3細胞工程(cellengineering)

細胞工程是按照一定的設計方案，通過在細胞、亞細胞或組織水平上進行實驗操作，獲得重構的細胞、組織、器官以及個體，創造優良品種和產品的生物工程。

×緩沖室操作室操作人員房間設備實驗材料3.1細胞工程的基本操作技術無菌操作技術細胞和組織培養技術

材料獲?。簞游?、植物的組織---消毒

培養基（培養液）：滿足細胞生長的營養需求

其他培養條件：溫度、濕度、光照、O2及CO2等

細胞融合技術（雜交）---遺傳物質的重組

（1）制備原生質體

（2）誘導細胞融合（誘導方法）

（3）篩選雜合細胞

3.3動物細胞工程動物細胞培養細胞融合與單克隆抗體細胞核移植與胚胎克隆干細胞工程學習要求掌握動物細胞培養方法了解動物細胞融合與單克隆抗體技術了解細胞核移植與胚胎克隆技術了解干細胞工程的基本原理及重大意義細胞系（cellline)

原代培養的細胞經首次傳代以后的細胞，包括有限細胞系和連續細胞系（永生性細胞）。細胞株（cellstrain)

通過選擇或克隆從原代細胞或細胞系中獲得的具有特定性質或標志的細胞群，由單個細胞增殖形成。解離液動物細胞在離體條件下的生長和增殖，操作環節包括：原代培養(primaryculture)傳代培養(subculture)細胞的凍存與復蘇

3.3.1動物細胞培養（cellculture)Y原代培養動物表面消毒取組織塊

原代培養(primaryculture)

：酶解離心，收集細胞，培養切割培養傳代培養(subculture)：懸浮細胞：移取一部分細胞到新的培養基中。貼壁細胞：酶解法（0.25%胰酶）消化細胞，收集（離心）細胞，接種于新的培養基中。細胞的凍存操作簡便，保存期長液氮保存法：細胞凍存液：基礎培養液+血清+DMSO（甘油）梯度降溫：-4℃,30min-20℃，2h-80℃，過夜液氮

污染源治理方法

細菌青霉素（200U/mL),鏈霉素（200μg/mL)

真菌制霉菌素（100U/mL)

支原體卡那霉素（100μg/mL)

細胞、組織培養污染的防治解離液3.2.2動物細胞融合與單克隆抗體細胞融合：又稱細胞雜交，在體外將不同種生物或同種生物的不同類型的細胞通過無性方式融合成雜合細胞的技術，可以重新組合兩親本細胞的遺傳信息。

動物細胞融合的誘導方法（1）病毒誘導

1958年日本岡田善雄發現滅活的仙臺病毒誘導艾氏腹水瘤細胞融合成多核細胞。（2）化學誘導---聚乙二醇（PEG）1974年，高國楠用PEG成功誘導植物細胞原生質體融合；1975年，Pontecorvo用PEG法融合動物細胞取得成功。培養液洗滌離心篩選鑒定雙親本細胞

PEGpH7.4-8.0融合細胞團再生雜合細胞搖勻，靜置動物細胞融合的誘導方法(3)物理誘導---電激法將雙親本細胞溶液混合（1:1），施以交流電，細胞在電場力作用下排列成串珠狀，瞬間施加高電脈沖，細胞膜被擊穿發生融合。

淋巴細胞雜交瘤產生單克隆抗體

1975年Milstein（阿根廷）和Konler（英國）將小鼠骨髓瘤細胞與羊紅細胞免疫過的小鼠淋巴細胞融合，得到能無限增殖又能產生特異性抗體的雜交瘤細胞。由于這一具有偉大生物學意義的工作，他們獲得1984年諾貝爾醫學及生理學獎。理論基礎每種B淋巴細胞產生一種針對特異性抗原決定簇的抗體，B淋巴細胞在體外不能無限增殖；

細胞融合

腫瘤細胞在體外可以無限增殖單抗隆抗體制備過程將B淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合（PEG）雜合細胞培養及雜交瘤細胞篩選特異性抗原免疫實驗動物HAT培養液篩選雜合細胞單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的應用（1）檢驗醫學診斷試劑

