray）TNF-α：腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-alpha）5原材料和輔料5.1起始原材料的獲取應符合倫理和法律法規，起始原材料供者應簽署書面的合法有效的知情同意書，并建立起始原材料數據庫，保護供者隱私信息。5.2應建立和執行供者評估及篩選方法，供者應至少篩查HBV、HCV、HIV、TP，檢測結果應均為陰性,注：HBV為乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus）的縮寫，HCV為丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus）的縮寫，HIV為人類免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyViru5.3應排除有遺傳性疾病的供者，并應對供者進行一般情況篩查。5.4應建立和執行組織或細胞的采集、運輸、交接與儲存方法。5.5細胞培養過程中使用的培養基及其他添加物等應建立質量標準，并按照質量標準進行控制。5.6不宜使用動物血清或其他動物源成分，如必須使用，應確認無特定動物源性病毒感染。5.7細胞凍存時使用的輔料，應建立質量標準，并按照質量標準進行控制。6制備的一般要求6.1人肝前體細胞培養所需的基礎設施和環境條件，應符合GMP要求，滿足產品質量控制需要的潔凈條件并避免微生物污染和交叉污染。注：GMP為GoodManufacturingPractice，即為良好生產規范，是一質量標準進行生產和控制的系統化準則。其核心目標是通過嚴格的流程控制確保產品6.2制備方應對制備操作人員進行培訓，建立考核標準，人員培訓考核合格后進行制備操作。6.3制備方宜建立人肝前體細胞的主細胞庫和工作細胞庫。6.4人肝前體細胞應長期凍存于低于-130℃的環境下，并有相應的凍存記錄，至少包含細胞名稱、培養代次、凍存密度、凍存體積、凍存時間等信息。6.5人肝前體細胞的制備應有標準操作規程，制備過程應符合標準操作規程的要求。6.6人肝前體細胞培養或使用時，應記錄細胞名稱、培養代次、細胞密度與細胞活率等信息。6.7人肝前體細胞培養或使用時，細胞代次不應超過18代。7技術要求人肝前體細胞應符合表1中的技術要求。表1人肝前體細胞計數要求AFP、CD34、CD45、ASGR1陽性比例均應不大于2.5T/XXXXXXX—XXXXHLA-DR,DP,DQ陽性比例應不大于2染色體核型應為46，XY或者46，XX。8檢驗方法8.1細胞形態體外培養，二維貼壁培養條件下，用顯微鏡進行細胞形態觀察。8.2細胞標志蛋白按照附錄B細胞標志蛋白檢測進行試驗。8.3細胞存活率按照附錄A細胞存活率檢測進行試驗。8.4可溶性因子分泌水平（MMP1）按照附錄C細胞功能指標檢測進行試驗。8.5可溶性因子分泌水平（MMP2）按照附錄C細胞功能指標檢測進行試驗。8.6可溶性因子分泌水平（HGF）按照附錄C細胞功能指標檢測進行試驗。8.7可溶性因子分泌水平（FGF7）按照附錄C細胞功能指標檢測進行試驗。8.8免疫原性按照附錄B細胞標志蛋白檢測進行試驗。8.9淋巴細胞增殖效力按照附錄D免疫調控檢測進行試驗。8.10PBMC分泌TNF-α能力按照附錄D免疫調控檢測進行試驗。8.11無菌檢查按照中華人民共和國藥典（2020年版）四部通則1101無菌檢查法進行試驗。8.12支原體檢查按照中華人民共和國藥典（2020年版）四部通則3301支原體檢查法進行試驗。8.13細胞內毒素檢查按照中華人民共和國藥典（2020年版）四部通則1143細菌內毒素檢查法進行試驗。6T/XXXXXXX—XXXX8.14染色體核型按照中華人民共和國藥典（2020年版）三部生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制要求進行試驗。8.15成瘤性按照附錄E人肝前體細胞成瘤性檢測進行試驗。