埃博拉出血熱檢疫技術規范26儀器和設備6.1PCR擴增儀。6.2熒光定量PCR儀。6.3水平電泳儀。6.4凝膠成像儀。6.5普通冰箱和-80℃冰箱。6.6低溫冷凍離心機(可控溫至4℃,離心速度可達12000g以上)。6.7二級生物安全柜。6.8高壓滅菌鍋。6.9微量可調移液器(2μL,10L,100L,1000L)及配套帶濾芯吸頭。7試劑和材料在檢測中使用的試劑均為分析純，試驗用水應符合GB/T6682的一級水的要求。7.4三氯甲烷。7.5異丙醇：使用前-20℃預冷。7.7溴化乙錠(EB):10mg/mL,使用濃度為05temL.7.8TagDNA酵：-20℃保存。7.9dNTPs:含dCTP、dGTP、dATPdITTP各10mmolL的混合物，-20℃保存。7.10AMV逆轉錄酶：-20℃保存。7.11瓊脂糖。7.12DNAMarker(100.-20006p)7.14上樣緩沖液。7.152x熒光PCR預混液。8檢驗程序8.1樣品采集、保存及運輸樣品的采集按照GB/T18088執行。樣品溫度應保持在0℃以下。樣品的保存和運輸的生物安全要求參照《病原微生物實驗室生物安全管理條例》的有關要求執行8.2實驗室檢測組織樣品先去除包膜和其他結緒組織，選取內部實質部分，置研缽中，加入石英砂充分研磨，然后按照1:5比例加入0.1mol/LPBS(pH7.6-pH7.8)。4℃浸泡過夜或者-20℃反復凍融2次，每次30min,4℃條件下以8000g離心5min,取上清進行后續操作。液體樣品如血液、尿液、唾液不必經過研磨或凍融處理，直接進行后續操作。不能立即進行檢測3時，樣本凍存于-70℃左右超低溫冰箱備用。8.2.2病毒核酸提取取滅菌的1.5mL離心管，做好標識。每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μL,再加人200pL三氧甲烷，緊蓋離心管，混勻器上振蕩混勻15s后室溫靜置5min,于4℃12000g離心15min。取新的滅菌的1.5mL離心管，加入-20℃預冷400L異丙醇，吸取離心后將各管中的上清液轉移至預冷的異丙醇中，避免吸出中間層，顱倒混勻。于4℃12000g離心15min,棄上清，倒置于吸水紙上，瀝干液體，加入600μL75%預冷乙醇，顛倒洗滌。于4℃12000g離心10min,棄上清，倒置于吸水紙上，瀝干液體，室溫干燥5min~10min。加入15μL~20μLDEPC水，溶解管底的RNA,5000g離心5s,冰上保存備用，若長期保存應放8.2.2.2核酸提取等效方法埃博拉病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取試劑及方法，如采用商品化試劑盒或自動化核酸抽提儀和配套核酸抽提試劑進行核酸抽提。8.2.3陽性對照、陰性對照和空白對照檢測過程中分別設置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照為根據埃博拉病毒核苷酸序列通過基因合成、載體構建和體外轉錄合成的RNA.以及包含埃博拉病毒NP或GP基因的假病毒，陰性對照可選擇其他類病毒的核酸樣本，空自對照為無菌水作為擴增模板。8.2.4RT-PCR檢測方法8.2.4.1檢測引物上游引物NPF75-GAGTATGCTCCTTTCGC-3'下游引物NPR:5'-TTIGGTATTCGCCGTAG-3'GP基因擴增引物：上游引物GPF:5'-GCAACTGCGAAGAGGAG-3'下游引物GPR:5'-CACGGGTGTATTATGGCT-3'引物工作濃度均為10μmoVL,配制后于-20℃左右保存。擴增目的基因片段長度分別為NP基因538bp、GP基因396bp。RT-PCR擴增產物參考序列見附錄C。在冰盒上配制20L逆轉錄反應體系。在0.2mL離心管中依次加入：DEPC處理水6.5μL,隨機引物(25μmol/L)2μL,dNTPs照5μL?；靹颍虝弘x心，65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻。然后在上述反應管中加人：5x逆轉錄酶緩沖液4μL,RNA酶抑制劑(40U/pL)0.5μL,AMV逆轉錄酶(200UpL)1μL。緩慢混勻。按以下程序進行cDNA合成：30℃10min,42℃45min;95℃5min滅活逆轉錄酶，冰上冷卻。合成的cDNA可立即用于PCR擴增，或保存于-20℃備用?？刹捎猛饶孓D錄效率的商品化逆轉錄試劑盒。4可采用同等逆轉錄效率的商品化一步法RT-PCR試劑盒。在PCR反應管中依次加人：去離子水33μL,10×TagDNA聚合酶緩沖液(不含Mg)5μLTagDNA聚合酶(5UHL正，合成的cDNA5μL?；靹颍糜赑CR儀中。按以下程序進行PCR擴增：95℃5min;(95℃1min,55℃1min,72℃1min)35個循環；72℃10min。