病原微生物抗原、腫瘤抗原、免疫細胞抗及細胞因子檢測（2）腫瘤的導向治療（3）蛋白質的提純解離液3.2.3細胞核移植與動物克?。?）異種細胞核質關系研究（2）動物克隆——細胞核遺傳全能性

早期胚胎細胞核移植克隆哺乳動物

1952年，Briggs

將豹紋蛙的囊胚細胞核移入去核的同種蛙卵中，部分異核卵發育成個體。此后，多種哺乳動物通過此技術被成功克隆。

成熟的體細胞核移植克隆哺乳動物

1996年7月5日，Dr.Wilmut的團隊在英國愛丁堡市羅斯林研究所成功用體細胞克隆出Dolly羊，發表在1997年2月27日的Nature上。體細胞克隆哺乳動物基本途徑取出體細胞核未受精卵去核

異核卵早期胚胎

化學或電激誘導融合

產下幼體假孕狀態植入代孕母體子宮中

體外發育2004年2月15日，美國愛達荷大學的研究人員在西雅圖的美國科學年會上展示三頭克隆騾子世界首例成年體細胞克隆水牛2005年3月17日在廣西大學“863計劃”良種牛南方繁殖中心誕生2005年4月24日韓國科學家培育出首只克隆狗“史納皮”（snuppy）經中國農業大學李寧教授領導的課題組一年多的科技攻關，2005年8月5日，我國第一頭體細胞克隆豬終于在河北省三河成功誕生

2005年12月8日中國科學院動物研究所用山羊克隆的一只亞洲黃羊(左)與普通山羊一起在山東臨沂亮相---異種克隆

世界冠軍賽馬“斯卡普”被克隆成功，產下小馬駒“克萊頓”中國首例綠色熒光蛋白轉基因克隆豬問世哺乳動物克隆存在的問題

流產率高；難產率高；畸形率高；圍產期死亡率高；幼年死亡率高；解離液3.2.4干細胞工程干細胞（stemcell）是動物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我復制和分化潛能的原始細胞，是重建、修復組織或器官的理想的種子細胞。1958年，Stevens在小鼠畸胎瘤中首次發現胚胎干細胞，1970年，Evans分離得到小鼠胚胎干細胞，1997年，人胚胎干細胞首次被培養成功培養，1999年，Goodell等分離出小鼠肌肉干細胞，近年陸續分離出多種成體干細胞。根據其發育階段分為胚胎干細胞（embryonicstemcell）和成體干細胞。胚胎干細胞：哺乳動物囊胚期內細胞團的細胞；成體干細胞：神經干細胞、造血干細胞、骨髓間充質干細胞、表皮干細胞等、臍帶血干細胞等。根據分化潛能的大小分為三類：

全能性干細胞，胚胎干細胞；

多能性干細胞，如骨髓造血干細胞；

專能干細胞，如上皮基底層干細胞和肌肉中的成肌細胞。干細胞研究“三步曲”獲得干細胞系;建立干細胞誘導分化模型;將上述干細胞或干細胞培育體系植入動物或人的相應器官或組織，考察其效果。誘導多能干細胞

（inducedpluripotent

stemcells）

誘導多潛能性干細胞(iPSC)是由體細胞誘導而成的干細胞，具有和胚胎干細胞類似的發育多潛能性，能夠像胚胎干細胞一樣進行分化。CombinationofGene-TherapyandCell-Therapy干細胞治療的優點：低毒性（或無毒性），一次治療有效；不需要完全了解疾病發病的確切機理；用自身干細胞移植，可避免產生免疫排斥反應。

干細胞的應用干細胞生物學研究與應用幾乎涉及所有生命科學和生物醫藥學領域。除了在細胞治療、組織器官移植、基因治療具重要意義外，還將在新基因發現與基因功能分析、發育生物學研究、新藥開發與藥效以及毒性評估等領域產生極其重要的影響。1999年12月，美國Science雜志將人類干細胞研究評為年度世界十大科學研究之首；2000年再度被該雜志評為年度世界十大科學之一。2006年日本京都大學