9檢驗規則9.1抽樣方法9.1.1在一個制備周期中，同一供體來源、同一制備線、同一代次、同一天收獲、同一方法制備出來的產品為一批。9.1.2在同一批中，每個檢測類別隨機抽取1個此批次最小包裝單元進行檢驗。9.2檢驗9.2.1每批產品應進行出廠檢驗，并附檢驗報告。9.2.2出廠檢驗應涵蓋第7章的全部項目。9.3判定規則使用符合第5章要求的原材料和輔料、制備過程符合第6章要求，且出廠檢驗項目全部符合第7章的技術要求時，判為合格品；有1項及以上不符合要求時，判為不合格品。10標簽人肝前體細胞產品應在包裝上的規定位置上標注，標注內容至少應包括名稱、細胞代次、細胞數量、制備批號、儲存條件、制備日期等內容。11包裝、儲存及運輸11.1包裝應選擇對人肝前體細胞關鍵質量屬性無影響的材料和容器。11.2儲存11.2.1應選擇不影響細胞質量性狀的細胞凍存液、細胞保護液及其他液體。11.2.2應在低于-130℃的環境下長期儲存。11.3運輸11.3.1應根據細胞的使用要求，選擇合適的承運機構。承運機構應具備相應的功能單元，如質量體系、人員、設備監控及調度等。11.3.2凍存的細胞應在低于-130℃條件下運輸，非凍存細胞應在2℃~8℃條件下運輸。細胞運輸時的介質，如細胞凍存液、細胞保護液及其他液體，應能保證細胞活性。12廢棄物處理12.1人肝前體細胞制備和檢測過程中產生的廢棄物，應有完善的廢棄物暫存、運輸記錄，應選擇有資質的承運廢棄物機構。12.2人肝前體細胞制備和檢測過程中不合格的細胞、剩余廢棄的細胞或組織，應滅菌/滅活后，進行合法并符合倫理的處理。7T/XXXXXXX—XXXX細胞存活率檢測細胞計數法A.1儀器和設備A.1.1熒光細胞分析儀熒光細胞分析儀應按照JJF1665要求進行儀器校準。A.2試劑A.2.1除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水應為符合GB/T6682要求的一級水。A.2.2磷酸鹽緩沖液：市售，pH值應為7.2～7.4。A.2.3AO/PI染液：市售，吖啶橙和碘化丙錠染料。A.3檢測步驟A.3.1細胞懸液制備收集待檢測細胞，用磷酸鹽緩沖液（A.2.2）配置細胞懸液，細胞懸液終濃度宜在1×106個細胞/mL到1×107個細胞/mL之間。A.3.2細胞染色按1：1的體積比將AO/PI染液（A.2.3）與細胞懸液（A.3.1）混合均勻。A.3.3細胞計數取混合好染料的樣品（A.3.2），上樣至計數板進行檢測,每個樣品需2個復孔檢測。在儀器面板上輸入實驗名稱，樣品編號，選擇細胞直徑參數（12～24μm），輸入稀釋比例，讀取總細胞密度、活細胞密度和活率。A.3.4計算與分析細胞存活率“%”、活細胞濃度“個細胞/mL”以及總細胞濃度“個細胞/mL為儀器直接讀取。A.3.5精密度在重復性條件下進行兩次獨立測定，兩次測定結果的絕對誤差應不超過其算術平均值的10%。·8T/XXXXXXX—XXXX細胞標志蛋白及免疫原性檢測流式細胞法B.1儀器和設備B.1.1流式細胞儀流式細胞儀應遵循YY/T0588要求，具有紅色、藍色發射光，配備所使用的熒光通道相應的帶通濾B.1.2水平離心機水平離心機應遵循GB19815標準。B.1.3電子天平顯示分度值0.1mg，電子天平應遵循GB/T26497標準。B.2試劑B.2.1除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水均為符合GB/T6682要求的一級水。B.2.2磷酸鹽緩沖液，市售，pH值應為7.2～7.4。B.2.3抗人ALB、HNF4α、CD44、CD90、AFP、CD34、CD45、ASGR1、HLA-DR,DP,DQ抗體及同型對照抗體。B.2.4固定液：含有4%多聚甲醛的組織固定液，于2℃~8℃保存。B.2.5穿膜液：用磷酸鹽緩沖液配制，體積比為0.5%曲拉通X-100緩沖液，或者購買穿膜液，于2℃~8℃保存。B.2.6封閉液：用磷酸鹽緩沖液配制含0.3mol/L甘氨酸的，體積比為10%羊血清緩沖液，或者購買封閉液，于2℃~8℃保存。