番茄抗晚疫病基因Ph-2的精細定位及克隆進展

中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所加工番茄課題組鄭崢2014年7月29日，廣西，桂林中國園藝學會番茄分會2014年會報告內容研究背景研究內容研究結果結論未來研究計劃研究背景-番茄晚疫病晚疫病（LateBlight）由卵菌綱致病疫霉【Phytophthorainfestans(Mont.)deBary】引起，主要危害全球番茄和馬鈴薯的生產我國已報道的番茄晚疫病生理小種有8個，主要分布在我國番茄主產區(qū)（楊宇紅等，2004；劉雙平等，2009）

利用含有不同抗病基因的鑒別寄主，對8個晚疫病病菌進行生理小種鑒定，T1（1-5號）、T1.2（6號）、T0（7號）和T1.4（8號）鑒別寄主

病原菌純化物編號/Numberofpurifiedisolate12345678Moneymaker（Ph-0）SSSSSSSSTs33（Ph-1）SSSSSSRSW.Va700（Ph-2）RRRR

RSRRL3708（Ph-3）RRRRRRRRLA1033（Ph-4）RRRRRRRS研究背景-我國番茄晚疫病生理小種研究背景-番茄晚疫病抗性數量抗性（QTL）：來自S.habrochaites、S.pennellii（Brouweretal.,2004；Foolad，2012）質量抗性（R）：來自S.pimpinellifolium的Ph-1、Ph-2、Ph-3、Ph-4、Ph-5基因Gene

Chrom.Ref.Ph-17Peirce,1971Ph-210Moreauetal.,1998Ph-39Chunwongseetal.,2002Ph-42Kole,2008

Ph-51；10Fooladetal.,2009

最近，項目組通過對全球性（分別來自TGRC和AVRDC）收集的441份S.pimpinellifolium材料鑒定，尚未發(fā)現新抗源研究背景-番茄晚疫病抗性QTL抗性微效且有連鎖累贅Ph-1基因已被多個新的生理小種克服目前關于Ph-4基因的公開報道比較少已證明Ph-5基因是由兩個位點控制，且抗性不如Ph-2與Ph-3的疊加后抗性Ph-2、Ph-3基因對我國的主流晚疫病生理小種具有較好的抗性Merketal.2012.研究背景-番茄晚疫病抗性Ph-3

基因已被我所克隆，并證明其具有典型的CC-NBS-LRR結構（Zhangetal.,2014）研究背景-番茄晚疫病抗性-Ph-3

Hawaii7996×WVa700醋栗番茄WVa700中的抗晚疫病基因Ph-2

屬不完全顯性，被定位在CP105與TG233之間，遺傳距離為8cM（Moreauetal.，1998）研究背景-番茄晚疫病抗性-Ph-2對Ph-2基因進行精細定位及

克隆，深入研究其抗性機制，為抗病育種及闡明番茄與晚疫病病菌的互作提供理論依據利用克隆出的番茄抗晚疫病基因Ph-2及Ph-3結合對應晚疫菌生理小種研究番茄與晚疫病菌互作機制研究目的接種晚疫病病菌蛋白組測序分析蛋白表達差異分析Ph-2基因抗性機制構建抗感池抗病WVa700與感病M82重測序數據提取DNALA3152×M82F1生理小種鑒定F2分離群體區(qū)域內候選基因分析開發(fā)分子標記對Ph-2基因進行精細定位研究內容-技術路線生理小種測序分析互作機制根據番茄抗感病材料WVa700與M82重測序（5X）獲得的數據選定CP105和TG233兩個標記之間8cM的候選區(qū)域在候選區(qū)域內共開發(fā)

6個Indel、26個

SNP和1個CAPS多態(tài)性標記將Ph-2基因定位于Indel-4和CAPS-1之間，兩標記的遺傳距離為2.0cM，物理距離為227Kb結果與分析-

Ph-2的精細定位結果與分析-Ph-2基因候選基因的預測利用HMM模型

掃描目標區(qū)域，共發(fā)現了32個完整的開放閱讀框對候選基因進行R基因功能結構域比對，發(fā)現6個ORF含有

R基因類型功能域結合

SGN（http://sol）網站上的注釋進行分析，發(fā)現只有一個基因具有完整的CC-NBS-LRR結構，命名為SL-Ph-2-RGA1利用醋栗番茄測序（ColdSpringHarborLaboratory）及重測序（我所）結果對候選基因區(qū)域進行了比對正在進行：GenomewalkingHomologybasedcloning+Map-basedcloningVIGS結果與分析-Ph-2基因候選基因的獲得結果與分析-Ph-2基因候選基因（馬鈴薯）將目標區(qū)域所對應的馬鈴薯基因組序列進行R基因預測，共預測了16個候選R基因其中一個與SL-Ph-2-RGA1基因的相似度為82.4%，染色體共線性分析后，推測為馬鈴薯抗晚疫病基因

Rpi-berRpi-berBSA10株F2抗、感材料，在接種前后混樣建池進行非標記定量蛋白質組學分析結果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學分析A抗病材料接種前B感病材料接種前C抗病材料接種后D感病材料接種后ACDBPh-2調控信號傳導途徑相關（乙烯、水楊酸、茉莉酸、赤霉素、細胞分裂原活化蛋白信號的蛋白質）受晚疫菌調控的植物基礎抗性抑制或易感蛋白相關病原菌效應因子（effector）掃描？？抗病蛋白？？通過對4組處理葉片分析表明，在4個組均檢測到的蛋白共有105種，包括能量相關、光合作用、物質代謝、蛋白合成、防御與抗脅迫、細胞壁合成以及未知的蛋白抗池和感池材料接種晚疫病病菌前后，蛋白質含量和種類都發(fā)生明顯變化

結果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學分析

AB抗病材料接種后，97種蛋白含量增加（圖A），8種蛋白含量降低和兩種蛋白含量基本沒有明顯變化（圖B）

抗病材料接種前后蛋白組變化結果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學分析

感病材料接種前后蛋白組變化感病材料接種晚疫病病菌后，17種蛋白含量增加（圖A），54種蛋白含量降低和34種蛋白含量基本沒有明顯變化（圖B）AB結果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學分析四組材料中，只有抗池材料在接種前（A組）和接種后（C組）發(fā)現大量的細胞外鈣受體，且C組是A組的5.8倍抗病材料接種后，C組中延伸因子含量是A組的3.6倍，而且抗病材料接種后延伸因子（EF-2）含量明顯高于感病材料，C組是D組的29.6倍。延伸因子（EF-2）與Ca2+發(fā)生耦合，參與植物抗性信號傳導過程。因此，鈣信號傳導通路可能參與了Ph-2基因介導的番茄晚疫病抗性PR-5蛋白是水楊酸信號傳導途徑中的關鍵基因（Limetal.,2013），抗病材料接種后，PR-5蛋白的含量增加，水楊酸信號傳導途徑參與

Ph-2基因介導的抗性，這與水楊酸介導Ph-3基因抗性結論一致結果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學分析抗病相關蛋白含量變化結果與分析-Ph-2基因/晚疫病菌互作蛋白組學分析精細定位Ph-2至2cM區(qū)域，并將側翼標記轉換為簡單的Indel和CAPS標記通過生物信息及VIGS