8.2.4.4瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖凝膠，加入適量的電泳核酸染料。分別取5μLPCR擴增產物與1pL6×載樣緩沖液混勻后加入樣品孔，使用DL2000DNA分子量標準物作為電泳參照。置于水平電泳儀上5V/cm電泳，當載樣緩沖液中溴酚藍指示劑色帶遷移至瓊脂糖凝膠的2/3處時停止電泳，用凝膠成像儀觀察擴增結果。8.2.4.5結果判定用凝膠成像系統分析，NP基因陽性對照擴增出一條大小為538bp的特異性條帶，GP基因陽性對照擴增出一條大小為396bp的特異性條帶，陰性對照和空白對照無特異性條帶；在陰性對照和陽性對照成立的情況下，如被檢樣品無條帶，則結果為陰性，如被檢樣品有條帶，且與陽性對照一致大小，即判定為埃博拉病毒核酸陽性。對于檢測陽性的樣本可切下電泳分析的目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化(按其說明書進行),進行測序確認病毒基因序列。8.2.5實時熒光RT-PCR方法8.2.5.1引物和探針用于檢測NP基因的弓物和探針：上游引物NP-FQ:S'-TTCCCTTTCCAGGACCCATC-3'下游引物NP-RQ:5-TCGGGAATCGTCGTATCCTG-3°探針NP-P:5'-FAM-CCTGGCCATCAAGATGATGATCCGAC用于檢測GP基因的引物和探針：上游引物GP-FQ:5'-AGCTGTATCAAACCGACCCA-3°下游引物GP-RQ:5'-CTCGTGGAGATTGTGGCAAG-3'探針GP-P:5'-FAM-CGCGCCGGACTCTGACCACT-BHQi-3'引物和探針的工作濃度均為10μmol/L,配制后于-20℃左右保存。實時熒光RT-PCR擴增產物參考序列見附錄D。8.2.5.3實時熒光PCR采用20μL反應體系：熒光PCR預混液(2x)10μL,探針0.6L,上、下游引物各0.4μL,cDNA模板1L,RNasefreeH?O補足20pL。反應程序：95℃預變性5min,95℃變性10s,58℃530s,40個循環。每個循環結束時進行熒光信號的采集。檢測結束后，根據收集的熒光曲線和C值判定結果。8.2.5.4結果判定及報告本方法檢驗結果判定及報告如下?！獧z測樣本有明顯的熒光增幅曲線，且C值≤35時，判為陽性，報告“檢出埃博拉病毒核酸(實時熒光RT-PCR法?！獧z測樣本熒光增幅曲線的C值介于35和40之間時，應重復進行試驗，若重新檢測的Ct值仍介于35和40之間。且曲線有明顯的對數增長期，判為陽性，報告“檢出埃博拉病毒核酸(實時熒光RT-PCR法；否則判為陰性，報告“未檢出埃博拉病毒核酸(實時熒光RT-PCR法”?！獧z測樣本熒光增幅曲線的C值介于40和45之間時，可采用膜過濾法濃縮核酸樣本，再重新進行實時熒光RT-PCR檢測。若重新檢測的Ct值有明顯減少趨勢。且曲線有明顯的對數增長期。判為陽性，報告“檢出埃博拉病毒核酸(實時熒光RT-PCR法)。此類樣本建議采用其他方法進一步驗證；否則判為陰性，報告“未檢出埃博拉病毒核酸(實時熒光RT-PCR法”。埃博拉出血熱埃博拉出血熱(Eholahaemorhagicfever,EHF)是一種人獸共患病，是由絲狀病毒科的埃博拉病毒(Eholavius,EBOV)導致人和非人靈長類動物(如猩猩和猴子)發生急性感染的烈性出血性傳染病，人感染后死亡率高達50%-90%。A2傳染源及宿主動物hat),尤其是活躍在撒哈拉以南的非洲(包括幾內亞)的3類水果蝙蝠——無尾肩章果蝠(Epomopsfrangueri)、錘頭果蝠(Hypsignathusmonstosus)和小領果蝠(Myonycteristoryurta)被認為是埃博拉病毒可能的自然宿主。受病毒感染的果蝠通過直接或間接的方式與其他動物接觸來散播病毒，導致人類和非人靈長類動物如大猩猩、黑猩猩、恒河猴、獼猴的大規模流行。有研究發現在中非倉鼠和尖鼠體內檢測到埃博拉病毒核酸，標志著嚙齒類動物也有可能是儲存宿主。另外，豬和犬是至今為止確定能感染埃博拉病毒的家畜。此外，有報道來自非洲熱帶叢林中的森林玲羊和豪豬感染埃博拉出血熱情況。潛在媒介調查中，在節肢動物包括臭蟲、半翅類昆蟲等體內未檢測發現有埃博拉病毒。A.3臨床癥狀早期癥狀為起病急，突然高熱、極度乏力則烈頭痛、咽喉痛，全身肌肉和關節疼痛，可能還有寒顫和精神萎靡等。隨后可出現嚴重的度內疼痛、惡心、吐逆和瀉肚等消化系統病狀。發病4d-5d后進入極期，患者主要表現為持續高燒。全身感染中毒癥候和消化道病癥更加嚴重，并伴有不同水平的出血現象，包含口鼻、結膜，腸胃、陰道和肌膚等部位出血，也見嘔血和血尿等，多數患者可在面、頸、軀干和手臂等部位出現彌漫性紅斑樣丘疹，這是區別于其他類似疾病的癥狀。特重者可出現意識窒礙(如譫妄、嗒順)、休克、多器官衰竭及致死性并發癥等。A.4病理變化埃博拉