B.2.7洗滌液：磷酸鹽緩沖液，于2℃~8℃保存。B.3樣品保存標記后的樣品于2℃~8℃避光保存。B.4檢測步驟B.4.1樣品準備收集細胞，用水平離心機（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌一遍樣品，再用水平離心機（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。B.4.2抗體孵育B.4.2.1細胞表面標志物抗體孵育選擇細胞標志蛋白對應的抗體及同型對照抗體，按照供應商提供的抗體說明書稀釋抗體，抗體與細胞懸液混勻后，于2℃~8℃孵育30～60min。孵育結束后，用洗滌液（B.2.7）清洗樣品兩遍，用水平離心機（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。B.4.2.2細胞胞內標志物抗體孵育樣品中加入1mL固定液（B.2.4）重懸沉淀細胞，室溫固定30min后，用水平離心機（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。9T/XXXXXXX—XXXX樣品中加入1mL穿膜液（B.2.5），重懸沉淀細胞，室溫孵育30min后，用水平離心機（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。樣品中加入1mL封閉液（B.2.6）重懸沉淀細胞，室溫孵育30min后，用水平離心機（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清液。選擇細胞標志蛋白對應的抗體及同型對照（若有按照說明書稀釋抗體，抗體與細胞懸液混勻后，37℃避光孵育30min。孵育結束后用洗滌液（B.2.7）清洗1～2遍，用水平離心機（B.1.2）500×g，離心3min，棄去上清B.4.3過濾上機用洗滌液重懸細胞，使用流式細胞儀（B.1.1）上機檢測。B.4.4圈門設定B.4.4.1根據細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群（即cells排除細胞碎片和多細胞聚團，如B.4.4.2同型對照抗體組作為陰性對照，根據其熒光強度，在分群cells的基礎上畫出細胞群singlecells，排除沒有被熒光抗體標記的陰性細胞和粘連細胞，如圖B.1中B。B.4.4.3在分群singlecells的基礎上顯示具體細胞標志蛋白的陽性比例，如圖B.1中C。圖B.1圈門示意圖T/XXXXXXX—XXXX細胞功能指標檢測ELISA法C.1儀器和設備多功能酶標儀，應可以進行試劑盒推薦的波長檢測。C.2試劑MMP1檢測試劑盒、MMP2檢測試劑盒、HGF檢測試劑盒、FGF7檢測試劑盒。C.3樣品保存C.3.1實驗組為培養人肝前體細胞3天的培養上清液，保存于-60℃~-80℃。C.3.2對照組為人肝前體細胞培養用培養基，保存于2℃~8℃。C.4檢測步驟C.4.1樣品準備收集不少于2mL的培養人肝前體細胞3天的培養上清液，放入離心管中，用水平離心機（B.1.2）300×g，離心10min，取上清液，保存于-60℃~-80℃。C.4.2樣品檢測C.4.2.1按試劑盒操作說明將標準品稀釋至推薦的標準曲線使用濃度，樣品稀釋至推薦比例。C.4.2.2將稀釋后的標準品和樣品加入試劑盒提供的檢測板內并孵育一抗。C.4.2.3一抗孵育完成后清洗檢測板，去除殘留洗滌液。C.4.2.4孵育帶標簽的二抗。C.4.2.5孵育完成后清洗檢測板，去除殘留洗滌液。C.4.2.6檢測板內加入顯色劑，充分反應。C.4.2.7根據試劑盒操作說明中推薦檢測波長，使用多功能酶標儀（C.1）進行檢測。C.4.3計算根據標準曲線獲得的樣品濃度與酶標儀讀數換算公式，將樣品的酶標儀讀數帶入公式計算，得到對應的樣品濃度。