山中伸彌（ShinyaYamanaka）領導的實驗室在世界著名學術雜志《cell》上率先報道了iPSC的研究，2012年，JohnB.Gurdon與ShinyaYamanaka因此獲得諾貝爾生理學和醫學獎。小結：動物細胞工程

通過本部分知識的學習，使大家了解動物細胞工程方面幾個具有重大意義的技術：利用淋巴細胞雜交瘤生產單抗隆抗體；利用體細胞克隆哺乳動物；干細胞工程技術，從而認識到這些技術對人類發展的光明前景?；卮饐栴}：

1.如何獲得能在體外大量生長、分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞？2.開展干細胞研究對人類有什么積極的意義？3.2植物細胞工程植物組織培養植物細胞培養和次生代謝物生產原生質體制備與細胞融合單倍體植物的誘發與利用學習要求學習掌握植物細胞、組織的培養方法了解原生質體制備與細胞融合技術了解單倍體植物育種的優勢3.2.1植物組織培養

植物組織培養的基本過程芽、根離體的植物器官、組織去分化愈傷組織再分化植物體培養胚狀體高濃度生長素消毒注意的問題1.選擇外植體應考慮哪些因素？

大小適宜；優先選擇胚和幼嫩組織器官2.對外植體進行除菌3.培養基的配制：基本成分+微量無機物+微量有機物4.誘導去分化時，采用固體培養基，添加高濃度生長素3.2.2植物細胞培養和次生代謝物生產植物細胞培養罐氨基酸、核酸、蛋白質、碳水化合物、脂類、維生素、有機酸抗白血病藥、抗腫瘤藥、抗病毒藥、抗微生物藥、酶抑制劑、奎寧、阿司匹林色素、香料、甜味劑、鴉片、殺蟲劑、激素、強心苷、核苷酸橡膠、可卡因從植物培養細胞中獲得的各類物質

產量物種天然產物細胞培養原植物

橘葉雞眼藤蒽醌900μg/g干重110μg/g干重決明蒽醌鮮重的0.334%種子干重的0.21%

長春花蛇根堿干重的1.3%干重的0.26%

三角葉薯蕷薯蕷皂苷26mg/g干重20mg/g干塊根人參人參皂角苷鮮重的0.38%鮮重的0.3%~3.3%

煙草煙堿干重的3.4%干重的2%~5%

煙草泛醌0.5mg/g干重16mg/g干葉大紅罌粟蒂巴因130mg/g干重140mg/g干葉細胞培養和原植物的天然產物量的比較

優點：結構簡單，易操作；細胞增殖快缺點：次生代謝物生產效率低封閉式懸浮培養系統

植物細胞大規模培養系統立柱培養系統平床培養系統固定化培養系統優點：細胞生長慢，利于分化和組織化，收貨更多的次級代謝物3.2.3植物原生質體制備與融合原生質體的制備原生質體的融合雜合體的鑒別與篩選名詞：原生質體（protoplast):去除全部細胞壁的細胞原生質球（球狀體，spheroplast):殘存少量細胞壁的原生質體1.原生質體的制備原生質體的制備過程：（1）取材、除菌

：外植體選用生長旺盛的組織器官（2）酶解：復合纖維素酶；（3）分離：200-400目過濾；低速離心法；（4）離心洗滌：原生質體培養液（5）鑒定：鏡下觀察呈圓形歷史：

1937年，Michel率先嘗試細胞融合試驗；1960年，Prof.Cocking利用真菌纖維素酶成功制備出番茄幼根細胞原生質體。2.原生質體的融合（1）化學法誘導融合（1974-1977年，華人高國楠建立并完善）培養液洗滌離心篩選鑒定雙親本原生質體PEG高鈣高pH原生質體團再生雜合原生質體（2）物理法誘導融合---電激法

雙親本原生質體1:1混合，施