流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用2012.11婁全博流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用流式細胞術（FlowCytometry，FCM）流式細胞術是應用流式細胞儀對懸浮液中的細胞或細胞器進行快速測量和多參數檢測的細胞分析技術，是上世紀70年代在單細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞理化特性，諸如大小、DNA、RNA、蛋白質、抗原等進行快速測量并分類收集的高科技技術。它綜合了激光技術，計算機技術，流體力學，細胞化學，單克隆抗體，熒光化學，分子生物學等各門學科，在對細胞群體的亞群進行定量分析時，具有其它手段無法比擬的優越性。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用臨床型光路調節系統固定，自動化程度高，操作簡便，易學易掌握流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用科研型

同時配備多種波長的激光器，并可快速的將感興趣的細胞分選到特定的培養孔上，適用于廣泛且靈活的科研應用

流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用流式細胞儀基本組成結構1.流動室和液流系統（流動室和液流驅動系統）2.光學系統（激光光源和光束形成、收集系統）3.數據處理系統流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用噴嘴激光液鞘流動室內充滿了鞘液，鞘液的作用是將樣品流環包，鞘液流是一種穩定的液體流動，鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統運行中流速是不變的，樣品流在鞘液的環包下形成流體力學聚焦，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，并且保證每個細胞通過激光照射區的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用流式細胞儀光信號流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用1、散射光信號：FSC和SSC

前向散射光信號(FSC)：與激光束方向同軸的稱前向散射光信號，反映細胞大小激光器激光器接收器大顆粒小顆粒流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用側向散射光信號(SSC)：與激光束方向垂直的稱為側向散射光信號，主要反映了細胞的內部結構，內部結構越復雜，SSC信號越強，反映細胞內顆粒性。激光器接收器流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用散射光信號不依賴任何樣品的制備技術（如染色），因此稱為細胞的物理參數。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現多參數分析；可檢測的樣本種類多樣(單細胞懸濁液)(1)外周血，骨髓，細針穿刺液，洗脫液，實體組織，培養細胞(2)血清、血漿、細胞裂解液流式細胞儀特點及檢測標本流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用樣品制備1、新鮮或冰凍實體組織：酶消化法、機械法、化學試劑處理法等。剪碎法：取新鮮或冰凍（浸泡于生理鹽水中）實體組織0.5cm3，眼科手術剪剪碎，加入生理鹽水，300目尼龍膜過濾，200ml離心5min，生理鹽水洗滌二次。注意事項：由于各種實體組織成份、特性各不相同，對不同的實體組織必須采用不同的單細胞分散方法，才能使單細胞產量高，細胞損傷小。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用2、石蠟包埋組織：擴大了FCM分析應用范圍，并可以對大量臨床隨訪病例資料進行重新研究與利用。標體制備：①二甲苯脫蠟法②組織清潔劑脫蠟法③甲酸雙氧水處理法。注意事項：①脫蠟完全：檢驗方法加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，即可視為脫凈，反之則沒有脫凈。②掌握消化時間，避免細胞核消化掉。③切片薄厚適宜，過薄組織碎片多，過厚不宜脫蠟。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用3、骨髓、血液及體液：去除紅細胞及濃縮有核細胞。①骨髓及血液：淋巴細胞分離液②體液：一般需經300ml離心5min，PBS洗滌二次。如體液中紅細胞太多，可用溶血素去除紅細胞。注意事項：①每次同時制備對照血液淋巴細胞標本，作為二倍體細胞外參標準。②視標本中有核細胞濃度的高低進行調整，一般細胞濃度調至5~10X109/L。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用熒光染色PBS洗細胞1~2次加（熒光）單抗，暗處孵育15~30分鐘PBS洗細胞一次過300目尼龍網上機檢測流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用通過DNA檢測進行細胞周期分析細胞周期：G0、G1、S、G2、M細胞周期中DNA含量：G0/G1--2C（二倍體）S期--2C→4C、G2/M-4C（四倍體）流式細胞周期與DNA倍體分析的基本原理流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用4CM期：

細胞分裂期4CG2期：DNA合成后期2C-4CS期：

DNA合成期2CG1期：DNA合成前期2CG0期：DNA合成靜止期DNA倍體細胞周期：流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用FCM分析細胞周期的基本方法DNA熒光染料特異性與細胞DNA結合DNA含量的多少與熒光染料的結合量成正比，熒光強度與DNA所吸收熒光分子多少成正比。最常用的熒光染料：碘化丙啶（PI）流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用DNA含量的表示細胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指數（DNAindex，DI)表示相對含量，一個正常的二倍體細胞峰，其G0/G1期細胞DNA含量為2C，DI值為1.0。DI=（樣本G0/G1期細胞峰平均熒光道數）/（正常二倍體標準細胞G0/G1期細胞峰平均熒光道數）DI=樣本G0/G1期細胞峰平均熒光道數正常二倍體標準細胞G0/G1期細胞峰平均熒光道數流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用DNA倍體的判定標準二倍體的DI為1.0，四倍體的DI為2.0。變異系數（CV）：標準細胞CV≤3%，新鮮組織標本CV≤5%。對于一個正常人體的二倍體細胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M細胞占10-15%以下。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用以二倍體參考細胞G0/G1期細胞DNA含量定為2C值DI=1.0，基于標準二倍體細胞的CV在5%以下，即判定標準：DNA二倍體=2C+2CV，DNA異倍體不等于2C+2CV。1.DI=1.0±0.1(0.9~1.10)為二倍體。2.DI=1.0±0.15(0.85~1.15)為近二倍體。3.DI=2.0±0.1(1.90~2.10)為四倍體。4.DI>2.10為多倍體5.其余DI均為異倍體。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用FCM分析在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的應用DNA異倍體的出現是癌變的一個重要標志，有助于癌變的早期診斷。淋巴瘤在病理形態學還不能作出診斷前，FCM倍體分析可以提供準確的診斷信息。DNA非整倍體的交界瘤應按惡性腫瘤對待。形態學表現為良性的腫瘤出現非整倍體提示有惡變的可能。DI可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用FCM分析DNA含量和DNA倍體的預后意義通常認為DNA含量高，非整倍體的腫瘤惡性程度高，預后差，二倍體或近二倍體腫瘤預后好。除DI及倍體外，反映腫瘤細胞增殖狀態的S期細胞比例也被作為判斷預后的指標。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用FCM分析在腫瘤脫落細胞學檢查中的應用(1)發現DNA非整倍體細胞峰診斷為癌。(2)如無明顯的非整倍體細胞峰，但有一個突出的四倍體細胞峰和>15%的超二倍體細胞（S期細胞），并伴有G0/G1峰的CV>9%，診斷為癌。(3)無明顯的非整倍體細胞峰，但G0/G1峰CV值增大，并伴有>10%~15%超二倍體細胞和一個突出的四倍體峰，診斷為可疑癌。流式細胞術原理及與腫瘤學的相關應用為治療方案和藥理學研究提供依據

不同類型的腫瘤對化療藥物的敏感性不同。可利用FCM進行細胞周期分析，適當選擇周期特異性藥物或非周期特異性藥物。MDR是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白（P-gp）親脂化合物，包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。從人淋巴細胞排除熒光染料與細胞