T/XXXXXXX—XXXX免疫調控檢測流式細胞法D.1儀器和設備D.1.1熒光細胞分析儀熒光細胞分析儀應按照JJF1665要求進行儀器校準。D.1.2流式細胞儀流式細胞儀應遵循YY/T0588要求。D.1.3水平離心機水平離心機應遵循GB19815標準。D.2試劑D.2.1除另有說明外，所有試劑均為分析純，檢測用水均為符合GB/T6682要求的一級水。D.2.2磷酸鹽緩沖液：市售，pH值應為7.2～7.4。D.2.3消化酶：市售，應為重組蛋白酶。D.2.4AO/PI染色液：市售，吖啶橙和碘化丙錠染料。D.2.5FBS：市售，應含多種細胞生長所需的因子，對細胞的增殖和代謝具有支持作用。D.2.6RPMI1640完全培養基：移取1mLFBS加入8.99mLRPMI1640培養基中，充分混勻。D.2.7IL-2：市售，活性應滿足不低于1×107U/mg。D.2.8PHA：市售。D.2.9CFSE：市售。D.2.10TNF-α：市售，應為抗人單克隆抗體。D.2.11LAC：市售。D.2.12Fix/PermKit：市售。D.3淋巴細胞增殖效率檢測步驟D.3.1將人肝前體細胞接種于24孔細胞培養板，貼壁培養16h～24h。D.3.2第二天將PBMC復蘇，并進行細胞計數。按照CFSE試劑盒說明書推薦進行染色，染色結束后使用添加了IL-2、PHA的活化的RPMI1640完全培養基進行重懸。D.3.3取出培養16h～24h的人肝前體細胞，棄掉孔里培養基，加入染色、活化后的PBMC細胞共培養3~4天。D.3.4同時接種染色、活化后的PBMC細胞用作陽性對照；染色、未活化的PBMC細胞作為陰性對照；接種活化但未染色的PBMC細胞作為空白對照培養3～4天。D.3.5流式上機：將培養的細胞混勻取出于流式管中，用水平離心機（D.1.3）500×g，離心5min，棄去上清液；用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）洗滌一遍樣品，再用水平離心機（D.1.3）機500×g，離心5min，棄去上清液，用用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）重懸上機。D.3.6數據分析：根據細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞排除細胞碎片和多細胞聚團；根據根據陰性對照和空白對照圈出目的細胞的增殖信號。D.4PBMC分泌TNF-α能力檢測步驟D.4.1將人肝前體細胞接種于24孔板貼壁培養一天。T/XXXXXXX—XXXXD.4.2第二天將PBMC復蘇進行細胞計數，按照CFSE試劑盒說明書推薦進行染色。D.4.3取出培養一天的人肝前體細胞，棄掉孔里培養基，加入染色后的PBMC細胞共培養1天。D.4.4同時加入染色后的PBMC兩孔分別用作陽性對照和同型對照。D.4.5第三天加入LAC刺激3h～6h，結束后使用Fix/PermKit將PBMC進行固定、破膜，再加入抗人TNF-α抗體及其同型對照于2℃~8℃孵育30min。D.4.6流式上機：將孵育結束后的細胞混勻取出于流式管中，用水平離心機（D.1.3）機500×g，離心5min，棄去上清液；用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）洗滌一遍樣品，再用水平離心機（D.1.3）機500×g，離心5min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（D.2.2）重懸上機。D.4.7數據分析：根據細胞大小和顆粒度設門圈出目標細胞分群1，排除細胞碎片和多細胞聚團。D.4.8根據同型對照圈出目的細胞陽性區域。D.5計算結果按公式（D.1和D.2）進行計算，正值為促進率，負值為抑制率。D.5.1PBMC增殖抑制檢測計算公式式中：X——促進率/抑制率，%；Y1——供試品CFSE陽性結果，%；Y0——陽性對照CFSE陽性結果，%。D.5.2PBM